饮用水中大肠杆菌快速检测方法

具体实施方式

以下以重庆市市政管网的15个水样为例，详细说明本方法的具体实施过程：

第一步：水样中微生物的提取：

1 我国的饮用水水质指标规定，饮用水中大肠菌群的标准为＜1个/100mL，因此取水样100mL。

2 滤膜和滤器的灭菌和安装。滤器用高压蒸汽121℃灭菌20min。用无菌的镊子夹取已经灭菌的0.22μm滤膜的边缘，粗糙面向上，贴放在灭菌滤床上。

3 将100mL水样注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在负50KPa下抽滤。

4 用酒精棉球擦拭剪刀，用无菌镊子夹取滤膜边缘，将滤膜用剪刀剪成宽0.5mm的细条，放入装有2.5mL无菌水的EP管中，轻轻摇动EP管，洗涤滤膜。

5 将EP管15000r/m离心5分钟，弃上清，备用。

第二步：提取水样中微生物的基因组DNA：

微生物基因组DNA的提取方法：

1 药品：EDTA、I mol/L Tris-Cl、TE缓冲液(100m mol/L Tris-Cl，10m mol/L EDTA，4℃贮存)、10％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、5mol/L NaCl、LB(Luria-Bertani)培养基(4℃贮存)，上述试剂均需高压灭菌；20mg/mL蛋白酶K(分成单次使用的小份贮存于-20℃)、24∶1氯仿/异戊醇、25∶24∶1酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、70％乙醇

2 设备和器材：PTC-100型PCR仪、PB-20型pH计、ME 215S电子天平、TGL-15G高速台式离心机、生化培养箱1台、OD260和OD280紫外分光光度计1台、冰箱1台、水浴锅1台、高压消毒锅1台、1000μL可调移液枪1个、200μL可调移液枪1个、10μL可调移液枪1个、10μL、200μL和5000μL移液枪头若干、培养皿20个、一次性塑胶手套若干、EP管及PCR管若干、20L酸缸1个

3 器皿处理方法：

所有的玻璃器皿在使用前，均用重铬酸钾洗液浸泡6小时以上，然后依次用自来水、蒸馏水、超纯水冲洗干净，晾干，然后消毒备用。EP管及PCR管等为一次性使用，高压消毒后备用。

4 操作步骤：

取一株大肠杆菌在LB培养基中培养至饱和状态，取1.0mL的培养物于EP管中，12000转/min离心2min。

弃上清，沉淀物加入567μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30μL10％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育45min～1h。

加入等600μL的氯仿/异戊醇，混匀，12000转/min离心5分钟，将上清液转入一个新EP管中。

加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000转/min离心5分钟，将上清液转入一个新EP管中。

加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，5000转/min离心2分钟。

弃上清，沉淀物用1mL的70％乙醇洗涤，晾干。

将沉淀重溶于100μL的TE缓冲液，摇匀。

用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA模板的OD值，从而计算其DNA浓度。计算方法为：

DNA浓度(μg/μL)＝OD值260nm×样品稀释倍数×50/1000

将基因组DNA模板做好标记，4℃条件下贮存，备用。

按上述方法提取微生物的基因组DNA作为模板DNA，进行PCR扩增。

第三步：PCR扩增：

    50μL反应体系：

    10×PCR缓冲液                           5μL

    Tag酶                 2U/μL            1μL

    MgCl2(25mM)                             5μL

    dNTP                  (2.5mM)           5μL

    ddH20                                   29μL

    上游引物              10μM             2μL

    上游引物              10μM             2μL

    模板DNA               1.5μg/μL        1μL

本方法应用分子生物学中的聚合酶链式反应，反应引物：

    上游引物：5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’

    下游引物：5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’

第三步：产物观察：

1 所需的试剂和器材：DNA分子量标准(DNA marker：800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp)、琼脂糖粉、溴化乙锭(10mg/mL)溶液、Tris、EDTA、冰乙酸、电脑多用电泳仪、胶模、微波炉、1000mL玻璃瓶2个、500mL磨口三角烧瓶1个、1000mL量筒1个、一次性手套若干；

2 凝胶的准备。先配置1.5％琼脂糖溶液，在微波炉中加热，使其充分溶解，不要有颗粒物质，以免影响产物的观察。按2.0μL溴化乙锭溶液：15mL琼脂糖溶液的比例向琼脂糖溶液中加入溴化乙锭。溴化乙锭的作用是使扩增的DNA染色，以便在紫外灯下观察。溴化乙锭有剧毒，因此所有接触溴化乙锭的操作必须带手套。

3 TAE电泳液的配置。称量4.84g Tris、2mL0.5mol/LEDTA、1.14mL冰乙酸，定容到1000mL，一般需配置2000mL电泳液。

4 倒胶。将配置好的琼脂糖溶液倒入胶板中，待其凝固后，放入电泳槽中。

5 电泳。将扩增好的PCR产物与缓冲液按1∶1的比例混合，加入到凝胶加样孔中，同时加入DNA分子量标准(Marker，试剂盒中自带)，接通电源，设定电压和电流，开始电泳。

6 观察。将扩增产物在紫外光下观察，拍摄图片。

本申请人利用本发明方法，共检测了15个水样，水样2-8取自自来水龙头水；水样9-12取自市政二次管网贮水池中的贮存水，贮水时间约为24小时；水样13-15取自水厂的清水池。各水样大肠杆菌PCR法的检测结果如图1和图2所示，图1和图2表明，用PCR法检测饮用水的大肠杆菌，水样2、5-8、9-12大肠杆菌的检测结果均为阳性，水样3-4、13-15大肠杆菌的检测结果为阴性。