具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白与应用

技术领域

本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白及其编码基因，以及该融合蛋白的表达方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康的重大疾病之一。全球新增肿瘤病例每年都在1000万以上，死亡达700多万人，目前，全球肿瘤患者已逾4000万人。据卫生部统计，我国肿瘤发病率呈总体上升趋势，近年来，每年新增肿瘤病人200万，死亡130多万，目前，全国肿瘤患者总数估计约达450万人。

由于传统肿瘤治疗方法(手术切除和放、化疗)的肿瘤靶向性差，毒副作用大，因而肿瘤靶向药物已成为未来抗癌药物发展的重要趋势。特异性抗肿瘤新生血管生成是肿瘤靶向治疗的热点领域。研究表明，肿瘤生长必须依赖其周围新生血管的形成，只要能破坏肿瘤新生血管，肿瘤就会因为无法获得足够的营养而停止生长，并迅速萎缩、凋亡、坏死，最终被机体消除。因此，肿瘤的抗血管治疗提供了针对肿瘤发生、发展过程中多个环节的全新治疗思路，具有良好的应用前景。

血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是1989年Ferrara等首先在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中纯化出来的糖类蛋白质，对血管形成具有特异性，并具有促进血管内皮细胞增殖、血管生成、增加血管通透性、加快血液流动等功能。VEGF及其受体家族，尤其是II型受体(F1k1/KDR)，与肿瘤的生长、浸润和转移关系密切，是近年来抗癌药物设计的重要靶标。人类VEGF由于mRNA的不同剪接产生7种不同的VEGF分子，即：VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅、VEGF₁₄₈、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₃、VEGF₁₈₉及VEGF₂₀₆。其中，VEGF₁₂₁是最为常见的VEGF，它包含121个氨基酸残基，与其它成员不同的是，它能与II型VEGF受体(F1k1/KDR)以高亲和力特异结合，而与I型VEGF受体(Flt1)基本不结合。已证实，F1k1/KDR受体具有酪氨酸激酶活性，在多种恶性肿瘤组织的血管内皮细胞表面过度表达，而在相邻正常组织的血管内皮细胞几乎无法检测出。

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)是广泛存在于植物界的一类毒蛋白，是真核生物蛋白合成的抑制剂。它通过RNA N-糖苷酶作用于哺乳动物核糖体大亚基上的28S rRNA，并产生脱腺嘌呤作用，从而破坏核糖体的结构，抑制蛋白质的翻译；同时RIP还参与细胞凋亡的调节，具有巨大的药用潜力。

根据RIP一级结构的不同，可将其分成两类：I型和II型。I型RIP由一条肽链组成；II型RIP由两条多肽链组成，分别称为A链和B链，两条链通过二硫键相连。A链和I型RIP都具有RNA N-糖苷酶活性，能使核糖体失活。丝瓜籽核糖体失活蛋白是I型RIP的典型代表，II型RIP主要包括蓖麻毒蛋白、相思子蛋白和香樟毒蛋白等。I型RIP特别适合做细胞毒性治疗药物的弹头部分，即可将RIP连接到单克隆抗体或者肿瘤抗原的配体上，将RIP带到靶细胞内，选择性地杀死肿瘤细胞，因而具有较高的疗效和较低的毒性。

本发明的发明人从丝瓜籽中获得了一种核糖体失活蛋白，名称为Luffinα，其氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，其编码序列可如序列表中的SEQ IDNO：2所示。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有II型VEGF受体特异性，可选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白。

本发明所提供的融合蛋白，命名为VEGF₁₂₁/LuffinKDEL，是通过连接肽在丝瓜籽的核糖体失活蛋白Luffinα的氨基端(N端)连接VEGF₁₂₁的融合蛋白。

所述连接肽的选择是多种多样的，其氨基酸残基序列可如序列表中的SEQ ID NO：3所示的等具有两性分子特征的多肽，能通过破坏靶细胞的溶酶体膜而促进游离的毒素分子在靶细胞的释放，从而增强毒素的杀伤作用。

所述连接肽也可替换为其类似物，这些类似物与所述连接肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。

具体来讲，所述连接肽的氨基酸残基可进行以下改变(残基号取代后的氨基酸残基)：4 Gly；5 Ser；6 Lys，Ala；7 Lys，Ala，D-Ile，Arg.Leu，Val，His，Net；8 Lys，Ala，Trp，Arg，His；9 D-Lys，Ala，Arg，His；10 D-Phe，Ala，Lys，Trp，Leu，Ile，Val，Met；11 D-Leu，Lys，Ala，Ile，Val，Met；12 Lys，D-His，Ala，Arg，Ile，Val，Net；13 Ala，Lys，D-Scr，Trp，Met，Ile，Arg，His，Thr，Leu，Val；14 Lys，D-Ala，Trp，Arg，His，Leu，Ile，Val；15 D-Lys，Lys Ala，Trp，Arg，His，Leu，Ile，Val；16 D-Lys，Ars，His；17 D-Phe，Lys，Trp，Arg，His；18 Ala，Lys，Trp，Met，Arg，His，Phe，Leu，Ile，Val；19 Ala，D-Lys，Arg，His；20 Lys，Trp，D-Ala，Arg，His，Phe；21 Ala，Lys，D-Phe，Ile，Val，Met，Leu；22 Ala，Lys，D-Val，Trp，Arg，His，Met，Leu；23 Ala，Lys，TrP，Arg，His，Leu，Met；24 Ala，Lys，D-Glu，Gly，Arg，His，Leu，Ile，Phe，Asn；25 D-Ile，Ala，Lys，Trp，Leu，Phe，Val，Het；26 Lys，Pro，Ala，His，Leu，Arg，Ile，Phe；27 Lys，Ala，D-Asn，Gln，Arg，His；28 D-Ser，Lys，Ala，Thr，Gly，Leu，Ile，Gln，Asn；32 Gly；33 Ser。

具体来讲，所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：4；

2)将序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：4由405个氨基酸残基组成，自氨基端第1-122位氨基酸残基为VEGF₁₂₁，自氨基端第123-157位氨基酸残基为连接肽序列，自氨基端第158-405位氨基酸残基为丝瓜籽的核糖体失活蛋白。

编码上述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白的基因(VEGF₁₂₁/LuffinKDEL)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：5限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：5由1215个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1215位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-366位碱基为VEGF₁₂₁的编码序列，自5’端第367-471位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第472-1215位碱基为丝瓜籽核糖体失活蛋白的编码序列。

为获得更高的特异性，增加本发明融合毒素蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL在其靶\点--内质网的浓度，所述融合毒素蛋白中丝瓜籽核糖体失活蛋白的C端还连接有内质网定位信号，所述内质网定位信号的氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO：6所示。

具体来讲，所述连接有内质网定位信号的具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：7；

2)将序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：7由409个氨基酸残基组成，自氨基端第1-122位氨基酸残基为VEGF₁₂₁，自氨基端第123-157位氨基酸残基为连接肽序列，自氨基端第158-405位氨基酸残基为丝瓜籽的核糖体失活蛋白，自氨基端第406-409位氨基酸残基为内质网定位信号。

编码上述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白的基因(VEGF₁₂₁/LuffinKDEL)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：8的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：7的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：8限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：8由1227个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1227位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-366位碱基为VEGF₁₂₁的编码序列，自5’端第367-471位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第372-1215位碱基为丝瓜籽核糖体失活蛋白的编码序列，自5’端第1215-1227位碱基为内质网定位信号的编码序列。

所述VEGF₁₂₁/LuffinKDEL的片段、衍生物和类似物也是本发明要保护的，是指保持本发明的VEGF₁₂₁/LuffinKDEL相同生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可定义为：1)由一个或多个保守或非保守氨基酸残基(优选为保守性氨基酸残基)所取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是，也可以不是由遗传密码编码的；2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；3)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽；4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如用来纯化此多肽的序列，或是抗体片段或其它抗原配体序列的融合蛋白)，或是将编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合就可以获得融合多肽的编码序列，再使该融合多肽的编码序列获得表达，就可产生融合多肽。所述产生融合多肽的技术为本领域内公知的，包括连接编码多肽的编码序列，从而使它们在同一个读码框中，并且使融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。

所述VEGF₁₂₁/LuffinKDEL的类似物与VEGF₁₂₁/LuffinKDEL的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。应理解，本发明融合蛋白的氨基酸残基序列并不限于上述例举的具有代表性的序列。

所述VEGF₁₂₁/LuffinKDEL融合蛋白还可为经过修饰的，或经修饰提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的VEGF₁₂₁/LuffinKDEL多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：1)体内或体外的多肽的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化；2)糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽，这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；3)具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。

编码本发明VEGF₁₂₁/LuffinKDEL的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA或人工合成DNA，可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。

本发明还提供了所述融合蛋白多核苷酸的变异体，其编码与VEGF₁₂₁/LuffinKDEL有相同的氨基酸序列的多肽或多肽片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，还可包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

含有本发明基因VEGF₁₂₁/LuffinKDEL的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增VEGF₁₂₁/LuffinKDEL中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL的方法。

本发明所提供的融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL的表达方法，是将所述融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL基因、该基因变异体或含有融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL。

所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL基因可插入到重组表达载体中。构建所述重组表达载体的出发载体，可为任意一种指本领域熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。所述载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(AH Rosenberg，et al.Vectors for selectiveexpression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase.Gene.1987，56(1)：125-135)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(SJ Lee and D Nathans.Proliferinsecreted by cultured cells binds to mannose 6-phosphate receptors.J.Biol.Chem.1988；263：3521-3527)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

以pET-30a(+)为出发载体，构建的含有所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白基因VEGF₁₂₁/LuffinKDEL的重组表达载体为pET-30a(+)-VEGF₁₂₁/LuffinKDEL。

可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白基因VEGF₁₂₁/LuffinKDEL的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重组技术等(Sambrook，et al Molecular cloing，aLaboratory Manual.Cold spring harbor laboratory.New York，1989)。所述所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白基因VEGF₁₂₁/LuffinKDEL基因的DNA序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述启动子可为：大肠杆菌的lac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白(GFP)基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。

所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS、293细胞或Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，长度通常为10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。如在复制起始点晚期一侧的长度约为100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子或腺病毒增强子等。

可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进分离纯化。

培养含有本发明具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

所述融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL及其编码基因可用于制备抗肿瘤药物，因而本发明还提供了一种抗肿瘤药物。

本发明所提供的抗肿瘤药物，它的活性成分为上述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL或其编码基因。

所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL基因可存在于真核表达载体中。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液或冻干粉剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述蛋白药物和基因药物的用量可采用药学领域中蛋白药物和基因药物的常规剂量，并可根据实际情况调整。荷瘤裸鼠试验结果表明，本发明的融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL在注射剂量为15mg/kg体重时，即可发挥选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞的作用，并可明显延缓肿瘤的生长。

本发明提供了一种融合蛋白毒素VEGF₁₂₁/LuffinKDEL及其编码基因。该蛋白是利用VEGF₁₂₁与恶性肿瘤高表达的VEGF受体F1k1/KDR高度特异结合的特点，与来源于丝瓜籽的核糖体失活蛋白Luffinα通过连接肽连接而成的融合蛋白毒素。血管内皮细胞生长因子VEGF₁₂₁作为运载工具，可使该融合毒素与血管内皮细胞生长因子受体F1k1/KDR特异结合并内化进入血管内皮细胞，然后丝瓜籽核糖体失活蛋白Luffinα发挥其毒素效应，选择性地进入并杀伤肿瘤新生血管内皮细胞，进而破坏肿瘤组织的新生血管，切断肿瘤血液供应，达到抑制肿瘤的目的。此外，该蛋白的表达条件简单，易于纯化，可进行大规模工业化生产，因而，可以该融合蛋白为活性成分制备成抗肿瘤药物。本发明将在医学及生物制药领域发挥重要作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为在大肠杆菌中表达的VEGF₁₂₁-LuffinKDEL的10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图2为大肠杆菌中表达并经纯化的VEGF₁₂₁-LuffinKDEL的10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图3为对照组和试验组给药后不同时间的肿瘤生长曲线

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物技术有限公司完成。

实施例1、具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL编码基因的获得

一、人血管内皮细胞生长因子VEGF₁₂₁编码基因的获得

1、从人肝癌组织中提取总RNA

利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取人肝癌组织的总RNA，方法为：取100mg人肝癌组织(取自解放军总医院)放入无菌玻璃研磨器，加入1mL Trizol试剂，冰浴条件下迅速研磨，吸取上清至无RNA酶的离心管中，4℃、12000g离心10min，吸取上清，加入0.2mL氯仿/1mL Trizol，充分混匀后静置2-3min，然后将水相移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温沉淀10min，然后4℃、7500g离心5min，重复漂洗一次，去除异丙醇后室温干燥5-10min，加入DEPC水溶解RNA沉淀。

2、RT-PCR扩增人血管内皮细胞生长因子VEGF₁₂₁基因

用Invitogen公司的Superscript II反转录酶并按照试剂盒的说明书，以步骤1获得的肝癌总RNA为模板反转录合成其cDNA，然后再取5ul反转录合成的cDNA为模板，在引物VEGF₁₂₁F(上游引物)：5’-ATACATATggCTCCgATggCAgAAggTggCggg和VEGF₁₂₁R(下游引物)：5’-AAATTTACCAATTCCCAgAAAgCCACCgCCCCgCCTCggCTTgTCACATTTTTC(带单下划线碱基为连接肽(序列表中SEQ ID NO：3)部分编码序列)的引导下PCR扩增VEGF₁₂₁基因，50ul PCR反应体系为：10×PCR缓冲液(含15mM MgSO₄)5ul，上、下游特异性引物各50pmol，10mM dNTPs 1ul，pyrobest聚合酶(购白TaKaRa公司)1U，补水至50ul。PCR反应条件为：先94℃ 30sec，55℃ 40sec，72℃1min，共25个循环；然后72℃延伸7分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了长度为400bp的DNA片段，与预期大小一致。回收并纯化该目的片段，将其连接入载体pMD 18-T(TaKaRa公司)中，再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有目的基因的重组质粒，命名为pMD 18-VEGF₁₂₁，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的人血管内皮细胞生长因子VEGF₁₂₁基因。

二、丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin a基因的获得

1、丝瓜籽总RNA的提取

将北京产丝瓜籽置于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，加入TRIzol试剂(Invitrogen公司)，4℃、120,000rpm离心10分钟，取上清，加入200ul氯仿/1mL TRIzol，剧烈振摇15-30秒，室温放置3分钟，再4℃、120,000rpm离心15分钟，取上层水相溶液，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10分钟，4℃120,000rpm离心10分钟，弃上清，加入预冷的75％乙醇(用DEPC水配制)洗涤，放置至沉淀透明后，加入适量的无核酸酶的水溶解沉淀，得到丝瓜籽总RNA，-70℃保存备用。

2、反转录PCR扩增luffin α基因

用Superscript II反转录酶(Invitogen公司)并参照说明书，取1ug步骤1获得的丝瓜籽总RNA作模板，反转录合成其cDNA。结束后，取5ul反转录产物作模板，在上游引物Luffin-linker(F1)：5’-ggAgAgATAATgAATTCAggCggTggCTTTCTgggATCCgCTgATgTgAggTTCAgTTTg(带单下划线碱基为连接肽(序列表中SEQ ID NO：3)部分编码序列)和下游引物LuffinKDEL/NotI：5’-gAgTgCggCCgCTCATTACgCAACATTTTgTTTgTAATT(带单下划线碱基为限制性内切酶Not I识别位点，方框内碱基为内质网定位信号(序列表中SEQ ID NO：6)编码序列)的引导下，PCR扩增丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin α基因，PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液5ul，25mM MgSO₄ 6ul，上、下游引物各50pmol，10mM dNTPs 1ul，pyrobest聚合酶1U，补水至反应体系为50ul。PCR反应条件为：先94℃ 30sec，55℃40sec，72℃ 1min，共25个循环；然后72℃延伸7分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小约为800bp，与预期结果相符。

三、具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白VEGF₁₂₁/LuffinKDEL编码基因的扩增

以步骤二的PCR扩增产物为模板，在上游引物Luffin/MAG(F2)：5’-ggCggTggCTTTCTgggAATTggTAAATTTTTgCACTCAgCAAAAAAATTTggAAAAgCTTTTgTgggAgAgATAATgAATTCA和下游引物LuffinKDEL/NotI：5’-gAgTgCggCCgCTCATTACgCAACATTTTgTTTgTAATT(带单下划线碱基为Not I识别位点，方框内碱基为内质网定位信号(序列表中SEQ ID NO：6)编码序列)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 23min，94℃ 30sec，55℃ 40sec，72℃ 60sec，共25个循环。再以此PCR扩增产物和步骤一获得的VEGF₁₂₁基因为模板，用接头一延伸PCR的方法构建其融合基因，扩增引物为VEGF₁₂₁F和LuffinKDEL/NotI，PCR反应条件为：先94℃ 3min，94℃ 30sec，70℃ 10min；然后94℃ 40sec，55℃ 60sec，72℃ 90sec，共25个循环。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果扩增片段大小约为1250bp，与预期结果相符。回收并纯化该目的片段，将其用限制性内切酶Nde I和Not I进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pET30a(Novagen公司)连接，再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli) DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有目的基因的重组质粒，命名为pET30a-VEGF₁₂₁-LuffinKDEL，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的通过连接肽连接的VEGF₁₂₁和丝瓜籽核糖体失活蛋白Luffinα融合蛋白的编码基因，将该基因命名为VEGF₁₂₁-LuffinKDEL，具有序列表中SEQ ID N0：8的核苷酸序列，由1227个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1227位碱基，编码具有序列表中SEQ ID N0：7的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-366位碱基为VEGF₁₂₁的编码序列，自5’端第367-471位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第472-1215位碱基为丝瓜籽核糖体失活蛋白Luffin α的编码序列，自5’端第1215-1227位碱基为内质网定位信号的编码序列。

实施例2、VEGF₁₂₁-LuffinKDEL融合蛋白毒素在大肠杆菌中的表达和纯化

取10mL过夜培养的工程菌接种到1000mL含25ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD＝0.4-0.6，然后加入IPTG至终浓度为1mM，同时以未加IPTG的为对照，继续诱导培养5小时。培养结束后，取500ul菌液，10000g离心2分钟收集菌体，加入50ul上样缓冲液，100℃变性5分钟，12000g离心1分钟，取10ul进行10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为诱导前的菌体蛋白，泳道3为诱导后的菌体蛋白)，经IPTG诱导表达后，获得了分子量为45Kd的重组蛋白，与预期结果一致。

离心收集菌体，将菌体溶于30mL 10mM Tris·HCl(pH6.5)中，加入溶菌酶(购自SIGMA公司)至终浓度1mg/mL，蛋白酶抑制剂PMSF(购自SIGMA公司)至终浓度100ug/mL，室温放置30分钟，冰浴，超声破碎10分钟，离心，收集沉淀，将沉淀溶于6M盐酸胍中，按照Ni-NTA树脂的操作说明纯化蛋白，对所纯化的蛋白进行10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳完成后，考马斯亮蓝染色，脱色，检测结果如图2所示(泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为纯化后的融合蛋白)，表明经纯化获得了纯度较高的目的蛋白，将纯化蛋白于-20℃保存。

实施例3、抑瘤实验

取5周龄Balb/c裸鼠，雌性，体重为18-20g，随机分为2组，每组5只。体外培养A375细胞，每只裸鼠注射5×10⁵人黑色素瘤A375癌细胞，以接种肿瘤当天为第一天，第三天给药，剂量为15mg VEGF₁₂₁-LuffinKDEL/kg体重，以注射相同体积的生理盐水(saline)为对照。在不同时间测量对照组和试验组(VEGF₁₂₁-LuffinKDEL)小鼠肿瘤的大小。对结果数据进行一个重复测量的两因素设计的方差分析，结果较对照组(saline)，VEGF₁₂₁-LuffinKDEL组的P＜0.05，表明两组间的差别具有显著统计学意义。根据每组小鼠肿瘤大小的平均值绘出对照组(saline)和试验组(VEGF₁₂₁-LuffinKDEL)给药后不同时间的肿瘤生长曲线，生长曲线如图3所示，表明本发明的融合蛋白VEGF₁₂₁-LuffinKDEL对肿瘤的生长具有显著的抑制作用。

序列表

<160>8

<210>1

<211>277

<212>PRT

<213>葫芦科植物丝瓜(Luffa cylindrica)

<400>1

Met Lys Arg Phe Thr Val Leu Ile Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Ser

1               5                   10                  15

Thr Val Glu Ala Asp Val Ser Phe Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr

            20                  25                  30

Ser Tyr Ser Lys Phe Ile Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ser Asn

        35                  40                  45

Gly Thr Val Tyr Asn Ile Thr Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala

    50                  55                  60

Ser Arg Tyr Thr Leu Met Thr Leu Ser Asn Tyr Asp Gly Lys Ala Ile

65                  70                  75                  80

Thr Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Val

                85                  90                  95

Asn Ser Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ser Asp Ala Lys Leu Ala Ser

            100                 105                 110

Gln Tyr Val Phe Lys Gly Ser Thr Ile Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly

        115                 120                 125

Asn Tyr Glu Lys Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Lys Ile

    130                 135                 140

Pro Leu Gly Phe Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe His

145                 150                 155                 160

Tyr Asp Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Phe Leu Val Ile Ile Gln Thr

                165                 170                 175

Thr Ala Glu Ala Ser Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Gly Gln Ile Ile Glu

            180                 185                 190

Arg Ile Ser Lys Asn Gln Val Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu

        195                 200                 205

Ash Glu Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Leu Ala Gln Thr Ash

    210                 215                 220

Asn Gly Thr Phe Lys Thr Pro Val Val Ile Thr Asp Asp Lys Gly Gln

225                 230                  235                240

Arg Val Glu Ile Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val Thr Lys Asn Ile

                245                 250                 255

Gln Leu Leu Leu Asn Tyr Lys Gln Asn Val Ala Ala Phe Asp Glu Asp

            260                 265                 270

Ile Pro Ala Lys His

        275

<210>2

<211>831

<212>DNA

<213>葫芦科植物丝瓜(Luffa cylindrica)

<400>2

atgaagagat ttacagtgct aattctcgcc atcttccttg cagcttcaac tgttgaagcc     60

gatgtgagct tcagtttgtc aggttcttcc tccacatctt atagcaagtt catcggagat    120

ctgaggaaag cacttccatc taatgggaca gtctacaaca taactctctt actctcctct    180

gcttcgggcg caagccgcta cactctcatg acactctcca attacgacgg caaagccatc    240

acggttgctg tagatgtaac caacgtttac attatgggct atctcgtcaa ttcaacatcc    300

tacttcttca acgagtctga tgctaaatta gcttctcaat acgtattcaa aggcagtacc    360

atcgtcacgc ttccatattc tggcaattac gaaaagcttc aaactgctgc aggcaagata    420

agagagaaga ttccacttgg attcccagct ttggacagtg cgattaccac cttgtttcat    480

tacgactcca cggctgctgc tgcggcattc ctcgtaatca ttcagaccac tgctgaggct    540

tccagattca agtatatcga gggacagatt attgagagaa tttcgaaaaa ccaggtgccg    600

agtctggcga ctataagttt agaaaacgaa tggtctgctc tctccaaaca aattcagttg    660

gcacagacga ataacggaac gtttaaaact cccgttgtga taacggacga taaaggccaa    720

cgagttgaaa taaccaacgt tacgtcgaaa gttgtaacca agaacatcca attgcttcta    780

aattacaaac aaaatgttgc ggcttttgac gaggatattc ctgcaaaaca c             831

<210>3

<211>35

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Gly Gly Gly Phe Leu Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys

1               5                   10                  15

Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Asn Ser Gly Gly Gly Phe

            20                  25                  30

Leu Gly Ser

        35

<210>4

<211>405

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val

1               5                   10                  15

Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr

            20                  25                  30

Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe

        35                  40                  45

Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp

    50                  55                  60

Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln

65                  70                  75                  80

Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser

                85                  90                  95

Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala

            100                 105                 110

Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Gly Gly Phe Leu Gly

        115                 120                 125

Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val

    130                 135                 140

Gly Glu Ile Met Asn Ser Gly Gly Gly Phe Leu Gly Ser Ala Asp Val

145                 150                 155                 160

Arg Phe Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Ser Lys Phe Ile

                165                 170                 175

Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ser Asn Gly Thr Val Tyr Asn Ile

            180                 185                 190

Thr Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala Ser Arg Tyr Thr Leu Met

        195                 200                 205

Thr Leu Ser Asn Tyr Asp Gly Lys Ala Ile Thr Val Ala Val Asp Val

    210                 215                 220

Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Val Asn Ser Thr Ser Tyr Phe

225                 230                 235                 240

Phe Asn Glu Ser Asp Ala Lys Leu Ala Ser Gln Tyr Val Phe Lys Gly

                245                 250                 255

Ser Thr Ile Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Lys Leu Gln

            260                 265                 270

Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Lys Ile Pro Leu Gly Phe Pro Ala

        275                 280                 285

Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe His Tyr Asp Ser Thr Ala Ala

    290                 295                 300

Ala Ala Ala Phe Leu Val Ile Ile Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ser Arg

305                 310                 315                 320

Phe Lys Tyr Ile Glu Gly Gln Ile Ile Glu Arg Ile Ser Lys Asn Gln

                325                 330                 335

Val Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu Asn Glu Trp Ser Ala Leu

            340                 345                 350

Ser Lys Gln Ile Gln Leu Ala Gln Thr Asn Asn Gly Thr Phe Lys Thr

        355                 360                 365

Pro Val Val Ile Thr Asp Asp Lys Gly Gln Arg Val Glu Ile Thr Asn

    370                 375                 380

Val Thr Ser Lys Val Val Thr Lys Asn Ile Gln Leu Leu Leu Asn Tyr

385                 390                 395                 400

Lys Gln Asn Val Ala

                405

<210>5

<211>1215

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

atggctccga tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat     60

gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac    120

cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc    180

tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag    240

attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt cctacagcac    300

aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcaagac aagaaaaatg tgacaagccg    360

aggcggggcg gtggctttct gggaattggt aaatttttgc actcagcaaa aaaatttgga    420

aaagcttttg tgggagagat aatgaattca ggcggtggct ttctgggatc cgctgatgtg    480

aggttcagtt tgtcaggttc ttcctccaca tcttatagca agttcatcgg agatctgagg    540

aaagcacttc catctaatgg gacagtctac aacataactc tcttactctc ctctgcttcg    600

ggcgcaagcc gctacactct catgacactc tccaattacg acggcaaagc catcacggtt    660

gctgtagatg taaccaacgt ttacattatg ggctatctcg tcaattcaac atcctacttc    720

ttcaacgagt ctgatgctaa attagcttct caatacgtat tcaaaggcag taccatcgtc    780

acgcttccat attctggcaa ttacgaaaag cttcaaactg ctgcaggcaa gataagagag    840

aagattccac ttggattccc agctttggac agtgcgatta ccaccttgtt tcattacgac    900

tccacggctg ctgctgcggc attcctcgta atcattcaga ccactgctga ggcttccaga    960

ttcaagtata tcgagggaca gattattgag agaatttcga aaaaccaggt gccgagtctg   1020

gcgactataa gtttagaaaa cgaatggtct gctctctcca aacaaattca gttggcacag   1080

acgaataacg gaacgtttaa aactcccgtt gtgataacgg acgataaagg ccaacgagtt   1140

gaaataacca acgttacgtc gaaagttgta accaagaaca tccaattgct tctaaattac   1200

aaacaaaatg ttgcg                                                    1215

<210>6

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Lys Asp Glu Leu

1

<210>7

<211>409

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

Met Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val

1               5                   10                  15

Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr

            20                  25                  30

Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe

        35                  40                  45

Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp

    50                  55                  60

Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln

65                  70                  75                  80

Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser

                85                  90                  95

Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala

            100                 105                 110

Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Gly Gly Phe Leu Gly

        115                 120                 125

Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val

    130                 135                 140

Gly Glu Ile Met Asn Ser Gly Gly Gly Phe Leu Gly Ser Ala Asp Val

145                 150                 155                 160

Arg Phe Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Ser Lys Phe Ile

                165                 170                 175

Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ser Asn Gly Thr Val Tyr Asn Ile

            180                 185                 190

Thr Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala Ser Arg Tyr Thr Leu Met

        195                 200                 205

Thr Leu Ser Asn Tyr Asp Gly Lys Ala Ile Thr Val Ala Val Asp Val

    210                 215                 220

Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Val Asn Ser Thr Ser Tyr Phe

225                 230                 235                 240

Phe Asn Glu Ser Asp Ala Lys Leu Ala Ser Gln Tyr Val Phe Lys Gly

                245                 250                 255

Ser Thr Ile Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Lys Leu Gln

            260                 265                 270

Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Lys Ile Pro Leu Gly Phe Pro Ala

        275                 280                 285

Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe His Tyr Asp Ser Thr Ala Ala

    290                 295                 300

Ala Ala Ala Phe Leu Val Ile Ile Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ser Arg

305                 310                 315                 320

Phe Lys Tyr Ile Glu Gly Gln Ile Ile Glu Arg Ile Ser Lys Asn Gln

                325                 330                 335

Val Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu Asn Glu Trp Ser Ala Leu

            340                 345                 350

Ser Lys Gln Ile Gln Leu Ala Gln Thr Asn Asn Gly Thr Phe Lys Thr

        355                 360                 365

Pro Val Val Ile Thr Asp Asp Lys Gly Gln Arg Val Glu Ile Thr Asn

    370                 375                 380

Val Thr Ser Lys Val Val Thr Lys Asn Ile Gln Leu Leu Leu Asn Tyr

385                 390                 395                 400

Lys Gln Asn Val Ala Lys Asp Glu Leu

                405

<210>8

<211>1227

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

atggcaccga tggcagaagg aggagggcag aatcatcacg aagtggtgaa gttcatggat     60

gtctatcagc gcagctactg ccatccaatc gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac    120

cctgatgaga tcgagtacat cttcaagcca tcctgtgtgc ccctgatgcg atgcgggggc    180

tgctgcaatg acgagggcct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag    240

attatgcgga tcaaacctca ccaaggccag cacataggag agatgagctt cctacagcac    300

aacaaatgtg aatgcagacc aaagaaagat agagcaagac aagaaaaatg tgacaagccg    360

aggcggggcg gtggctttct gggaattggt aaatttttgc actcagcaaa aaaatttgga    420

aaagcttttg tgggagagat aatgaattca ggcggtggct ttctgggatc cgctgatgtg    480

aggttcagtt tgtcaggttc ttcctccaca tcttatagca agttcatcgg agatctgagg    540

aaagcacttc catctaatgg gacagtctac aacataactc tcttactctc ctctgcttcg    600

ggcgcaagcc gctacactct catgacactc tccaattacg acggcaaagc catcacggtt    660

gctgtagatg taaccaacgt ttacattatg ggctatctcg tcaattcaac atcctacttc    720

ttcaacgagt ctgatgctaa attagcttct caatacgtat tcaaaggcag taccatcgtc    780

acgcttccat attctggcaa ttacgaaaag cttcaaactg ctgcaggcaa gataagagag    840

aagattccac ttggattccc agctttggac agtgcgatta ccaccttgtt tcattacgac    900

tccacggctg ctgctgcggc attcctcgta atcattcaga ccactgctga ggcttccaga    960

ttcaagtata tcgagggaca gattattgag agaatttcga aaaaccaggt gccgagtctg   1020

gcgactataa gtttagaaaa cgaatggtct gctctctcca aacaaattca gttggcacag   1080

acgaataacg gaacgtttaa aactcccgtt gtgataacgg acgataaagg ccaacgagtt   1140

gaaataacca acgttacgtc gaaagttgta accaagaaca tccaattgct tctaaattac   1200

aaacaaaatg ttgcgaaaga tgaactg                                       1227