制备低表达血型抗原红细胞的方法及其在血型试剂质量控制中的应用

技术领域

该项发明涉及血型抗原表达水平改变的细胞。特别是，该项发明涉及到这些细胞的制备及其在血型试剂的质量控制和血液学、免疫血液学和免疫学分析的校正和确认。

背景技术

血液中心的功能是检测血液以准确判断个人的血型。对于血型的准确和精确的判断对于多项治疗是必需的，包括输血，器官移植和治疗新生儿的遗传性溶血。

例如，一名病人在接受输血前必需知道其血型。献血者和受血者的血型的错配将会产生严重的后果，甚至会导致受血者的死亡。

在输血血清学中，ABO血型分类是红细胞血型分类中最重要的一种分类方法。人的血型主要被分成四种血型：A，B，AB和O型。每种血型的红细胞分别携带A抗原，B抗原，A抗原和B抗原，既无A抗原也无B抗原。

在每个人的血液中，存在抗ABO血型抗原或红细胞中缺少的抗原的抗体。因此，A型血的人血中含有抗B抗原的抗体，B型血的人血中含有抗A抗原的抗体，O型血的人血中含有抗A抗原和B抗原的抗体，AB型血的人血中既无抗A抗原的抗体也无抗B抗原的抗体。

在从献血者向受血者输血前，必须进行交叉配血。交叉配血是通过直接检测献血者血液对受血者血清的排异性，或者是根军献血者和受血者血型的记录进行配对。交叉配血需要保证一种血型的红细胞不能供给对该血型的抗原可以产生抗体的个人。

从历史上看，直接测试献血者红细胞对受血者血清排异性的交叉配血可以检测出微弱亚型的错误测定和试图给不相容的受体输血之间的不相容性。然而，现在直接测试的交叉配血方法在大部分血液中心很少用到，取而代之的是依赖于血型的正确记录。

在血型血清学中，红细胞的测定是采用含有针对特异抗原的抗体的试剂(正向分组)，测定血清对表达已知抗原的红细胞的排异性(反向分组)。

从20世纪80年代开始，单克隆抗体(Mabs)已经被用于血型测定试剂中。与传统的多克隆抗血清相比，单克隆试剂提供了更高的特异性，更加一致的反应性，而且大部分情况下可以提高灵敏度。

血型试剂的质量控制对于血型测定的准确性和可信性是必须的。血型试剂会在运输和储存过程中出现特异性和/或灵敏性的降低，或者是在制备和使用过程中造成的污染。

在人类中，有各种表达低水平A抗原和/或B抗原的ABO亚型。各亚型中抗原的表达水平差异很大，通常如果没有广泛的分析不易查明。大多数A型血和稀有的A亚型的抗原水平通常在以下范围内是可以被接受的(每个红细胞的抗原分子数)：

A1，8×10⁵到1.2×10⁶；

A2，1.5×10⁵到4×10⁵；

A3，4×10⁴到1.2×10⁵；

Ax，7×10³到10⁴；

Aend，2×10³到3×10³；

Am，10²到2×10³；

Ael，10²到1.5×10³.

B亚型也有相应的抗原表达水平。血型试剂应该能够检测所有临床上显著的ABO亚型。

从质量控制的目标出发，血型试剂用来测定红细胞。因此抗原水平表达低的红细胞更适合用作“质量控制细胞”(或者“标准试剂”)。

抗原表达水平低的红细胞适合用于血型测定分析，因为这种红细胞可以提供更多多克隆抗体试剂可能行为的信息。

这些红细胞可以用作质量控制细胞，用来测定试剂的变化，这种变化会导致不能检测表达低水平抗原的血液亚型的红细胞，例如：A2型的红细胞表达抗原的水平处于趋向于可接受范围的低端，从而导致血型检测的错误发生。

这些红细胞还可以用来校正和确认检测系统，以保证所有临床意义的ABO血型和亚型可以被检测。

实际上，用表达低水平A抗原和/或B抗原的天然的ABO亚型的红细胞作为质量控制细胞是很困难的。人群中具有这样表型的比例很低。例如：据估计，Ax血型的个人是A型血个人数量的0.003％。其他亚型的在人群中的比例还要低。

在那些不表达低水平抗原的细胞中，血型测定试剂是这样评价的：

测定对正常细胞的排异性。(这包括使用表达相对高水平抗原的红细胞，但这一方法缺乏灵敏度)；或

稀释血型测定试剂。(这包括稀释血型测定试剂和测定其对正常细胞的排异性)。

很多实验室仅依赖于对测定试剂供应商的质量控制。

血型测定试剂的评价普遍是采用血型测定试剂稀释的方法。然而，实验室只能以每周或每月为周期分批检测血型测定试剂。

稀释血型测定试剂和检测对正常细胞的排异性的方法并不可靠。正常细胞表达高水平的抗原，例如，每个红细胞的抗原分子数大于1.5×10⁵。当检测血型测定试剂时，这些试剂被稀释至较低的稀释度，仍可以与红细胞作用，从而产生血清阳性的结果。用外推法处理这些结果以判断正常稀释度下的抗原表达水平。

这一方法除了耗费时间这一缺点之外，该方法还作了以下的假定：血型测定试剂预测的灵敏度可以扩大至测定表达低水平抗原的红细胞。除非血型测定试剂的真正的灵敏度刚好下降到测定一些ABO亚型所需的阈值，否则试剂的变质无法被检测到。测定这种程度的试剂的变质只可能出现在更进一步耗时的稀释实验的完成。

应该指出的是，多克隆抗体试剂经常是双克隆和具有特异性能的特点。众所周知，在测定ABO亚型方面，某些克隆比其他的更好。因此，试剂经常以混合物的形式出现。当血型测定试剂被稀释时，其内在的行为特点将不起作用。

当缺少可信的血型测定试剂时，实验室常依赖于制造商的说明书和试剂的以往的表现。

当缺少可靠的血型测定试剂的质量控制时，血型测定是用变质的试剂，而且临床上显著区别的亚型可能会被错误的测定。这种试剂变质时，无法检测抗原表达水平位于可接受范围低端的亚型的红细胞。

如果用于输血，这种血液将导致或轻或重的输血反应，包括受血者可能出现死亡。

显而易见，需要一种可信的表达低水平抗原的红细胞作为质量控制细胞。血型测定试剂的可靠的质量控制和测定系统的校正以保证准确和标准化的判断血型，对于使受血者的危险性降低至最小程度是必须的。

缺乏大量输血经验的多技能的技术人员更加需要这种方法。可靠的测定可信度的增加比对于测定试剂过往表现的了解更重要。

这一发明的目的是提供用于血型测定试剂质量控制和测定系统的校正和确认的红细胞，或者是至少为公众提供一个有用的选择。

参考文献：

Davis，M.O.et al.Cloning，sequence，and expression of a blood group Bactive recombinant alpha-D-galactosidase from pinto ean(Phaseolus vulgaris).Biochem.Mol.Biol.Int.42.3(1997)：453-67.

Goldstein，J.Conversion of ABO blood groups.Transfus.Med.Rev.3(1989)：206-12

Goldstein.J.et al.Group B erythrocytes enzymatically converted togroup O survive normally in A，B，and O individuals.Science 215(1982)：168-70.

Hobbs，L.et al.The activity of a blood type B specific exoglycosidasefrom Glycine max.Clin.Chim.Acta 247.1-2(1996)：7-21.

Hoskins，L.C.et al.Blood group A immunodeterminants on human redcells differ in biologic activity and sensitivity toalpha-N-acetylgalactosaminidase.Transfusion 35(1995))：813-821.

Lenny，L.L.et al.The production of group O cells.Biotechnology 19(1991a)：75-100.

Lenny，L.L.et al.Single unit transfusions of RBC enzymaticallyconverted from group B to group O to A and O normal volunteers.Blood 77(199lb)：1383-8.

Lenny，L.L.et al.Transfusions to group O subjects of 2 units of red cellsenzymatically converted from group B to group O.Transfusion 34(1994)：209-14.

Zhu.A.et al.Characterization of recombinant alpha-galactosidase foruse in seroconversion from blood group B to O of human erythrcytes.Arch.Biochem.Biophys.327.2(1996)：324-29.

发明内容

这项发明包括以下方面：

首先，本项发明提供了表达低水平抗原的红细胞，这种红细胞抗原表达水平低，实质上等同于天然产生ABO血型和亚型的红细胞。

这种表达低水平抗原的红细胞是在体外制备的。

这种红细胞的抗原水平的降低实质上更加等同于血清学上获得的抗原表达少于5×10⁵拷贝数的红细胞，可以达到获得的抗原表达少于1×10⁵拷贝数的红细胞，最好可以达到获得的抗原表达少于2×10⁴拷贝数的红细胞。

表达低水平抗原的红细胞实质上更加等同于临床上抗原显著性的阈值。

表达低水平抗原的红细胞，在血清学结果中，其每个红细胞中的抗原数大于1×10²拷贝数，最好每个红细胞中的抗原数大于1×10³拷贝数。

免疫优势抗原红细胞的糖链连接方式，是α连接的N-乙酰半乳糖胺或α连接的半乳糖连接到H抗原。

血型抗原最好是A抗原或B抗原。

当采用凝集实验分析红细胞时，抗原表达水平的降低相应于凝集分值降低2～3个单位。

酶学上抗原水平的降低是通过使用至少一种优势免疫糖修饰酶来实现的。酶学上更好的抗原水平的降低是通过能够在1-3位连接处使键断裂的酶。酶学上更好的抗原水平的降低是通过使用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同时使用这两种酶。

低水平的抗原表达更加等同于凝集分值的降低，实质上等同于测定天然红细胞的弱表达ABO血型或亚型在凝集实验中的凝集分值。

红细胞最好是人类的红细胞。

红细胞最好处于悬浮状态。

悬浮液中最好包含细胞防腐剂，比如Celpresol^TM。

悬浮液中最好包含可以提供额外的控制指标，如临床上显著意义的抗体。

这项发明的优势体现在，该项发明提供了一种酶学上低水平抗原表达的红细胞的悬浮液，这种低水平的抗原表达实质上等同于自然存在的红细胞的表型。而且抗原表达的水平实质上更加等同于临床上抗原显著性的阈值。

红细胞被用作质量控制细胞。

悬浮液作为质量控制试剂控制血型测定试剂的质量和/或对测试系统的校正和确证。

第二方面，这项发明提供了一种制备表达低水平抗原的红细胞的方法，步骤包括：

将至少一种优势免疫的糖修饰酶与初始抗原表达水平的红细胞放入溶液中行成混合物；

将混合物置于足以减少抗原表达水平的温度下以降低抗原表达水平；

处理该悬浮液，以阻止更进一步抗原表达水平的降低。

通过周期性取样和测定混合物判断抗原表达水平的降低。

通过凝集实验检测混合物的抗原表达水平。

在凝集实验中测定红细胞时，当抗原表达水平的降低相应于凝集分值降低2～3个单位时，处理悬浮液以阻止抗原表达水平的降低。

红细胞的起始抗原表达水平等于：血清学检查中，每个红细胞抗原表达数量大于5×10⁵拷贝数。

表达抗原的红细胞所在溶液中含有至少一种优势免疫的糖修饰酶的是A型红细胞。

表达抗原的红细胞所在溶液中含有至少一种优势免疫的糖修饰酶的是B型红细胞。

表达抗原的红细胞所在溶液中含有至少一种优势免疫的糖修饰酶的是AB型红细胞。

通过清洗红细胞去除免疫优势的糖修饰酶以阻止抗原水平的过度降低。

抗原表达水平的降低实质上等同于临床上抗原显著性的阈值。

表达低水平抗原的红细胞，在血清学检查中，其每个红细胞中的抗原数少于5×10⁵拷贝数，最好每个红细胞中的抗原数少于1×10⁵拷贝数，最好每个红细胞中的抗原数少于2×10⁴拷贝数。

表达低水平抗原的红细胞，在血清学结果中，其每个红细胞中的抗原数大于1×10²拷贝数，最好每个红细胞中的抗原数大于1×10³拷贝数。

免疫优势抗原红细胞的糖链连接方式，是α连接的N-乙酰半乳糖胺或α连接的半乳糖连接到H抗原。

血型抗原最好是A抗原或B抗原。

所用的酶至少一种是优势免疫糖修饰酶。该酶能够在α1-3位连接处使键断裂。最好使用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶，或者同时使用这两种酶。

抗原表达水平的降低更加等同于凝集分值的降低，实质上等同于在同一凝集实验中测定天然红细胞的弱表达ABO亚型在凝集实验中的凝集分值。

红细胞最好是人类的红细胞。

第三方面，该发明提供了由发明的第二方面所提供的酶学上表达低水平抗原的红细胞的制备方法。

第四方面，该法面提供了血型测定试剂的质量控制的方法，包括：

将血型测定试剂与根据第一方面和第三方面制备的红细胞悬浮液进行反应；

测定凝集值。

凝集值的测定是通过观察凝集的数量。

这个方法对于血型测定试剂的一系列的稀释度都是可以重复的。

可以选择的是，这个过程可以包括一步判断红细胞抗原表达水平的步骤，也就是通过参考已知的红细胞的抗原表达水平。表达已知抗原水平的红细胞可以通过国际专利应用PCT/NZ02/00219中所描述的方法进行制备。

第五方面，这项发明提供了一个由两种或多种红细胞悬浮液的试剂盒，这种红细胞的制备参见发明的第一方面和第三方面。

这个试剂盒包含对表达A型和B型红细胞灵敏度的控制，红细胞的制备参见发明的第一方面和第三方面。悬浮液中包含细胞防腐剂，比如Celpresol^TM。悬浮液中包含可以提供额外的控制指标，如临床上显著意义的抗体。

可供选择的是，试剂盒中包含灵敏度控制的试剂，包括表达Rh DCce(Rlr)和Rh ce(rr)抗原的红细胞。

下面将详细介绍这项发明。

发明详述：

A抗原的优势免疫的糖是一个α连接的N-乙酰半乳糖胺。B抗原的优势免疫的糖是一个α连接的半乳糖。优势免疫的糖连接到H抗原。

优势免疫的糖的通过酶的去除和修饰会导致原始抗原性的丢失。因此，A，B或AB血型的红细胞的A抗原和B抗原的表达水平可以被酶降低。

抗原的酶解消化是基于以下标准，酶(糖苷酶)能够在红细胞膜上特异降解糖类抗原，而不会破坏非目标结构，例如：非靶位连接的蛋白质和糖类。

酶的变性以前被用来去除红细胞中的ABO血型抗原，从而将A型细胞和B型细胞转化成O型细胞。研究者用高浓度的酶可以去除大部分甚至全部的红细胞抗原。

在输血时，这些去除抗原的细胞能够用作通用的鲜血单位(Davis1997；Goldstein 1989；Hobbs 1996；Hoskins 1995；Lenny 1991a；Zhu 1996)。“去除抗原的血”在临床输血中试验成功，尽管现在并没有常规应用(Goldstein 1982；Lenny 1991b；Lenny 1994)。

这些作者描述的方法没有提供表达减少但又有限的抗原水平的红细胞，这种抗原的表达水平处于或高于临床上显著性的阈值。实际上，这些方法试图提供不表达抗原的红细胞，或至少不超过临床显著性阈值数量抗原的红细胞。

根据这项发明，表达低水平A抗原或/和B抗原的红细胞是在体外制备的。在A抗原或/和B抗原表达水平方面，制备的红细胞在血清学检查中等于天然存在的ABO亚型的红细胞。

消化作用的条件，例如处理的时间、温度、酶活性和红细胞与酶的比例，在控制抗原表达水平的减少方面是可以调节的。细胞膜上抗原的酶解消化时间也依赖于酶溶液的相对浓度和细胞上抗原初始的表达水平。

酶浓度的改变可以用作控制抗原的表达水平。如果想得到弱表达A抗原或B抗原的细胞，可以使用高浓度的酶。如果需要强凝集的细胞，可以使用低浓度的酶。

医用输血中所用到的典型的质量控制细胞由A型或B型细胞制备，这种条件下酶将去除A抗原和/或B抗原，从而在抗原测定分析中得到特定的反应分数。这项分析将包括板，试管，凝胶卡，和微型板方法，和任何手工或自动化的使用凝集的平台，或任何其他的检测抗原的方法(例如：酶联免疫，流式细胞仪等)。

传统方法获得红细胞在血清学检测中，凝集分析的结果接近于2+。实际的血清学结果需要依赖于所用分析系统的灵敏度，例如板与自动化方法的灵敏度是不同的。

消化的过程可以通过定期取样和分析凝集系统的表现进行监测。一旦消化的条件依赖于实验比例的大量的表达低水平抗原的红细胞，就可以制备可供作为质量控制的细胞。

凝集实验是测定抗原的一种方法。细胞间抗体的交联形成的红细胞结块称为凝集。凝集可以通过观察(用眼睛)或用血型分析仪自动化技术检测。增强对凝集的观察可以通过使用特定的酶或放射活性或荧光标记技术。

根据以下方案对手动的凝集反应进行计分：

对凝集水平的评价可以通过直接观察凝集或通过使用诱导凝集的方法产生非直接的凝集进行评价，例如增强效应或使用抗球蛋白分子。

表达低水平抗原的红细胞，在血清学上实质上等同于天然产生ABO血型和亚型的红细胞，作为质量控制细胞具有特别的优势和优点。

如果需要，质量控制细胞的实际抗原表达水平(每个红细胞上的抗原分子数)可以通过参考已知抗原表达水平的红细胞。这些被参考的红细胞可以是自然存在的弱表达抗原的ABO亚型或表达已知抗原水平的红细胞，可以通过国际专利应用PCT/NZ02/00219中所描述的方法进行制备。

应该说明的是，并不需要知道质量控制细胞的实际抗原表达水平。质量控制细胞被用来评价和检测血型测定试剂的发生的质量上的变化。质量控制细胞抗原表达水平低且有限才是重要之处。

可以制备具有不同抗原表达水平的质量控制细胞。一套质量控制细胞的抗原表达水平可以通过选择临床上显著性阈值，在此阈值测定抗原的失败将会导致临床上明显的输血反应。另一套质量控制细胞的抗原表达水平可以通过选择有足够把握测定弱亚型的红细胞。

上述提到的质量控制细胞可以通过控制灵敏度在一定范围内，从而确证ABO血型测定的准确性。这些灵敏度控制细胞也可以用在校正高度灵敏的机器或在流式细胞仪测定抗原定量曲线时使用。这可以保证ABO血型供给的安全性。

这项发明使得质量控制的标准化和全球一致性。这项发明使得可以对不同实验室和不同方法学的结果进行比较。将质量控制细胞包含在输血血清学质量保证计划，可以建立的ABO血型测定的质量控制标准。

这项发明中，包含在试剂盒中的的质量控制细胞可以用来确证血型测定中A型血(弱)和B型血(弱)的表型。这一试剂盒可以包括质量控制细胞，用来确证对Rh DCce(Rlr)和Rh ce(rr)表型的血型测定结果。这一试剂盒能够保证ABO和RhD血型测定试剂能够进行质量控制。包含表达一定范围抗原水平的质量控制细胞的其他试剂盒对于一些专业化的实验室是很有益处的。

在制备质量控制细胞的悬浮液时，重悬的液体可能含有临床上有显著意义的抗体。因此，应该引入额外的质量控制特征，例如共存的抗体对照。

提供以下的定义和解释辅助理解这项发明的权利要求的描述和要求范围。

“临床显著阈值”是当红细胞的抗原表达水平低于此标准时，如果进行输血，抗原检测的失败在临床上无显著性。

“优势免疫糖修饰酶”是指这些酶能够修改A抗原或B抗原的抗原决定簇，从而导致抗原表达水平的降低。例如：优势免疫糖修饰酶包括α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖酶。

“酶学上抗原表达水平的降低”是指通过酶消化细胞表面的抗原，体外得到的抗原表达水平。

“抗原表达”是指细胞表面出现的抗原，“抗原表达水平”是指细胞表面出现的抗原数量。

“质量控制细胞”是指表达抗原的细胞，典型的是红细胞，用来评价血型测定试剂的质量和对测定系统进行校正和确证。这项发明的质量控制细胞的例子是例1，2和3中描述的酶修饰的细胞。

在上述叙述中出现的抗原水平“实质上等同于”是指这一抗原表达的水平将在血清学分析中提供实质上同样的结果。

抗原表达水平是通过每个红细胞的抗原拷贝数定义的，抗原表达水平处于可接受的水平是指已知ABO亚型的抗原表达水平，或者该抗原表达水平能够提供血清学上已知ABO亚型的相同的结果。

抗原表达水平的“高”和“低”是用来区别普通ABO亚型如A1和不常见的弱抗原表达的ABO亚型。