一种用于边远山区人类血样的DNA提取试剂和方法

技术领域：

本发明涉及一种用于边远山区人类血样的DNA提取的试剂和方法，属生物技术领域。

背景技术：

21世纪是生命科学的世纪，基因研究则是该领域的前沿。在基因研究中，珍稀特有的遗传资源的抢先保护与利用是抢占基因大战的制高点，具有十分重要的战略意义。中国拥有56个民族和一些未识别群体，是世界上人类遗传多样性最丰富的地区之一，而云南却拥有中国最为丰富的人类遗传资源，少数民族25种，其中15个特有民族，加之地理环境十分特殊，又由于交通落后闭塞，各民族之间长期隔离便形成了云南民族的遗传多样性及每个民族遗传背景单一性的显著特点。这些为研究人类群体遗传和医学遗传提供了不可多得的珍贵遗传资源。特别是同一民族不同地区某些疾病发病率和疾病特征上的差异是研究遗传病基因的一条非常有价值的技术路线。同时也是研究环境对基因作用的理想人群，对进一步研究基因的结构与功能具有重要价值。然而，随着经济的迅速发展、交通条件的改善、生活方式的变迁、婚姻观念的更新，这一宝贵资源正面临迅速消失的危险，尽快对这一宝贵遗传资源进行保护利用已刻不容缓。加强中国人群基因资源的保护和利用是实施可持续发展的国家战略的需要。

提取和保存隔离人群的血样基因组DNA是上述工作的基础，常规的血样DNA提取保存方法(《分子克隆》中的几种标准方法)都需要较为严格的实验室条件，如必须有冰冻离心机、水浴锅、冰箱等体积较大的设备才能完成提取和保存任务，而中国目前少数民族隔离人群居住地大多位于远离公路的大山深处。采集血样往往需要在野外非实验室条件下连续工作几天甚至几周。携带这些大型设备翻山越岭进入不通公路的山区采集血样标本几乎是不可能的。因此发展一种只需个别小型便携仪器、常温下进行血样采集、常温下较长时间保存标本的方法是至关重要的。

发明内容：

本发明是通过改进常规血样DNA提取过程中冷冻离心去除红细胞的过程，代之以常温下加入红细胞裂解液，常温下低速短时间离心去除红细胞，再将白细胞裂解液加入含有DNA的白细胞后，常温下保存这种混合物最长可达4周，待收集任务完成后，在各地收集的这种混合物可以一并带回实验室用NaCl抽提DNA后进入常规流程。这样，实现了仅需简单的小型台式离心机一种设备就可在常温下完成血样的采集、前期处理并较长时间保存中间样品的方法。

本发明是这样实现的：

本发明的试剂包括DNA保存液、蛋白酶K，ACD抗凝剂(acidic citratedextrose)、红细胞裂解液(RCLB，red cell lysis buffer)、白细胞裂解液(WCLB，white cell lysis buffer)；其中：

ACD抗凝剂为：柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，加水至1000ml，灭菌后备用；

红细胞裂解液(RCLB，red cell lysis buffer)为：1mM NH₄HCO₃(碳酸氢氨)0.079g和115mM NH₄Cl(氯化铵)6.15g，加水至1000ml，灭菌后备用；

白细胞裂解液(WCLB，white cell lysis buffer)为：100MmTris-Cl(三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸)、其PH为7.6，40mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、其PH为8.0，50mM NaCl(氯化钠)，0.2％SDS(十二烷基磺酸钠)和0.05％Sodium azide(叠氮化钠)，加水至1000ml，SDS在灭菌后加入。

DNA保存液：1×TE

蛋白酶K(德国Merck KgaA公司)

本方法包括在非实验室和常温条件下对所采集血样进行初步处理和保存、和在实验室条件下将收集保存的样品集中提取、纯化后得到DNA的步骤。具体如下：

NaCl抽提DNA步骤：

1、在抽取的5ml静脉血液中加入0.8ml ACD抗凝剂并摇匀，并将样本放置于阴凉处待用；

2、将置于阴凉处的血液转到15ml的离心管中，加入RCLB 13ml-14ml，轻摇10Min；随即在2000rpm的速度下离心5Min，然后弃上清，

3、加入RCLB 13ml-14ml，轻摇10Min；2000rpm的速度下离心5Min，弃上清，再加入RCLB 13ml-14ml，轻摇10Min；2000rpm的速度下离心5Min，弃上清；

4、加入1.8ml WCLB，用移液枪将白细胞沉淀和DNA混合物吹打均匀；

5、将混合均匀的白细胞和DNA混合物移到冻存管中，这样可以在室温下保存四个星期；

6、将白细胞和DNA混合物分装到1.5ml的离心管中，每600ul的白细胞混合物需加入5ul 20mg/ml的蛋白酶K，摇均匀后放到50℃的水浴中消化8小时；

7、消化后每个管中加入300ul NaCl，轻摇10Min分钟，12000rpm离心5Min；

8、将上清液分装到1.5ml的离心管中，再加入1.2ml冰冻的无水乙醇，轻微摇均匀后放到-20℃下10Min；

9、12000rpm下离心5Min，弃上清；

10、用1ml 70％7醇洗盐，在干燥的DNA中加入100ul-200ul的1×TE；

11、加入TE后溶解1-2个小时就可以放到冰箱中保存或标化。

酚-氯仿抽提DNA的步骤：

1.1-6的步骤和饱和NaCl溶液抽提DNA的步骤是一致的；

2.在消化好的DNA样品中加入等体积的TE饱和酚，轻微摇10Min分钟，12000rpm离心5Min；

3.将上清转入另一个离心管中，再加入等体积的TE饱和酚，轻微摇10Min分钟，12000rpm离心5Min；

4.将上清转入另一个离心管中，再加入等体积的TE饱和酚，轻微摇10Min分钟，12000rpm离心5Min；

5.取上清液，用等体积的氯仿抽提一次，12000rpm离心5Min；

6.将上清液分装到1.5ml的离心管中，加入1ul的3M的NaAc，再加入1.2ml冰冻的无水乙醇，轻微摇匀后放到-20℃下10Min；

7.12000rpm下离心5Min，弃上清；

8.用1ml 70％乙醇洗盐，在干燥的DNA中加入100ul-200ul的1×TE，加入

TE后溶解1-2个小时就可以放到冰箱中保存或标化。

本发明具有方法简便、成本低、效果佳、有广泛的应用领域等优点，特别适用于边远山区人类血样的DNA提取。