法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-07-24
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20090909 终止日期:20120601 申请日:20060601
专利权的终止
2009-09-09
授权
授权
2007-02-14
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-12-27
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种分子探针，尤其是涉及一种用荧光标记肽核酸探针的设计以及在快速检测和鉴定赤潮藻纤小裸甲藻(Takayama pulchellum)细胞及自然水体中低丰度单种目标赤潮藻细胞中的应用。
背景技术
肽核酸(peptide nucleic acid；PNA)是一类不带电荷的类似于肽链骨架结构并携带有碱基的新人工信息分子，该分子主链骨架是由单体N-(2-氨乙基)-甘氨酸间通过酰胺键反复连接而成的长链，侧链则是利用亚甲羰酰键将碱基与主链骨架相连而形成。自PNA被发现10年以来，其作为一种优良的寡核苷酸取代物而被广泛地应用于分子生物学研究及相关领域，被认为是非常有前景的探针工具，PNA的特点使之能成为一种方便快捷的检测模式，优越性大大超过了DNA探针，它能特异地与目标生物的rRNA特异性靶序列发生结合，广泛地应用于环境监测、工业和临床标本的检测和分析。因此目前人们已致力于发展有着广泛应用前景的PNA探针技术来监测赤潮类群，使这些细胞能通过光学或化学的手段检测出来，但目前还没有见到在赤潮检测中使用PNA探针的报道。在其他相关研究方面，Litaker等采用PNA探针结合原位杂交的方法研究了异养甲藻(Pfiesteria piscicida)即幽灵藻(Dinophyceae)的细胞周期，表明其细胞周期是一种典型的自由生活的海洋甲藻，缺乏任何变形虫阶段或其他类似的阶段。Worden等通过全细胞原位杂交法，使用PNA探针检测未固定的海洋蓝细菌，发现其检测信号是DNA探针的5倍，这是由于PNA的特性使得杂交能在低盐和较高温度的条件下进行，而这些条件明显地降低了rRNA和DNA二级结构的稳定性，因此使PNA探针能有效地和比较难到达的靶位点发生有效结合，这是使用PNA探针的优势，提高了蓝细菌的杂交效果。
日本学者最早报道了Takayama pulchellum，其为可能产生鱼毒素、溶血性毒素和神经性毒素的种类，1994年曾正式被描述并定名为Gymnodinium pulchellum，新近则被更名为Takayama pulchellum。在美国和澳大利亚都引发过赤潮，并导致大量鱼类死亡，厦门海域曾在1986年发生过一次裸甲藻赤潮，密度达到107个/L，2003年7月再次发生了大规模的裸甲藻赤潮，密度达到了106个/L，经鉴定证实为Takayama pulchellum。本申请人于2004和2005年也先后在厦门港采样并分离到了Takayama pulchellum这种可能产毒的裸甲藻，表明其为厦门海域常见裸甲藻种类，尤其可见应用新技术对其进行快速监测有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能快速检测和鉴定有害赤潮生物纤小裸甲藻(T.pulchellum)的荧光标记肽核酸(PNA)探针及其设计方法。
本发明的另一目的是提供一种基于荧光标记肽核酸(PNA)探针应用于快速鉴定和检测目标赤潮生物的方法。
本发明所述的快速检测和鉴定有害赤潮生物纤小裸甲藻的荧光标记肽核酸(PNA)探针其分子名称为PNATP28S01，其分子结构的组成序列为[Flu]-○○ ATG CCA TCT CAA GA，其分子骨架不含戊糖和磷酸基团，呈电中性，4种单体分别携带有ATGC4种碱基以首尾相连构成链状结构。
所述的荧光标记肽核酸(PNA)分子的N端标记有荧光报告基团FAM，激发光波长Ex＝494nm，发射光波长Em＝522nm，荧光报告基团和N端以连接器相连，C端无报告基团；Tm值分别为[1μM]＝68℃，[1nM]＝56℃，[1pM]＝44℃，分子量MW＝4428.85，由14个碱基组成，有17个残基；嘌呤比例占50％，连续的嘌呤长度为4个，分子间碱基的互补性低(特征详见表1)。
表1利用美国应用生物系统公司提供的PNA在线设计软件对探针的设计和计算结果
注：Flu，代表荧光标记；○○代表连接器；Ex：激发光；Em：发射光。
本发明所述的快速检测和鉴定有害赤潮生物纤小裸甲藻的荧光标记肽核酸(PNA)探针的设计和获取方法的步骤为：
1)靶DNA序列的获得，采用DNA提取，PCR扩增，克隆，测序；
2)将通过PCR产物克隆和测序得到的rDNA靶序列，利用核苷酸序列排列软件Clustal X与从各大核酸数据得到亲缘关系相近生物的5S RNA，18S RNA，28S RNA以及ITS1，ITS2序列分别进行排序；
3)根据排序结果，初选出目标种保守序列，并选择长度为18～25bp；利用GeneBank中的BLAST(英文全称为Basic local alignment search tool，意为本地序列比对和搜索工具)接口将上述得到的特异性序列在已发表的核酸数据库进行匹配性搜索，以筛选出在已知所有序列中保守属与种的特异性序列；
4)利用Oligo 6.0程序或Primer Select软件(DNASTAR，Madison，WI)等检测探针序列的各项参数指标(PNA和DNA)，计算其GC含量、结构特点、Tm值等；
5)在第1)、2)、3)、4)步骤工作的基础上进行PNA探针的设计和计算，并再次利用BLAST进行相似性搜索；
6)选择获得阴性对照探针PNABacUni-I，序列为：CTGCCTCCCGTAGGA，并进行辅助PNA探针设计，获得符合条件的阳性对照探针PNA-Euk1209，序列为：GCATCACAGACCTG。
在步骤1)中，rDNA的PCR扩增、纯化及克隆方法为：离心收集指数生长期末期的细胞，PCR基本程序为：预变性：94℃，5min；94℃，1min；54℃，1min；72℃，1min；30个循环；延伸：72℃，10min，进行PCR扩增，扩增引物参见文献：侯建军，黄邦钦.用PCR扩增裸甲藻和微小原甲藻rRNA基因的方法研究.湖北民院学报自然科学版，2005，23(1)：82-85。PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化，然后克隆到pGEM-T质粒(Promega)，蓝白斑筛选，菌落PCR确定为阳性反应后送生工测序。
在步骤1)中，所述的离心收集指数生长期末期的细胞的基因组的提取方法采用改良的CTAB法，参考文献：Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning[M].Cold SpringHarbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，456-490。所述的PCR产物用DNA纯化试剂盒采用华美公司产品。
本发明中PNA探针的分子结构模式见图1。
经过步骤1)-4)获得的探针及特点见表2。
在步骤5)中，所述的在第1)、2)、3)、4)步骤工作的基础上进行PNA探针的设计和计算可用美国应用生物系统公司提供的在线软件来进行，最后得到的PNA探针长度以11-15bp为宜，再利用BLAST进行相似性搜索。
表2根据设计方案1-4步获得基本符合条件的被选DNA探针
经过步骤5)最终获得符合条件的PNA探针及特点见表1。
在步骤6)中，所述的选择获得阴性对照探针PNABacUni-I可根据文献选择，所述的文献为：
Litaker R.W.，Vandersea M.W.，Kibler S.R.et al.. Life cycle of the hetero trophicdinoflagellate Pfiesteria piscicida (Dinophyceae)[J].J.Phycol.，2002，38(3)：442～463。
所述的辅助PNA探针设计可根据文献报道的Euk1209R序列，采用美国应用生物系统提供的在线软件辅助PNA探针设计，所述的文献为：
Chen Jixin，Huang Bangqin，Jiao Nianzhi et al.2003.Fluorescent in situ Hybridization witholigonucleotide probes to identify Alexandrium tamarense and Genus Alexandrium.In：Recent
advances in the prevention and management of harmful algal blooms in the South China Sea.Edited by Kin-Chung Ho，Song-Hui Lv，Tsz-Sau Yu et al.，Proceedings of the International Confer-ence on the Prevention and Management of Harmful Algal Blooms in the South China ea.pp.81-88。
PNA探针标记后能直接利用落射荧光显微镜进行定性和半定量的检测。在适当的情况下，其反应产物可利用荧光分光光度计进行定量的检测；在需要的情况下，也可以利用流式细胞仪进行定性和定量的检测。
本发明所述的荧光标记肽核酸(PNA)探针快速检测和鉴定有害赤潮生物纤小裸甲藻的方法其步骤如下：
1)取培养样品的固定细胞，通过离心沉淀，沉淀用PBS缓冲溶液洗涤后重新悬浮于杂交缓冲溶液中，加入含有终浓度为50～300nM的荧光标记PNA探针；
2)细胞在40～60℃下温孵、离心后，重新悬浮于杂交洗涤液中，在45～55℃下保温；
3)用离心法洗涤沉淀后，细胞重新悬浮于洗涤溶液中，将细胞悬浮液均匀铺展在干净的显微镜载玻片上，直到干燥，盖上盖玻片观察。
在步骤1)中，杂交缓冲溶液的配方为：25mM Tris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/vSDS。
在步骤2)中，杂交洗涤液中的配方为：10mM Tris，pH9.0，1mMEDTA。
用于现场样品的检测应用方法为：将现场样品进行浓缩及显微镜计数后，用针筒吸取浓缩后的样品，在针筒过滤器上低压过滤，用针筒吸取缓冲溶液，清洗后滤掉。针筒吸取预热的杂交缓冲液，清洗后滤掉。将滤膜置于载玻片上，直接加入预热的杂交缓冲液与荧光探针，使探针终浓度达到50～300nM。将玻片置于温湿杂交盒于暗处45～55℃杂交。温湿暗杂交盒中的湿纸用杂交缓冲液润湿，并确保含探针的杂交缓冲液完全覆盖滤膜(根据滤膜大小，用量可以减半)。用45～60℃预热的杂交清洗液洗涤滤膜来终止杂交反应，清洗后温育，洗涤后用干净滤纸吸干滤膜。加入封片剂进行复染并防止荧光衰退。盖上盖玻片并封片，储存于暗处以备检测。玻片可以在冷冻条件下保存数月而荧光不会衰减。杂交缓冲溶液的配方为：25mMTris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/vSDS；杂交洗涤液中的配方为：10mm Tris，pH9.0，1mMEDTA。
用流式细胞仪进行检测的方法为：将实验室培养的T.pulchellum单种藻细胞或混合样品用终浓度为1％的多聚甲醛在0～4℃下固定，然后用乙醇：PBS(磷酸缓冲溶液)进行脱色后，离心去上清，加入杂交缓冲溶液和探针，使探针的终浓度为50～300nM，温育，杂交结束后加入预热的杂交洗涤液，在45～55℃下温孵，然后离心沉淀，最后将细胞重悬在PBS缓冲溶液中，样品用流式细胞仪进行检测。杂交缓冲溶液的配方为：25mM Tris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/vSDS；杂交洗涤液中的配方为：10mM Tris，pH9.0，1mMEDTA。
本发明的优点是：可以简便、快捷地对有害赤潮生物T.pulchellum进行定性检测和鉴定，在需要的情况下，也可以进行定量检测，并能对形态相似或亲缘关系相近的赤潮生物进行识别和区分，目前未见有相关的报道。本发明与当前国内外用得较多的免疫荧光探针和DNA探针等技术相比，PNA分子即非蛋白也非核酸，且目前已知的核酸酶和蛋白酶都不能识别携带嘌呤和嘧啶侧链的这种不常见的聚酰胺主链，因此不论是在体内还是在体外，PNA在大范围的pH以及超延伸时间下都很稳定，不易被酶降解。PNA分子骨架不含戊糖和磷酸基，故呈电中性，此电中性的存在赋予了其许多DNA或DNA类似物所不具有的性质，如高灵敏度、高特异性、非盐依赖性、高稳定性等。这就使得PNA在杂交检测过程中的灵敏度较DNA要高得多，中性骨架决定了它在与DNA杂交过程中不仅可以省去提高盐浓度的操作，还可以运用降低杂交体系离子浓度来抑制非特异性的杂交和靶DNA序列自身复性对灵敏度的影响。检测方法方面，PNA原位杂交(FISH)的分析步骤较少，并且可直接检测PNA探针，因此省去了化学发光底物。且PNA探针有效地穿透赤潮藻疏水的细胞壁，这归因于PNA探针的疏水特性。PNA赤潮检测探针技术具有着快速、准确、专一性强等特点，能成为赤潮生物系统分类和生态学研究的重要工具，特别是目标生物在复杂生物群落中不占优势或者有大量背景噪音干扰的情况下，PNA探针技术的优势尤显突出，操作方法使用方便，重复性好，准确性和可靠性高，省时省力，从而可很好地应用于赤潮生物T.pulchellum的鉴定和检测以及分子生态学的研究等诸领域。
附图说明
图1为PNA分子的模式图。从图1中可见PNA探针的结构模式和标记方式等特点。在
图1中，荧光标记肽核酸(PNA)分子的N端标记有荧光报告基团FAM，激发光波长Ex＝494nm，发射光波长Em＝522nm，荧光报告基团和N端以连接器(Linker)相连，C端无报告基团；Tm值分别为[1μM]＝68℃，[1nM]＝56℃，[1pM]＝44℃，分子量MW＝4428.85，由14个碱基组成，有17个残基；嘌呤比例占50％，连续的嘌呤长度为4个，分子间碱基的互补性低。
图2为使用FAM标记的PNA探针对单种样品和混合样品中目标生物T.pulchellum检测和识别效果的落射荧光显微镜效果图。从图2中可见，阴性探针则不能发生特异性结合。特异性靶探针PNATP28S01和T.pulchellum杂交表现出和阳性探针一样的杂交效果，而和其他非目标藻则无明显的阳性反应(详见图2，A.B.C.D.E.F.)；混合样品I(Mixed samples I)为赤潮异湾藻，锥装施氏藻，盐生杜氏藻，湛江叉鞭金藻，中肋骨条藻以及威氏海链藻组成。混合样品II(Mixedsamples II)由微小原甲藻，微小亚历山大藻，东海原甲藻，米氏凯伦藻和短裸甲藻组成。PNATP28S01探针均能在这两个藻的混合样品中，将目标藻T.pulchellum识别出来，而不会和其他藻发生显著的交叉反应。DAPI染色是为了帮助判断染色的细胞是否属于目标藻的活细胞(见图2，G.H.I.J.K.L.)。在图2中，A为对照组；B为纤小裸甲藻和探针PNABacUni-I杂交；C为纤小裸甲藻和探针PNAEuk1209R杂交；D为明视野照片；E为纤小裸甲藻用核酸染料DAPI染色效果；F为纤小裸甲藻和探针PNA28S01杂交；G.为混合样品I；H.为混合样品II；I为现场样品三者和探针PNATP28S01的杂交效果；J、K、L分别为混合样品、混合样品、现场样品用DAPI染色的效果图。
图3为DNA探针和PNA探针的阳性杂交率。从图3中可显示在同样的探针浓度和同样的杂交条件下，PNA探针的杂交率(95％)明显高于DNATP18S02的66％和同序列DNA探针DNATP28S01的54％。在图3中，横坐标为探针PNAEuk1209，探针DNATP18S02，探针DNATP28S01，探针PNATP28S01，纵坐标为探针的杂交率(％)。
图4为用DNA和PNA探针对T.pulchellum进行杂交后的标记目标藻细胞流式细胞仪检测分析图谱(直方图)。从图4中显示，被PNA探针标记的经过流式细胞仪检测时，形状一致的被标记的细胞和未被标记的细胞均能被有效地识别，荧光强度不同便形成了不同的峰值，从而构成不同的图谱。从图4中可以看出PNA探针的荧光强度与相似序列DNA探针标记的细胞有一定的差异，并明显高于空白对照组和阴性对照组的自发荧光强度，从而使特异性标记的藻细胞能被检出(见图4)。在图4中，横坐标为荧光强度FL1LOG，纵坐标为事件数即细胞数量。曲线a为无探针，b为DNA探针，c为PNA探针。
图5为用PNA探针对T.pulchellum的混合样品中识别PNA探针标记目标藻细胞的流式细胞仪分析图谱(直方图)。流式细胞仪能根据PNA探针标记的绿色荧光信号的强弱，将靶细胞与混合藻种从复杂的背景中区分开来。从未被探针标记的细胞产生的波峰与标记探针波峰图谱的分离程度，可以反映出特异性分子探针的杂交率较高。在图5中，横坐标为荧光强度FL1LOG，纵坐标为事件数即细胞数量。曲线d为其它非靶细胞，e为靶细胞。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：T.pulchellum纯种藻细胞和其他交叉实验用藻的全细胞荧光原位杂交检测。
1.全部检测材料的来源及培养方法：
现场样品采集方法：用采水器采集5～10L海水，用10μm筛绢过滤浓缩，将水体积缩小为100～200mL，测量体积，根据样品研究的需要分别加入1/10体积的多聚甲醛(10％)，终浓度1％，镜检计数。活细胞分离采用毛细玻璃管或10μl的微量加样枪在新鲜采集未固定的样品中于体视显微镜下挑取目标藻的单细胞多个(根据情况可以先采用筛绢预过滤或加入f/2培养基预培养)，置于多孔细胞培养板中，镜检观察并加入f/2培养基培养，逐步经过多次挑取和驯化培养后，待细胞长至一定密度下时，可转移至培养瓶中进行培养。将已分离出并能正常生长的藻用0.45μm的滤膜过滤海水煮沸后配成f/2培养基，在5000LX光强，L∶D＝12∶12的光周期和22℃的温度下于厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室藻种库中进行纯种无菌培养。其它用于验证探针特异性的藻类详见表3，培养方法相同。
表3 应用于荧光原位杂交的藻株
2.探针的杂交及验证：
取100μl固定和脱色后的细胞(约105/ml)通过离心沉淀，沉淀用PBS缓冲溶液洗涤后重新悬浮于100μl的杂交缓冲溶液(25mM Tris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/vSDS)中。加入含有50～300nM荧光标记的PNA探针(终浓度)。细胞在55℃下温孵30min。10000rpm离心5min后，重新悬浮于500μl的杂交洗涤液中(10mM Tris，pH9.0，1mMEDTA)，在55℃下温孵10min，然后离心沉淀，重复3次，最后一次洗涤后，细胞重新悬浮于100μl洗涤溶液中，其中将2μl细胞悬浮液均匀铺展在干净的显微镜载玻片上，盖上盖玻片观察。
3.结果：
PNA特异性探针和纯种T.pulchellum的全细胞荧光原位杂交结果为：以阳性探针来选择合适的的PNA探针杂交条件。携带绿色荧光标记物质FAM的PNATP28S01探针进入了藻细胞并和目标基因发生了强烈的特异性结合，在落射荧光显微镜下，使藻细胞在494nm光激发下，发出522nm的绿色荧光。且杂交率接近100％。阴性探针和对照组则没有明显的绿色荧光信号检出。PNATP28S01是T.pulchellum特异性探针，阳性探针PNAEuk1209R是针对真核生物18SrRNA设计，目的是用来摸索杂交条件，并确证靶探针的阴性反应不是由于PNA探针不能进入细胞造成的。阴性探针PNABacUni-I是针对原核生物细菌设计的，用来辨析探针阳性反应不是探针的非特异性结合。结果表明阳性探针PNAEuk1209R探针在荧光显微镜下表现出与PNABacUni-I探针和空白对照组完全不一样的荧光效果。阳性对照组中T.pulchellum和其他种类验证用藻的细胞质(核除外)呈现出明亮的绿色荧光，阴性对照组和空白对照组则只表现出微弱的橘黄色自发荧光。表明阳性探针能和T.pulchellum及其他类别藻的细胞质中核糖体RNA靶序列杂交，提示杂交程序，杂交方法和条件均符合PNA探针的杂交需要，而阴性探针则不能发生特异性结合。特异性靶探针PNATP28S01和T.pulchellum杂交表现出和阳性探针一样的杂交效果，而和其他非目标藻则无明显的阳性反应，表明PNATP28S01能有效地检测出T.pulchellum。表1中提供了19种藻用于原位荧光杂交的交叉实验，分属于5个纲。通过选择合适的与目标生物T.pulchellum一样的杂交条件，均未表现出明的显交叉反应(详见图2，A.B.C.D.E.F.)。
4.结论：
携带绿色荧光标记物质FAM的PNATP28S01探针进入了藻细胞并和目标基因发生了强烈的特异性结合，且和其他藻没有发生明显的交叉反应。
实施例2：PNA探针和DNA探针的杂交效果比较。
1.检测材料：
实验用的藻细胞株名称及来源见表3。培养方法详见实施例1第1条。
2.检测方法：
详见实施例1第2条，DNA和PNA探针原位杂交的荧光信号强度定量分析采用C-image公司的Simple PCI专业图像分析软件系统进行分析。
3.结果：
在同样的探针浓度下，将杂交率最高的DNA探针DNATP18S02和相似序列的DNA探针DNATP18S02与PNA探针的杂交效率和杂交后的荧光强度进行比较，发现在同样的杂交条件下，PNA探针的杂交率(95％)明显高于DNATP18S02的66％和同序列DNA探针DNATP28S01的54％。且同序列探针之间，PNA探针与DNA探针的杂交率差异显著(p＝0.016＜0.05)(详见图3)。
根据Simple PCI专业图像分析软件计算被标记靶细胞的荧光信号强度结果也显示，PNA探针的荧光信号强度显著高于DNA探针的荧光强度(p＜0.01)。是DNA的5倍。且PNA探针的杂交条件较DNA要容易控制，其杂交体系也能兼容DNA的，PNA探针疏水性导致其通透率也高，容易进入细胞，同时PNA杂交的时间短，30min就可以获得理想的杂交效果，要比DNA探针的杂交时间(3h)短很多。
4.结论：
PNA探针的杂交率显著高于DNA探针，且杂交条件比DNA的容易控制。
实施例3：荧光标记的PNA探针对混合藻种样品的全细胞荧光杂交检测。
1.检测材料：
实验用的藻细胞株名称及来源见表3。用藻的培养方法详见实施例1第1条。
2.检测方法：
详见实施例1第2条。
3.结果：
混合样品I(Mixed samples I)为赤潮异湾藻，锥装施氏藻，盐生杜氏藻，湛江叉鞭金藻，中肋骨条藻以及威氏海链藻组成。混合样品II(Mixed samples II)由微小原甲藻，微小亚历山大藻，东海原甲藻，米氏凯伦藻和短裸甲藻组成。在这两个混合样品中，加入约1/5混合体积的目标藻细胞培养液体，并用自然海水混合，模拟成自然海水的样品特点。PNATP28S01探针均能在这两个藻的混合样品中，将目标藻T.pulchellum识别出来，而不会和其他藻发生显著的交叉反应。荧光显微镜和流式细胞仪的检测结果比较一致。用DAPI染色是为了帮助判断染色的细胞是否属于目标藻的活细胞(见图2，G.H.I.J.K.L)。
4.结论：
用荧光标记的PNA探针能很容易地从混合样品中检测出目标生物T.pulchellum。
实施例4：T.pulchellum藻与FAM标记特异性PNA探针杂交的流式细胞仪检测。
1.材料：
同实施例1。
2.方法：
根据Amann(参见文献：Amann，R.In situ identification ofmicroorganisms by whole cell hybridizationwith rRNA-targeted nucleic acid probes.In Akkermann，A.D.L.，VanElsas，J.D.&de-Bruijin，F.J.[Eds].Molecular Microbial Ecology Manual.Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，The Netherlands，1995.1-15.)提出用流式细胞仪检测原位荧光杂交的方法进行改进。将实验室培养的T.pulchellum单种藻细胞或混合样品用1％的多聚甲醛在4℃下固定1～2h，然后用乙醇：PBS(70∶30，v/v)进行脱色1h。离心去上清，加入杂交缓冲溶液(25mM Tris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/v SDS)50～100μl以及探针，使探针的终浓度为50～300nM。温育30～60min，温度为45～55℃。杂交结束后加入预热的杂交洗涤液(10mM Tris，pH9.0，1mMEDTA)，在45～55℃下温孵10～30min，然后采用离心法洗涤沉淀，重复洗涤2～3次。最后将细胞重悬在PBS缓冲溶液中(pH9.0)。样品用Bechman coulte Epics Altra 2型流式细胞仪中进行检测，激光波长为488nm。
3.结果：
被PNA探针标记的经过流式细胞仪检测时，形状一致的被标记的细胞和未被标记的细胞均能被有效地识别，荧光强度不同便形成了不同的峰值，从而构成不同的图谱。从图4中可以看出，流式细胞仪对PNA标记的T.pulchellum细胞检测效果与荧光显微镜下的结果一致。且能对荧光强度进行量化，其荧光强度与相似序列DNA探针标记的细胞有一定的差异，并明显高于空白对照组和阴性对照组的自发荧光强度，从而使特异性标记的藻细胞能被检出(图3A)。在混合样品中，流式细胞仪也能根据PNA探针标记的绿色荧光信号的强弱，将靶细胞与混合藻种从复杂的背景中区分开来。从未被探针标记的细胞产生的波峰与标记探针波峰图谱的分离程度，可以反映出特异性分子探针的杂交率较高(图3B)。图中的其他藻细胞也能产生一定的荧光强度，可能这些藻存在自发荧光以及部分藻也存在着较弱的交叉反应，导致其产生部分荧光信号(检测结果详见图4)。
4.结论：
通过流式细胞仪定性和定量的检测表明，PNA探针可以在混合样品或单种样品中很容易地把目标赤潮生物T.pulchellum从背景颗粒和阴性染色藻(不能被探针标记上荧光的混合藻)中区分开。
实施例5：FAM标记特异性PNA探针应用于现场样品的检测结果。
1.材料及方法：
将现场样品进行浓缩及显微镜计数后，用针筒吸取1～2ml浓缩后的样品，在13mm针筒过滤器上低压过滤，用针筒吸取1×PBS 1mL清洗一次5min，滤掉。针筒吸取预热的杂交缓冲液1mL清洗一次，5min，滤掉。核孔滤膜可以室温空气干燥(大的滤膜如25mm可以剪成若干小块，用作多样本分析)。将滤膜置于载玻片上，直接加入预热的杂交缓冲液100μl与荧光探针，使探针终浓度达到300nM。将玻片置于温湿杂交盒于暗处55℃杂交30min。温湿暗杂交盒(自制)中的湿纸用杂交缓冲液润湿，并确保含探针的杂交缓冲液完全覆盖滤膜(根据滤膜大小，用量可以减半)。用预热的(55℃)杂交清洗液洗涤滤膜来终止杂交反应，以100μl清洗3次，每次温育5min，洗涤后用干净滤纸吸干滤膜。加入10-60uL封片剂Citifluor/DAPI-Mix(含1ug/mL DAPI)复染并防止荧光衰退。盖上盖玻片并封片，储存于暗处以备检测。玻片可以在冷冻条件下保存数月而荧光不会衰减。
2.结果：
将采自厦门港的赤潮样品用PNA探针进行检测，在供试的9个样品中，已经用明视野结合DNA及Lectin探针进行了检测，PNA探针的检测结果显著高于相似序列的DNA探针(TP28S01)检出率(p＜0.01)，也高于最佳DNA探针(TP18S01)的检出率。表明PNA探针能用于对现场复杂样品进行检测，且灵敏度高，检出信号强烈，探针结合能力很强。这种探针可作为现场赤潮生物监测的理想工具。检测效果见图2，I，检测的具体结果详见表4。
表4 2005年厦门西海域赤潮样品中Takayama各探针的检出数量和站位分布(Cell/L)
3.结论：
荧光标记的PNA探针能较好地应用于对现场样品进行有效地检测。
虽然PNA探针仍然存在一些不足，如价格过于昂贵，操作不慎容易产生假阳性，这些限制了其广泛的应用，但使用PNA分子探针来检测赤潮却有着重要的前景。
实施例6：以下给出荧光标记肽核酸(PNA)探针快速检测和鉴定有害赤潮生物纤小裸甲藻的方法的具体步骤。
取50～100μl纯培养样品的固定细胞(数量在104～105/ml之间)，通过离心沉淀，沉淀用PBS缓冲溶液洗涤后重新悬浮于50～100μl的杂交缓冲溶液中，加入含有终浓度为50～300nM的荧光标记PNA探针。细胞在40～60℃下温孵30～60min，8000～10000rpm离心5～10min后，重新悬浮于100～500μl的杂交洗涤液中，在45～55℃下保温10～20min。用离心法洗涤沉淀并重复2～3次，最后一次洗涤后，细胞重新悬浮于50～100μl洗涤溶液中，其中将2～5μl细胞悬浮液均匀铺展在干净的显微镜载玻片上，直到干燥，盖上厚的盖玻片观察。
用于现场样品的检测应用方法为：将现场样品进行浓缩及显微镜计数后，用针筒吸取1～5ml浓缩后的样品，在13～25mm针筒过滤器上低压过滤，用针筒吸取缓冲容易1～5mL，清洗一次，5～10min，滤掉。针筒吸取预热的杂交缓冲液1～5mL清洗一次，5～10min，滤掉。核孔滤膜可以室温空气干燥。将滤膜置于载玻片上，直接加入预热的杂交缓冲液50～100μl与荧光探针，使探针终浓度达到50～300nM。将玻片置于温湿杂交盒于暗处45～55℃杂交30～60min。温湿暗杂交盒(为自制产品)中的湿纸用杂交缓冲液润湿，并确保含探针的杂交缓冲液完全覆盖滤膜(根据滤膜大小，用量可以减半)。用预热的(45～60℃)杂交清洗液洗涤滤膜来终止杂交反应，以50～100μl清洗2～3次，每次温育5～10min，洗涤后用干净滤纸吸干滤膜。加入10-60uL封片剂进行复染并防止荧光衰退。盖上盖玻片并封片，储存于暗处以备检测。玻片可以在冷冻条件下保存数月而荧光不会衰减。
用流式细胞仪进行检测的方法为：将实验室培养的T.pulchellum单种藻细胞或混合样品用终浓度为1％的多聚甲醛在0～4℃下固定1～2h，然后用乙醇：PBS(磷酸缓冲溶液)(70∶30，v/v)进行脱色1～1.5h，离心去上清，加入杂交缓冲溶液50～100μl以及探针，使探针的终浓度为50～300nM。温育30～60min，温度为45～60℃。杂交结束后加入预热的杂交洗涤液，在45～55℃下温孵10～30min，然后离心沉淀并重复3次，最后将细胞重悬在PBS缓冲溶液中(pH9.0)，样品用Bechman coulte Epics Altra 2型流式细胞仪中进行检测，激光波长为488nm，功率为50W。
本申请涉及到的核酸序列(以下序列方向均为5’-3’方向)
1.纤小裸甲藻PNA肽核酸探针名称及序列(自主设计)：PNATP28S01，ATG CCA TCT CAA GA。
2.纤小裸甲藻DNA探针的序列(自主设计)：
TP18S01，CAATACCAGGGCGAACCT；
TP18S02，CAGGCCGAGCCAGATACGCA；
TP28S01，CGATGCCATCTCAAGACT；
TP28S02，GAACGAAGCACGGGAAGTGAA。
3.根据参考文献(黄邦钦，陈纪新，焦念志，等.应用荧光原位杂交和特异性寡核苷酸探针检测亚历山大藻属和塔玛亚历山大藻探索.高技术通讯，2003，13：90-95)设计的PNA阳性探针名称及序列如下：PNA-Euk1209，GCATCACAGACCTG。
4.根据文献(Litaker R.W.，Vandersea M.W.，Kibler S.R.et al..Life cycle of the hetero trophicdinoflagelate Pfiesteria piscicida(Dinophyceae)[J].J.Phycol.，2002，38(3)：442～463.)得到的PNA阴性探针名称及序列如下：PNABacUni-I，CTGCCTCCCGTAGGA。
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