一种使有丝分裂原活化蛋白激酶失活的方法

具体实施方式

下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规实验方法

实施例1、OspF，SpvC及HopAI1重组蛋白的表达及纯化

1、构建表达质粒

(1)OspF蛋白表达质粒和SpvC蛋白表达质粒的构建

以Shigellaflexneri 2a 301菌株的基因组DNA为模板，用引物SF1(其序列为GG GAA TTC CAT ATG CCC ATA AAA AAG CCC)和SF2(其序列为CG GGA TCC CTACTC TAT CAT CAA ACG)，PCR扩增核苷酸序列是GenBank Accession Number AF386526的自5′末端第9576位至10295位脱氧核糖核苷酸的OspF基因。以Salmonellatyphimurium LT2菌株的基因组DNA为模板，用引物ST1(其序列为GG GAA TTC CATATG CCC ATA AAT AGG CCT)和ST2(其序列为CG GGA TCC TTA CTC TGT CAT CAA ACGATA AAA CGG)，PCR扩增核苷酸序列是GenBank Accession Number NC_003277自5′末端第27178位至27903位脱氧核糖核苷酸的SpvC基因。将OspF基因的PCR产物和SpvC基因的PCR产物分别克隆到pET21a(Novagen)载体的Nde I和BamH I酶切位点之间，经酶切鉴定和PCR鉴定，得到含有OspF基因的重组表达载体和含有SpvC基因的重组表达载体，将含有OspF基因的重组表达载体命名为pET21-OspF，含有SpvC基因的重组表达载体命名为pET21-SpvC。pET21-OspF表达OspF蛋白，pET21-SpvC表达SpvC蛋白。

(2)融合蛋白MBP-OspF表达质粒、融合蛋白MBP-SpvC表达质粒和融合蛋白MBP-HopAI1的构建

以Shigella flexneri 2a 301菌株的基因组DNA为模板，用引物SF11(其序例为CG GAA TTC ATG CCC ATA AAA AAG CCC和SF21(其序例为CG GGA TCC CTA CTCTAT CAT CAA ACG，PCR扩增核苷酸序列是GenBank Accession Number AF386526自5′末端第9576位至10295位脱氧核糖核苷酸的OspF基因。

以Salmonella typhimurium LT2菌株的基因组DNA为模板，用引物ST11(其序列为CG GAA TTC ATG CCC ATA AAT AGG CCT和ST21(其序列为CG GGA TCC TTACTC TGT CAT CAA ACG ATA AAA CGG，PCR扩增核苷酸序列是GenBank Accession NumberNC_003277自5′末端第27178位至27903位脱氧核糖核苷酸的SpvC基因。

以Pseudomonas syringae的基因组DNA为模板，用引物PS1(其序列为CG GAA TTC ATG CTC GCT TTG AAG CTG)和PS2(其序列为CG GGA TCC TCA GCG AGTCCA GGG)，PCR扩增核苷酸序列是GenBank Accession Number NC_004578自5′末端第987569位至988354位脱氧核糖核苷酸的HopAI1基因。HopAI1基因编码的氨基酸序列如GenBank(Accession Number：NP_790745)所示。

将OspF基因的PCR产物和SpvC基因的PCR产物以及HopAI1基因的PCR产物分别克隆到pMAL c2x(NEB)载体的EcoRI和BamH I酶切位点之间。经酶切鉴定和PCR鉴定，得到含有OspF基因的重组表达载体，将其命名为pMAL-OspF；得到含有SpvC基因的重组表达载体，将其命名为pMAL-SpvC；得到含有HopAI1基因的重组表达载体，将其命名为pMAL-HopAI1。pMAL-OspF表达融合蛋白MBP-OspF，pMAL-SpvC表达融合蛋白MBP-SpvC，pMAL-HopAI1表达融合蛋白MBP-HopAI1。

2、蛋白表达

将pET21-OspF、pET21-SpvC、pMAL-HopAI1、pMAL-OspF和pMAL-SpvC分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，从新鲜复苏的平板上挑取单菌落接种于100mLLB培养基中，37℃过夜振荡培养。次日将过夜菌按1∶100的体积比接种于4LLB培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃继续培养8小时后收集菌体。

3、蛋白纯化

菌体经冰上预冷的缓冲液洗涤后，悬浮于100mL缓冲液中。破碎菌体细胞，破菌液于45,000g离心1小时，获得上清液。含OspF蛋白的上清上样于预先用缓冲液A(20 mM MES，pH 6.0)平衡的HiPrep^TM16/10 SP XL(Amersham Biosciences)柱，含SpvC蛋白的上清液上样于预先用缓冲液B(50 mM Tris，pH 8.0)平衡的Hitrip Q HP(Amersham Biosciences)柱。洗脱杂蛋白至A₂₈₀＜0.02后，按照如下方法进行梯度洗脱：起始液：缓冲液B；终止液：含有500 mM NaCl的缓冲液B；共梯度洗脱200mL，梯度速度是每毫升0.5％的终止液。分步收集穿出组分。经12％SDS-PAGE鉴定后，把含有目标蛋白质的组分(OspF以及SpvC蛋白的分子量约为28KDa)合并，经Amicon Ultra-15(Millipore)浓缩后用Superdex 75(AmershamBiosciences)柱进一步纯化。

MBP融合蛋白(MBP-OspF、MBP-SpvC和MBP-HopAI1)的上清液分别上样于预先用缓冲液C(10mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)平衡的2mL Amylose resin柱(NEB)，用缓冲液C洗脱杂蛋白至A₂₈₀＜0.02后，用10mM麦芽糖洗脱蛋白，经Amicon U1tra-15(Millipore)浓缩后用Superdex 200(Amersham Biosciences)柱进一步纯化。

4、蛋白纯度鉴定

经12％SDS-PAGE鉴定，OspF，SpvC及MBP-HopAI1重组蛋白的纯度均大于90％(图1A)。图1A中，最左侧的泳道为蛋白质分子量标准，其条带的大小从下到上分别为14K，20K，31K，43K，66K，97K Da，表达的OspF蛋白的大小为28K Da，SpvC蛋白的大小为28K Da，MBP-HopAI1蛋白的大小为70K Da。

实施例2、OspF，SpvC及HopAI1重组蛋白对MAPK激酶的体外修饰及修饰后激酶活性测定

1、OspF，SpvC及HopAI1重组蛋白对MAPK激酶的体外修饰

(1)重组蛋白对Erk2激酶的体外修饰

MAPK激酶保守的“T-X-Y”序列被磷酸化为“pT-X-pY”后而被活化，从而激活下游的信号传导通路。“pT-X-pY”的去磷酸化将使MAPK激酶失活。将100ngGST-p-Erk2蛋白(购自Upstate公司)结合到GST beads上，溶于缓冲液D(10mMHEPES，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA)中。分别加入1μg MBP-OspF、MBP-SpvC及MBP-HopAI1重组蛋白，30℃反应30分钟后，用抗“pT-X-pY”的p-Erk抗体(购自Cell Signaling Technology公司)检测Erk2激酶的修饰情况。同时以缓冲液D或者MBP蛋白作为对照。(对照用缓冲液D或者1μg MBP蛋白代替OspF，SpvC和HopAI1重组蛋白加入到GST-p-Erk2蛋白中)。

结果如图1B所示，加入MBP-OspF、MBP-SpvC及MBP-HopAI1后，双磷酸化Erk2激酶(在图中以p-Erk2表示)的量大大减少，而对照实验(Buffer或MBP)中双磷酸化Erk2激酶的量并未改变，说明OspF，SpvC及HopAI1能修饰ERK2激酶，使之去磷酸化。图1B中，Buffer表示在100 ng GST-p-Erk2蛋白中加入缓冲液D，MBP-OspF表示在100ng GST-p-Erk2蛋白中加入1μg MBP-OspF蛋白，MBP-SpvC表示在100ng GST-p-Erk2蛋白中加入1μg MBP-SpvC蛋白，MBP-HopAI1表示在100ng GST-p-Erk2蛋白中加入1μg MBP-HopAI1蛋白，MBP表示在100ngGST-p-Erk2蛋白中加入1μg MBP蛋白。反应体系中双磷酸化和去磷酸化Erk2激酶的总量(用Erk2表示)用Santa Cruz Biotechnology公司的ERK抗体检测，结果表明各个反应中加入的双磷酸化Erk2激酶的量是一致的。

(2)OspF对p-JNK和p-p38激酶的体外修饰

双磷酸化“pT-X-pY”的p38(p-p38)和双磷酸化“pT-X-pY”的JNK(p-JNK)购自Cell Signaling Technology公司。100ng p-p38或125ng p-JNK溶于缓冲液D中，加入0到1μg OspF蛋白，30℃反应30分钟后，用抗“pT-X-pY”的p-p38或p-JNK抗体(购自Cell Signaling Technology公司)检测p38及JNK激酶的修饰情况，结果如图1C所示，随着OspF蛋白量的增加，双磷酸化p38及JNK激酶(图中以p-p38及p-JNK表示)的量逐渐减少，说明OspF能修饰p38及JNK，使之去磷酸化。图1C中，从左至右的泳道中，OspF蛋白的加入量分别为0、0.25、0.5和1μg。

反应体系中双磷酸化和去磷酸化p38激酶的总量(用p38表示)为1.25μg，

用Cell Signaling Technology公司的p38抗体检测，结果表明各个反应中加入的双磷酸化p38激酶的量一致。

反应体系中双磷酸化和去磷酸化JNK激酶的总量(用JNK表示)为1.25μg，用Cell Signaling Technology公司的JNK抗体检测，结果表明各个反应中加入的双磷酸化JNK激酶的量一致。

(3)重组蛋白对MAPK激酶修饰的特异性

OspF，SpvC及HopAI1修饰活化的MAPK激酶，具有高度的特异性。将100ng的p-Erk2与OspF或MPK3一起保温0或30分钟，用抗体检测p-Erk2的修饰情况。结果如图1D所示，MPK3作为酪氨酸磷酸酶，能特异性去磷酸化磷酸酪氨酸，修饰p-Erk2后，磷酸酪氨酸的量减少；而经OspF去磷酸化p-Erk2后，磷酸酪氨酸的量并未减少，说明OspF，SpvC及HopAI1对MAPK激酶的修饰具有高度的特异性，修饰MAPK激酶的磷酸化苏氨酸而不是磷酸化的酪氨酸。图1D中，Buffer表示在100ng GST-p-Erk2蛋白中加入缓冲液D，MKP3表示在100 ng GST-p-Erk2蛋白中加入1μg MKP3蛋白，OspF表示在100ng GST-p-Erk2蛋白中加入1μg OspF蛋白。

(4)OspF重组蛋白修饰MAPK激酶及磷酸化多肽的鉴定

将1μg OspF蛋白与0.1mM磷酸化多肽pT-X-pY(Erk2)(该多肽的序列为：DHTGFL-pT-E-pY-VATR)混合，在30℃反应30分钟，用质谱鉴定被修饰多肽的分子量，如图2A所示，修饰后多肽的分子量减少了98，而减少一个磷酸基团，分子量的减少应该为80，多减去18很可能是修饰过程中消去了一分子水，生成了碳-碳双键。二级质谱鉴定表明(图2B)，修饰过程中”pT-X-pY”中的磷酸化苏氨酸上分子量减少了98。修饰后产物能使高锰酸钾溶液的紫色褪去，并且¹H-核磁共振图谱中(图2C)，在化学位移为6.7ppm处，有一新的峰生成，确认了碳-碳双键的存在。因此OspF，SpvC及HopAI1是一类磷酸苏氨酸裂合酶，它们能修饰MAPK激酶及磷酸化多肽，生成碳-碳双键(图2D)。图2C中，以单独的磷酸化多肽pT-X-pY(Erk2)为对照(conrol)，OspF表示在磷酸化多肽pT-X-pY(Erk2)中加入重组蛋白OspF。图2D中箭头示生成的碳-碳双键上氢原子的化学位移。

2、OspF，SpvC及HopAI1重组蛋白对MAPK激酶体外修饰后激酶活性的测定

MAPK激酶保守的“T-X-Y”序列被磷酸化为”pT-X-pY”后而被活化，因此可以用抗”pT-X-pY”的MAPK激酶的抗体来检测激酶的活性。激酶能够水解ATP，从而磷酸化下游的底物。将修饰前后的激酶(激酶GST-p-Erk2，加入1μg重组蛋白在30℃反应30分钟后，加入GST beads并用大量缓冲液D清洗beads以去除OspF，从而得到修饰后的激酶)加入到缓冲液E(20mM HEPES，pH 8.0，200mM NaCl，10mM MgCl2，O.5mM DTT，0.5mM ATP，2μCi γ-³²P)，然后加入1μg激酶的人工底物髓磷质蛋白(myelin basic protein，MBP)(用³²P标记)，30℃反应30分钟，15％SDS-PAGE后进行放射自显影(图3A)。双磷酸化Erk2激酶(图3中以“buffer”表示，修饰前的激酶)能磷酸化髓磷质蛋白(myelin basic protein，MBP)，放射自显影后MBP处有条带出现(³²P-MBP表示磷酸化的髓磷质蛋白)。加入修饰后的激酶(图3中以“OspF”表示，表示用1μg OspF修饰后的激酶)后，MBP处没有条带出现，说明丧失了激酶的活性。加入经MKP3修饰后的激酶(图3中以“MKP3”表示，表示用1μg MKP3修饰后的激酶)后，MBP处条带减弱，表明激酶活性降低。失活过程是不可逆的，如图3中B所示，经OspF修饰失活后，MAPK不能被它上游的激酶MEK1磷酸化而恢复活性。而经PP2C磷酸酶对照处理后，MAPK能够被它上游的激酶MEK1磷酸化而恢复活性。图3B中，“-”表示未添加该物质或未进行该处理，“+”表示添加该物质或进行该处理。

实施例3、OspF及SpvC对细胞内MAPK激酶的修饰及对MAPK激酶活性和信号通路的抑制

1、OspF蛋白对细胞内MAPK激酶的修饰

(1)RasV12表达质粒HA-RasV12的构建

将HA tag的编码DNA序列(TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT)克隆到pCDNA3(Invitrogen公司)的限制性内切酶Xho I和Xba I位点间，得到重组载体pCDNA3-HA，再将FseI-AscI限制性内切酶位点(GGCCGGCCGGGCGCGCC)插入到pCDNA3-HA的限制性内切酶Xba I和EcoR I位点间，得到重组载体pCDNA3-HA-FA。将RasV12基因(其核苷酸序列如序列表中的序列1所示)克隆到重组载体pCDNA3-HA-FA的限制性内切酶FseI和AscI位点间，得到重组载体HA-RasV12。该载体N端含有HA tag。

(2)OspF表达质粒Flag-HA-OspF的构建

将Flag-HA-FseI-AscI的编码DNA序列(GACTACAAGGACGACGATGACAAGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTGGCCGGCCGGGCGCGCC)插入到Invitrogen公司的pCDNA4/TO的限制性内切酶BamHI和Xba I位点间，得到重组载体pCDNA4/TO-Flag-HA-FA。将OspF基因(其核苷酸序列是GenBank Accession Number AF386526的自5′末端第9576位至10295位脱氧核糖核苷酸)克隆到pCDNA4/TO-Flag-HA-FA的限制性内切酶FseI和AscI位点间，得到重组载体Flag-HA-OspF，该载体N端含有Flag-HA tag。

(3)RasV12是Ras基因的持续激活突变体，能够持续性地激活Erk信号通路。用RasV12表达质粒HA-RasV12和OspF表达质粒Flag-HA-OspF共转染293T细胞，然后检测OspF对Erk信号通路的影响，并利用质谱检测OspF在体内对Erk的修饰。检测中所用的一抗分别为抗p-Erk1/2抗体(Cell Signaling Technology公司)，抗Erk1/2抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)，抗HA抗体(Santa Cruz Biotechnology公司，根据蛋白质的分子量确定HA-RasV12和Flag-HA-OspF条带的位置)，抗actin抗体(Sigma公司)。Western blot结果显示(图4A)，体内表达的OspF能够抑制Erk蛋白的磷酸化。图4A中，Flag-HA-OspF表示转染了Flag-HA-OspF表达质粒，HA-RasV12表示转染了HA-RasV12表达质粒。p-Erk1/2，Erk1/2，OspF，RasV12和actin分别表示抗p-Erk1/2抗体、抗Erk1/2抗体、抗HA抗体和抗actin抗体的检测结果。“-”表示未添加该物质，“+”表示添加该物质。

而Erk蛋白质谱结果表明(图4C)，OspF脱去了磷酸化Erk蛋白中202位苏氨酸上的磷酸，并形成一个碳-碳双键。

2、OspF蛋白对细胞内MAPK激酶活性的抑制

用RasV12表达质粒HA-RasV12，OspF表达质粒Flag-HA-OspF以及Erk表达质粒HA-Erk共转染293T细胞，收集细胞后，加入缓冲液E(20 mM HEPES，pH 8.0，200mMNaCl，0.5mM DTT，1％Traton-X100)裂解细胞，在上清中加入protein G sepharosebeads(GE healthcare公司)和HA抗体(GE healthcare公司)，4℃结合2小时，去掉上清，用缓冲液E洗beads三遍后，加入缓冲液F(20mM HEPES，pH8.0，200mM NaCl，10mM MgCl₂，0.5mM DTT，0.5mM ATP，2μ Ci γ-³²P)以及1μg激酶的人工底物MBP，30℃反应30分钟，放射自显影结果显示(图4B)，经OspF修饰后，MAPK丧失了激酶的活性，不能磷酸化MBP底物。图4B中，³²P MBP表示³²P标记的MBP，Erk2表示抗Erk抗体，OspF表示抗Flag显示的Flag-HA-OspF，RasV12表示抗HA显示的HA-RasV12。“-”表示未添加该物质，“+”表示添加该物质。

其中，Erk表达质粒HA-Erk按照如下方法构建：将Erk基因(其核苷酸序列是自GenBank Accession Number M64300的自5′末端第172-1248位脱氧核糖核苷酸)克隆到重组载体pCDNA3-HA-FA的限制性内切酶FseI和AscI位点间，得到重组载体HA-Erk，该载体N端含有HA tag。

序列表

<160>2

<210>1

<211>570

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

atgacggaat ataagctggt ggtggtgggc gccggcggtg tgggcaagag tgcgctgacc      60

atccagctga tccagaacca ctttgtggac gaatacgacc ccactataga ggattcctac     120

cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga taccgccggc     180

caggaggagt acagcgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg cttcctgtgt     240

gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag ggagcagatc     300

aaacgggtga aggactcgga tgacgtgccc atggtgctgg tggggaacaa gtgtgacctg     360

gctgcacgca ctgtggaatc tcggcaggct caggacctcg cccgaagcta cggcatcccc     420

tacatcgaga cctcggccaa gacccggcag ggagtggagg atgccttcta cacgttggtg     480

cgtgagatcc ggcagcacaa gctgcggaag ctgaaccctc ctgatgagag tggccccggc     540

tgcatgagct gcaagtgtgt gctctcctga                                      570