法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-08-29
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/52 授权公告日:20100217 终止日期:20110627 申请日:20070627
专利权的终止
2010-02-17
授权
授权
2008-03-19
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-01-30
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术领域和遗传工程领域，涉及从一种海洋微藻——绿色巴夫藻(Pavlova viridis)中克隆C20多不饱和脂肪酸延伸酶基因，具体讲是绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列以及将该基因直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物中，利用其编码的C20多不饱和脂肪酸延伸酶产生长链多不饱和脂肪酸的方法和应用。
背景技术
多不饱和脂肪酸碳链延伸酶(polyunsaturated fatty acid elongase)是脂肪酸碳链延伸中参与C18-C22多不饱和脂肪酸的碳链延伸反应的一类酶，是合成长链多不饱和脂肪酸的前提，它催化供体(乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A)的两个碳原子引入多不饱和脂肪酸碳链中增加其碳链长度，如ALA，EPA和DHA合成途径中的C18多不饱和脂肪酸碳链延伸酶(Δ6脂肪酸碳链延伸酶)，C20多不饱和脂肪酸碳链延伸酶(Δ5脂肪酸碳链延伸酶)以及C22多不饱和脂肪酸碳链延伸酶(Δ7脂肪酸碳链延伸酶)，它们均属于膜结合蛋白。根据已经克隆的延伸酶序列分析，可分为两大家族，一类是参与PUFA(polyunsaturated fatty acid)合成的ELO家族，一类是在植物中广泛存在，参与种子油脂和蜡质合成的KCS/FAE家族。脂肪酸碳链延伸酶具有保守的结构特征：5～6个跨膜结构域、1个保守的组氨酸活性部位(HXXHH)以及在蛋白的羧基端内质网滞留信号的双赖氨酸结构。C20多不饱和脂肪酸延伸酶具有催化二十碳五烯酸(EPA)生成二十二碳五烯酸(DPA)的功能，由于目前对膜蛋白的分离纯化以及功能鉴定尚存在困难，大多从编码这些酶的基因特点进行研究。2002年，Baoxiu Qi等人从海洋微藻等鞭金藻(Isochrysisgalbana)中克隆得到一个多不饱和脂肪酸碳链延伸酶基因，命名为lgASE1，它编码的蛋白由263个氨基酸组成，分子量为30KDa。亲水性分析表明，该基因编码的蛋白具有多次跨膜区，碳末端具有内质网定位信号。将该基因克隆到酿酒酵母细胞中，其表达蛋白对C18-Δ9多不饱和脂肪酸具有特异催化活性，如将ALA(C18：3n-3，Δ9，12，15)和LA(C18：2n-6，Δ9，12)分别沿ω-3(Δ8)途径和ω-6(Δ8)途径进行碳链延伸转化生成EtrA(C20：3n-3，Δ11，14，17)和EDA((C20：2n-6，Δ11，14)。这是有关C18-Δ9多不饱和脂肪酸具有特异性延伸活性的延伸酶基因进行功能鉴定的首次报道。2004年，Suzette L等从海洋微藻巴夫藻(Pavlova sp.)中利用表达序列标签(expressed sequence tag)法克隆得到新的延伸酶基因，命名为pavELO，其基因表达产物表现了独有的对n-6和n-3C20多不饱和脂肪酸的底物特异性，但对C18和C22多不饱和脂肪酸没有活性，并可在酵母中催化EPA生成DPA。序列对比分析表明该基因与哺乳动物的PUFA延伸酶的氨基酸序列同源性较高，表明该蛋白具有延伸酶家族典型的保守结构域。2006年，Masataka，Kajikawa等人从苔藓植物沙洲草中克隆到C20长链不饱和脂肪酸延伸酶基因MpELO2，该基因在沙洲草中编码类似于ELO脂肪酸链长延伸酶基因。酵母中的异源性表达表明MpELO2基因编码Δ5脂肪酸链延伸酶，这种酶特异的作用于ALA和EPA。所述延伸酶基因有些申请了专利，2003年中国专利01804692.4公开了德国专利“新延伸酶基因以及制备多不饱和脂肪酸的方法”。
由于人体不能合成多不饱和脂肪酸，只能从膳食中摄取，多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)在营养强化、促进大脑发育、降血压、防止动脉粥样硬化等方面具有重要作用，目前深海鱼类是EPA及DHA的主要商业来源。
由于鱼类资源有限，通过对脂肪酸去饱和酶和碳链延伸酶基因的克隆，实现基因的异体高效表达，从而得到大量低成本的多不饱和脂肪酸，为解决EPA，DHA的资源匮乏提供了一条新途径。绿色巴夫藻(Pavlova viridis)是一种单细胞真核海洋微藻，富含EPA和DHA。但是，经文献检索利用从绿色巴夫藻中分离到催化二十碳四烯酸(EPA)生成二十二碳四烯酸(DPA)的延伸酶基因elkj，且实现在E.coli中的活性表达的研究还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的一个目的是提供从海洋微藻——绿色巴夫藻(Pavlova viridis)中克隆C20多不饱和脂肪酸延伸酶基因，具体讲是绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列以及将该基因直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物中，利用其编码的C20多不饱和脂肪酸延伸酶产生长链多不饱和脂肪酸的方法和应用。
本发明的再一个目的是提供绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列所编码的C20多不饱和脂肪酸延伸酶多肽或其片段、类似物或衍生物。
本发明的又一个目的是提供含有绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列与异源调节序列连接，进行功能性表达的重组载体。
本发明的又一个目的是提供含有绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组载体转化或转导的宿主细胞及其后代。
本发明的还一个目的是提供一种用含有绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞或该核苷酸序列所编码的C20多不饱和脂肪酸延伸酶多肽制备不饱和脂肪酸的方法。
本发明的分离自绿色巴夫藻的C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列，其特征在于，它是具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
上述的核苷酸序列是编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
上述的核苷酸序列选自下组：
(a)编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列；
(b)与核苷酸(1)互补的核苷酸序列；
(c)与(a)和(b)至少又有65％的相同性的核苷酸序列。
上述的核苷酸序列优选是具有SEQID NO：1中的1bp-1197bp的核苷酸序列或具有SEQ ID NO：1中的71-1105bp的核苷酸序列。
本发明的绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列，长度是1197bp，其中71bp-1015bp为编码C20多不饱和脂肪酸延伸酶成熟多肽SEQ ID NO：2的开放阅读框，1bp-70bp为5’转录非翻译区序列，1016bp-1197bp为3’转录非翻译区序列。
本发明提供的多肽，其特征在于，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该多肽包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其片段、或其保守性变异多肽、或其衍生类似物。准确地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽或其氨基酸变异不超过30％的衍生物。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本发明所述的绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列，该核苷酸序列基本由编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列组成。编码SEQ ID NO：2活性多肽的核苷酸序列包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列”是指包括编码C20多不饱和脂肪酸延伸酶多肽的核苷酸序列和包括附加编码和/或非编码的核苷酸序列。
本发明提供的表达载体，其特征在于，它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒、噬菌体所构建的能进行功能性表达的重组载体。
本发明涉及含有编码绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列和外源性调节序列元件结合进行功能性表达的重组表达载体。这里的“载体”是指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。能够影响基因表达产物的序列元件包括有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
本发明提供的基因工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自于下列一种宿主细胞；
(a)它是用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；
(b)它是用权利要求6所述的重组载体转化或转导的宿主细胞。
其中，上述的宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或这些宿主细胞的后代。
本发明涉及编码绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列或含有该核苷酸序列的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸序列或重组载体的基因工程化宿主细胞。宿主细胞的代表性例子有：大肠杆菌、真核细胞如酵母菌、植物细胞如大豆、烟草；动物细胞如CHO、COS细胞等。
本发明所述的分离自绿色巴夫藻的C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列在制备不饱和脂肪酸中的应用。
利用本发明提供的含有绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞或该核苷酸序列所编码的C20多不饱和脂肪酸延伸酶多肽可以制备不饱和脂肪酸。
用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期收集菌体，用CaCl2法处理，所用的步骤是在本领域是中所周知的。也可用MgCl2，电穿孔法进行。
本发明还涉及用上述转基因宿主细胞生产，根据宿主细胞，用本领域技术人员所公知的方法生长或培养。在培养之后，收集细胞，捣碎或直接使用，通过本领域技术人员熟知的方法从细胞中提取脂肪酸。
本发明还涉及一种制备不饱和脂肪酸的方法，该方法是：将EPA或含有EPA的化合物与SEQ ID NO：2一起培养。该方法优选是在由能够摄取或释放还原性等同物的化合物存在条件下进行的。
利用本发明方法制备的不饱和脂肪酸能广泛应用于生产乳制品、食品、保健品领域。
本发明的核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：2所示的编码区序列相同或是简并变异体。
“简并变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽，但与SEQID NO：1所示的有差异的核苷酸序列。
本发明所用“分离”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的核苷酸序列或多肽没有分离纯化的，但同样的核苷酸序列或多肽如从天然状态中与同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
本文所用“分离的核苷酸序列”是指基本上不含天然与其相关的其他蛋白、脂类、糖类或其他物质。本领域的技术人员能用标准的DNA纯化技术纯化。
本发明的其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本发明从绿色巴夫藻中分离到催化二十碳四烯酸(EPA)生成二十二碳四烯酸(DPA)的延伸酶基因elkj，该基因大小为945bp，推测编码的蛋白质由314个氨基酸组成，同源性比对证实为一新的延伸酶基因，且实现了在E.coli的活性表达，为利用工程菌株低成本生产多不饱和脂肪酸奠定了基础。
附图说明
图1显示TMHMM推测的绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的跨膜域。
其中1：穿膜区 2：胞内区 3：胞外区
图2显示本发明的绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶和巴夫藻(Pavlova sp.CCMP459)的C20脂肪酸延伸酶(AAV33630)的氨基酸序列同源性比较图。
其中elkj：本发明的绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶氨基酸序列，
pavELO：巴夫藻(Pavlova sp.CCMP459)的C20脂肪酸延伸酶(AAV33630)的氨基酸序列。
图3显示所构建的大肠杆菌重组表达载体p22ELKJ。
图4显示含pET22空载体的转基因大肠杆菌(red)和含重组质粒p22EL的转基因大肠杆菌(black)的气相色谱图。
曲线a：重组大肠杆菌DE3产生的延伸酶对EPA的转化作用
曲线b：大肠杆菌DE3对EPA的转化作用
保留时间：EPA 17.40min，DPA 20.30min。
具体实施方式
实施例1从绿色巴夫藻(P.viridis)中克隆C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列
将P.viridis在f/2海水培养基中培养至指数生长期(约3天)，3000rpm 4℃离心收集200mL藻体，加入液氮研磨至粉状，利用QIAGEN RNeasy mini kit，按照试剂盒(Qiagen，USA)提供的RNeasy Plant Mini Protocol提取总RNA，取1μg总RNA做模板，按RNA PCR Kit(Takara Bio，China)要求，反转录合成cDNA第一链；根据已报道的不同脂肪酸延伸酶基因的保守区设计引物-引物P1F和引物P1R，分别对应保守的氨基酸序列SFLHVYHH和YLTQAQLVQF。以上述合成的cDNA为模板进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：
引物P1F：5’-TCCTTCCTCCACGTCTATCATCAC-3’
引物P1R：5’-ACGAGCTGTGCCTGCGTGAGGT-3’
反应组分 加入量
10×buffer 2.0μL
25mM MgCl2 1.2μL
10mM dNTP 2.4μL
cDNA 0.1μL
10μM P1F 0.8μL
10μM P1R 0.8μL
Taqase 0.1μL
ddH2O 12.6μL
总体积 20μL
PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环，然后72℃延伸10min。
电泳检测结果显示，得到了大小约为200bp的DNA片断。将PCR产物用琼脂糖凝胶回收Kit(Omegabiotech，USA)回收PCR产物。将回收片段定量后，与pMD18-T(TakaraBio，China)测序载体在16℃连接10h，连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化菌经LB固体平板(100μg/mL Amp；80μg/mL X-gal；0.5mM IPTG)培养，挑取白色单菌落，提取质粒DNA，经EcoRI，PstI双酶切鉴定插入片段大小及PCR鉴定目的片段后，正确克隆进行测序(Biosune，China)。测序结果显示得到大小为197bp，通过其编码的氨基酸序列在GenBank中进行Blast同源性检索，检测结果发现该片段与来自于巴夫藻(AY630573)、小鼠(NP062296)和高山被孢霉(AAF70417)的多不饱和脂肪酸延伸酶具有较高的同源性。并有脂肪酸延伸酶的特征序列，证明该片段为一潜在的延伸酶保守区域。
根据所获得得保守区域的序列，设计基因特异性引物(引物el29和引物el59)，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)分别扩增延伸酶的3’-端和5’-端基因片段。同样先提取藻体的总RNA，利用SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit(Clontech，USA)反转录合成第一链cDNA，用基因特异性引物和试剂盒提供的接头引物，按照PCR扩增试剂盒分别进行3-’和5-’末端序列的PCR扩增。引物el29(3’RACE)：5’-ACAGCGGCAGGTTGAGACGAGTAGCAATG-3’)，引物el59(5’RACE)：5’-TGATGACGATGAACCACGCCCAGATGAGC-3’)
延伸酶基因3’端序列PCR反应体系：10×PCR Bufer 2μL，dNTP 0.4μL，UPM(10×Universal Primer A Mix)2μL，引物el29 0.4μL，50×Polymerase Mix0.4μL，3’RACE-Ready cDNA 1μL，加ddH2O补足20μL反应体系。PCR反应程序：94℃30s，72℃ 3min，5 cycles；94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 3min，5cycles；94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 3min，30Cycles，72℃过度延伸10min。
延伸酶基因5’端序列PCR反应体系：10×PCR Bufer 2μL，dNTP 0.4μL，UPM(10×Universal Primer A Mix)2μL，引物el59 0.4μL，50×Polymerase Mix0.4μL，5’RACE-Ready cDNA 1μL，加ddH2O补足20μL反应体系。PCR反应程序：94℃30s，72℃ 3min，5cycles；94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 3min，5cycles；94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 3min，30Cycles，72℃过度延伸10min。
PCR产物经过上述相同的方法鉴别、测序。序列分析结果显示3‘-RACE扩增获得到了从引物el29到polyA的序列共为641bp的序列信息；通过5‘-RACE扩增得到了从引物el59到末端接头序列之间共550bp的序列。利用DNAstar软件，对获得的延伸酶的5’-端和3‘-端序列进行拼接和连接，得到长度为1197bp的核苷酸序列。序列如SQE ID NO：1所示。其中，71bp-1015bp(ATG…TAA)为潜在的开放阅读框，大小为945bp，编码314个氨基酸，两侧分别为5’非编译区(70bp)和3’非编译区(181bp)。根据两端序列设计特异性引物(els5：5’-GACACTTGAGTTGAGAG-3’和elas1108：5’-GGAGAGTGAGATTCCTTGAC-3’)，按照3’和5’RACE反应条件进行扩增和测序，结果与拼接序列完全一致。
实施例2：所分离核苷酸序列的同源性检索
将推测的绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶elkj的氨基酸序列在GenBank上进行同源性检索，检测结果显示，所得同源性与多不饱和脂肪酸延伸酶的同源性较高，其中，在氨基酸水平上与来自巴夫藻多不饱和脂肪酸延伸酶(AAV33630)的相似性为83％。图2显示本发明的绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶与巴夫藻的pavELO的同源性比对图，(相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸的单字符表示，相似的氨基酸用“*”表示，保守序列用“：”表示)。图2说明本发明所分离的新的酶具有潜在的多不饱和脂肪酸延伸酶功能。
实施例3大肠杆菌重组表达载体的构建
根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，设计一对特异性引物(引物Pf和引物Pr)扩增潜在的阅读框。
上游引物Pf 5’-GGAATTCGCCATGGCCAAGAGCGCGGT-3’
下游引物Pr 5’-CGGGATCCTCATCCCTTTTCGTGCTTTG-3’
此2个引物的5‘端的下划线分别含有Nco I酶切位点和为EcoR I酶切位点。所用的扩增条件和组分实例1中保守区扩增反应相同。PCR产物经Nco I和EcoR I双酶切，DNA回收试剂盒回收，与相同酶切的E.coli载体pET22b在T4连接酶作用下连接，连接产物转化E.coli DH5α，在IPTG和X-gal平板上筛选并鉴定重组子。重组质粒p22ELKJ构建结果如图3。
实施例4重组大肠杆菌的诱导表达
将重组质粒p22ELKJ转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。挑取阳性克隆的单菌落，接种于5mL含有氨苄青霉素终浓度为100μg/mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。以2％接种量接种到5mL含有氨苄青霉素终浓度为200μg/mL的LB液体培养基中，振荡培养至OD值为0.6，更换新鲜TB培养基，加入氨苄青霉素终浓度为200μg/mL，IPTG终浓度1mM诱导外源蛋白表达。同时加入底物EPA或者含有EPA的化合物(如鱼油)25℃继续振荡培养4小时，5000rpm离心5min，收集5mL菌体细胞，PBS缓冲液洗涤。沉淀加入5mL 2M HCL/CH3OH溶液，充N2 5min，100℃水浴1h。待反应结束后，冷却至室温，加入等体积正己烷5mL，剧烈振荡混匀，静置分层。取上层提取液，N2吹干。用200μL正己烷回溶样品，低温冷藏待分析。
实施例5多不饱和脂肪酸的气相色谱分析
GC及GC-MS按如下条件进行：
仪器：岛津GC-7A；
柱子：弹性石英毛细管柱RTX-1
载体及线速：N2，1.1mL/min；
柱温：180℃；
气化室温度：310℃；
程序升温过程：100℃(保留2min)-250℃(10℃/min，保留3min)-310℃(5℃/min，保留5min)
检测器及检测器温度：氢离子火焰检测器，310℃
首先，按照上述程序进行GC-MS，确定各脂肪酸甲酯的保留时间(rentention time)，在同样的条件下，进行重组大肠杆菌诱导表达后的脂肪酸成分GC测定，同时设立空载体的转基因大肠杆菌株作为对照。气相色谱分析结果见图4。图4显示含pET22空载体的转基因大肠杆菌(b)和含重组质粒p22ELKJ的转基因大肠杆菌(a)的气相色谱图。通过两者的比对，以及GC-MS定性分析保留时间鉴定出的各个峰分析：图4中保留时间为17.40min对应的峰(EPA)降低，而保留时间为20.30min对应的峰(DPA)显著升高。即为本发明所分离的C20多不饱和脂肪酸延伸酶催化EPA产生DPA。
序列表
<110>山东大学
<120>绿色巴夫藻C20多不饱和脂肪酸延伸酶的核苷酸序列及应用
<141>2007-6-21
<160>2
<210>1
<211>1105
<212>DNA
<213>绿色巴夫藻(Pavlova viridis)
<400>1
acacttgagt tgagagtttg catctgctcc cgcatctcgc gccggaaagg gcggagacct 60
caagcgcgcc atggccaaga gcgcggtgca acaagaagcg gagcggctga cggccgggct 120
ctggctgccg atgctgctct cggctggcta cctgcttgtg ctctctgcaa atcgcgcgtc 180
cttccacaac aacatcgacc acccgaatgg ggcctactcg acagcctggc ccatcgtgcc 240
gacggcaatg acggcgttct atctggcgat ggtgttcggc cacaccaaat acttcgagtc 300
gcgcaagccg atgagcgggc tgaaggacta catgttcacg tacaacctgt accaggtgat 360
catcaacgtc tggtgcgtcg tcgccttctg cgtcgaggtg aggcgtgcgg gcatgagcgt 420
tatcgggaac aaagtggacc tcggtcccaa ctcgttccgc ctcggcttcg tcacgtgggt 480
gcactacaac aacaagtacg tcgagctgct cgacacgctg tggatggtgc tgcgcaagaa 540
gagctcgcag gtctccttcc tccacgtcta ccaccactgc ctgctcatct gggcgtggtt 600
catcgtcatc aaattcggga acggaggcga cgcctacttc ggaggcatgc tcaactcgct 660
gatccacgtg atgatgtact cgtactacac gatggcgctc ctcggctgga gctgcccgtg 720
gaagcgctac ctgacgcagg cgcagctggt gcagttctgc atctgcctga cgcactcgac 780
gtgggcggcc gtgaccggcg tctacccgtg gaagatctgc ctcgtcgaga tgtgggtgat 840
gatcagcatg ctcgtgctct tcacgcgctt ctacaaccag tcctacgcca aggagaagag 900
cgcgaaggac gcggccgcgc tcttgcaggc gaaggcggcg accgcaaagg cgcaacaaac 960
ctccggcaac ttcgcgccat cattgcgcag gattgcaaag cacgaaaagg gatgagcggc 1020
cctgaggcac acagcggttt attcggtttt gcaatcatca tgaatcagca aacaccgcag 1080
gtcaaggaat ctcactctcc ggggccaagg ctggctcggt ggtccgtgat gccatcaacc 1140
ttgctatcgc tcagcatcaa tggttgcacc gttgctgatg ctaatcacta atgatc 1196
<210>2
<211>314
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Met Ala Lys Ser Ala Val Gln Gln Glu Ala Glu Arg Leu Thr Ala Gly Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15 20
Met Leu Leu Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Val Leu Ser Ala Asn Arg Ala Ser Phe His Asn
21 25 30 35 40
Asn Ile Asp His Pro Asn Gly Ala Tyr Ser Thr Ala Trp Pro Ile Val Pro Thr Ala Met
41 45 50 55 60
Thr Ala Phe Tyr Leu Ala Met Val Phe Gly His Thr Lys Tyr Phe Glu Ser Arg Lys Pro
61 65 70 75 80
Met Ser Gly Leu Lys Asp Tyr Met Phe Thr Tyr Asn Leu Tyr Gln Val Ile Ile Asn Val
81 85 90 95 100
Trp Cys Val Val Ala Phe Cys Val Glu Val Arg Arg Ala Gly Met Ser Val Ile Gly Asn
101 105 110 115 120
Lys Val Asp Leu Gly Pro Asn Ser Phe Arg Leu Gly Phe Val Thr Trp Val His Tyr Asn
121 125 130 135 140
Asn Lys Tyr Val Glu Leu Leu Asp Thr Leu Trp Met Val Leu Arg Lys Lys Ser Ser Gln
141 145 150 155 160
Val Ser Phe Leu His Val Tyr His His Cys Leu Leu Ile Trp Ala Trp Phe Ile Val Ile
161 165 170 175 180
Lys Phe Gly Asn Gly Gly Asp Ala Tyr Phe Gly Gly Met Leu Asn Ser Leu Ile His Val
181 185 190 195 200
Met Met Tyr Ser Tyr Tyr Thr Met Ala Leu Leu Gly Trp Ser Cys Pro Trp Lys Arg Tyr
201 205 210 215 220
Leu Thr Gln Ala Gln Leu Val Gln Phe Cys Ile Cys Leu Thr His Ser Thr Trp Ala Ala
221 225 230 235 240
Val Thr Gly Val Tyr Pro Trp Lys Ile Cys Leu Val Glu Met Trp Val Met Ile Ser Met
241 245 250 255 260
Leu Val Leu Phe Thr Arg Phe Tyr Asn Gln Ser Tyr Ala Lys Glu Lys Ser Ala Lys Asp
261 265 270 275 280
Ala Ala Ala Leu Leu Gln Ala Lys Ala Ala Thr Ala Lys Ala Gln Gln Thr Ser Gly Asn
281 285 290 295 300
Phe Ala Pro Ser Leu Arg Arg Ile Ala Lys His Glu Lys Gly
301 305 310
机译： 在转基因生物中产生多不饱和脂肪酸的方法，所述多不饱和脂肪酸至少包含Δ9延伸酶和去饱和酶Δ8-，必要时还包含Δ-去饱和酶; δ-去饱和酶-8的核苷酸序列
机译： 新的延伸酶基因扩展了16、18和20个碳脂肪酸，可用于操纵植物生产用于食品，化妆品和制药行业的多不饱和脂肪酸
机译： 新的延伸酶基因扩展了16、18和20个碳脂肪酸，可用于操纵植物生产用于食品，化妆品和制药行业的多不饱和脂肪酸
