苇状羊茅与多年生黑麦草内生真菌实时荧光PCR检测方法

具体实施方式

实施例1：牧草内生真菌近缘种的收集培养以及进境草种中N.coenophialum和N.lolii的分离培养；

实验涉及的菌株包括购自美国菌种库的N.coenophialum和N.lolii及其近似种N.huerfanum、N.chisosum、N.aotearoae、N.sp.，以及本实验室分离培养的N.coenophialum和N.lolii共6种14个菌株，见表1。

                            表1：供试菌株

1.苇状羊茅内生真菌N.coenophialum和黑麦草内生真菌N.lolii的培养

将表面消毒后的种子置于马铃薯培养基(PDA)上，每皿均匀放置5粒，将培养皿置于24℃条件下避光培养，4周后开始观察。根据菌落特征、分生孢子梗和分生孢子的特征，检查出苇状羊茅内生真菌(N.coenophialum)和多年生黑麦草内生真菌(N.lolii)的菌落，进行转接培养，4周后收集菌丝供DNA提取。

2.近似种的培养

对购自美国菌种保藏库的菌株用马铃薯培养基(PDA)进行培养，培养温度为24℃，培养时间4周，收集菌丝供DNA提取。

实施例2：进境草种携带N.coenophialum和N.lolii的苯胺蓝染色镜检

实验涉及的种子包括近年来天津口岸入境的苇状羊茅和多年生黑麦草种子，各4个品种，见表2。

表2：供试种子

1.溶液配制

5％的NaOH溶液：NaOH 25克、苯胺蓝0.5克、蒸馏水500mL。

染色溶液：苯胺蓝0.4克、乳酸50mL、苯酚(溶解的)50mL、蒸馏水250mL。

2.种子处理

将供试种子充分混匀，随机取200粒，然后置于50mL的三角瓶中，倒入20-30mL5％的NaOH溶液(浸没种子为适量)，在室温下浸泡15个小时左右(时间不要太长)。倒掉溶液，将种子用蒸馏水冲洗1分钟后，将水控净。在种子中加入20-30mL染色溶液(浸没种子为宜)，将三角瓶放在热板上缓慢加热煮沸15分钟(加热时最好放在通风橱中)。停止加热后，用蒸馏水将种子冲洗干净，将种子保存在干净的蒸馏水中置于4℃冷藏箱待检。

3.显微镜检查

取一粒供试种子放在载玻片上，用挑针剥去颖壳及种皮。加一滴蒸馏水，然后盖上盖玻片。轻轻挤压，使组织细胞分散开，显微镜观察。种子中内生真菌菌丝主要存在于糊粉层中，在显微镜下观察，苇状羊茅内生真菌和多年生黑麦草内生真菌菌丝直径均匀，细线状，弯曲，有分隔。用苯胺蓝染色后，内生真菌菌丝为蓝色，在分隔处有缢缩现象，分隔处不着色，极少分枝。

实施例3：菌丝基因组DNA和单粒种子中N.coenophialum和N.lolii的基因组DNA提取

菌丝基因组DNA和单粒种子中N.coenophialum和N.lolii的基因组DNA的提取采用上海生工基因组DNA纯化试剂盒(编号SK1252)。

实施例4：通用探针及引物和特异探针及引物的设计

探针和引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。

1.通用探针及引物

人工合成Neotyphodium屑内生真菌的通用探针及引物，探针和引物均为5→3方向，下同。

探针：Tub-2-probe： FAM-TTC TGG CAG ACC ATC TCT GGC GA-TAMRA。

引物：Tub-2-F：AGC TCG GAG GTA CCA TTG TA，

Tub-2-R：TCA AAC CGG TCA GTG CGT AA。

2.特异探针及引物

N.coenophialum的特异探针：

nc-probe：FAM-CTT CAA GAT CCG TTA CTC GG-TAMRA。

N.lolii的特异探针：

nl-probe：JOE-TCA AAA TGC CTT ACA AGG GAG CCG-TAMRA。

这两条探针的共用引物：

F2：GGC AGA GAT GTC GTT CAG GAA，

R2：CCT GAA CGT CAT CTC CGT CAA。

实施例5：菌丝基因组DNA的荧光PCR检测

荧光PCR试剂是TaKaRa公司的ExTaq^TMR-PCR version 2.1试剂盒，实时荧光PCR仪是ABI7000型，荧光PCR管和管盖购自ABI公司。

1.通用探针的单色荧光PCR

1.1 PCR反应混合液配制

反应混合液体积为25μL；0.2μL ExTaqDNA聚合酶(5U/μL)、10×PCR buffer和MgCl₂共计2.5μL、0.5μL四种dNTP混合物(初始浓度均为2.5mmol/L)、引物(Tub-2-F～Tub-2-R)各为0.4μL(初始浓度均为20umol/L)、0.5μL荧光探针Tub-2-probe(初始浓度均为20umol/L)、0.25μL样品基因组DNA，阴性对照管的模板为0.25μL双蒸水。

1.2 PCR反应程序为

95℃    预变性5分钟；

95℃    变性15秒；

60℃    退火延伸1分钟，循环45次；

退火、延伸阶段采集数据。

1.3结果分析

在ABI公司提供的分析软件SDS version 2.0的Analyze界面下选择FAM荧光标记，标准菌株(TJN4、TJN5、TJN9)，近似种(TJN10、TJN11、TJN12、TJN13、TJN14)和部分供试N.coenophialum(TJN1、TJN2、TJN3)和N.lolii菌株(TJN6、TJN7、TJN8)的ΔRn曲线出现阳性增长，阴性对照的ΔRn曲线为一条平的直线，结果表明该探针能很好检测Neotyphodium属的N.coenophialum、N.lolii、N.huerfanum、N.chisosum、N.aotearoae和N.sp.，见图1。图1中曲线部分按右侧端从上至下分别为：TJN5、TJN14、TJN9、TJN2、TJN7、TJN4、TJN11、TJN1、TJN8、TJN12、TJN3、TJN6、TJN10和TJN13，平的直线为双蒸水阴性对照。

2.特异探针的双色荧光PCR

2.1 PCR反应混合液配制

反应混合液体积为25μL；0.2μExTaqDNA聚合酶(5U/μL)、10×PCR buffer和MgCl₂共计2.5μL、0.5μL四种dNTP混合物(初始浓度均为2.5mmol/L)、引物(F2～R2)各为0.4μL(初始浓度均为20umol/L)、荧光探针为nc-probe和nl-probe(初始浓度均为20umol/L)，各0.5μL、0.25μL样品基因组DNA，阴性对照管的模板为0.2μL双蒸水。

2.2 PCR反应程序为

95℃    预变性5分钟；

95℃    变性15秒；

60℃  退火延伸1分钟，循环45次；

退火、延伸阶段采集数据。

2.3结果分析

在ABI公司提供的分析软件SDS version2.0的在Analyze界面下选择FAM荧光标记，近似种(TJN10、TJN11、TJN12、TJN13、TJN14)和部分N.lolii菌株(TJN6、TJN7、TJN8、TJN9)以及阴性对照的ΔRn曲线都没有出现增长，为一条平的直线，而N.coenophialum菌株(TJN1、TJN2、TJN3、TJN4和TJN5)的ΔRn曲线出现增长，结果表明nc-probe对N.coenophialum是特异的，见图2。图2中曲线部分按右侧端从上至下分别为：TJN5、TJN2、TJN4、TJN1和TJN3，平的多条直线为TJN6～14和阴性对照。

当选择JOE荧光标记时，近似种(TJN10、TJN11、TJN12、TJN13、TJN14)和部分N.coenophialum菌株TJN1、TJN2、TJN3、TJN4和TJN5，以及阴性对照的ΔRn曲线都没有出现增长，为一条平的直线，而N.lolii菌株(TJN6、TJN7、TJN8、TJN9)的ΔRn曲线出现增长，说明hl-probe能特异检测N.lolii，见图3。图3中曲线部分按右侧端从上至下分别为：(TJN8、TJN7、TJN9、TJN6)平的多条直线为阴性对照TJN1～5、10～14，以及阴性对照。实施例6：单粒种子中N.coenophialum和N.lolii的基因组DNA的荧光PCR检测

1.通用探针的单色荧光PCR

混合液的配制及热循环参数设置同菌丝DNA的通用探针的单色荧光PCR，但单粒种子的模板DNA改为1.5μL，Analyze界面下选择FAM荧光标记，近似种(TJN10、TJN11、TJN12、TJN13、TJN14)、标准菌株N.coenophialum(TJN4和TJN5)、N.lolii(TJN9)和含内生真菌的种子DNA样品1、2、3、5、6、7的ΔRn曲线出现增长，阴性对照和不含内生真菌种子4和8的ΔRn曲线为一条平的直线。见图4。图4中曲线部分按右侧端从上至下分别为：TJN5、TJN14、TJN9、TJN4、TJN11、TJN12、TJN10和TJN13，以及种子样品2、5、1、7、6、3，平的多条直线为阴性对照。

2.特异探针的双色荧光PCR

混合液的配制及热循环参数设置同菌丝DNA的特异探针的双色荧光PCR，但单粒种子的模板DNA改为1.5μL，Analyze界面下选择FAM荧光标记时，标准菌株N.coenophialum(TJN4、TJN5)、和种子1、2、3的ΔRn曲线出现增长，而标准菌株N.lolii(TJN9)，近似种(TJN10、TJN11、TJN12、TJN13、TJN14)，种子4、5、6、7、8及阴性对照的ΔRn曲线为一条平的直线，见图5。图5中曲线部分按右侧端从上至下分别为：TJN5、TJN4，以及种子样品2、1、3，平的多条直线为TJN9～14和种子样品4～8以及阴性对照。

选择JOE荧光标记时，标准菌株N.lolii(TJN9)和种子5、6、7的ΔRn曲线出现增长，而标准菌株N.coenophialum(TJN4和TJN5)，近似种(TJN10、TJN11、TJN12、TJN13、TJN14)，种子1、2、3、4、8及阴性对照的ΔRn曲线为一条平的直线，见图6。图6中曲线部分按右侧端从上至下分别为：TJN9和种子样品5、7、6，平的多条直线为：TJN4、TJN5、TJN10～14和阴性对照。

本发明使用Neotyphodium属的通用探针及引物进行单色荧光PCR反应，实现质量控制，检查所抽提的基因组DNA质量，避免实验过程中的假阴性。使用N.coenophialum和N.lolii各自的特异探针及共同引物进行双色荧光PCR反应，建立了N.coenophialum和N.lolii快速简便、特异性强、灵敏度高的实时荧光PCR检测体系，既可以用于经分离培养的内生真菌菌丝的鉴定，又可以用于携带内生真菌的种子的直接检测，灵敏度达到一粒种子，检测时间由至少一个月缩短至7-8小时，特别是从带菌单粒种子中检测出内生真菌，为直接应用于口岸对进境草种传带N.coenophialum和N.lolii的检测，以及国内外畜牧业种子和草坪草种子中有毒内生真菌N.coenophialum和N.lolii的检测创造了技术条件。

                        序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120>用实时荧光PCR技术检测苇状羊茅和多年生黑麦草内生真菌的方法

<130>20070426

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

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<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

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<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

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<400>7

cctgaacgtc atctccgtca a                                                               21