RAGE Gly82Ser突变体在制备胃癌筛查试剂中的应用

具体实施方式

以下具体说明本发明。

1、材料和方法

(1)受试者：

这是一个病例-对照研究，包括了283位胃癌病人和283位无癌对照者。研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准。病例是新近从组织学上诊断为胃癌的入院病人，连续从南京医科大学附属医院招募得来。那些有继发的、再生的肿瘤病例被除外。对照者为同时期的入院病人，没有任何癌症和遗传病史。他们年龄(5岁内)和性别匹配。所有受试者是无亲戚关系的汉族人。年龄、性别、吸烟情况、居住地、体重和个人医疗史的信息通过调查表收集得来[4-6]。以前或最近平均每天吸烟≥10支被定义为吸烟者。所有的胃癌根据国际抗癌联合会(UICC)TNM分类标准分类[19]。

(2)RAGE基因型检测：

RAGE Gly82Ser基因突变试剂盒包括：一对引物(正义：5′-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3′，反义：5′-GGCCAAG GCTGGGGTTGAAGG-3′)，Taq酶，PCR buffer，MgCl₂，dNTPs，限制性内切酶Alu I，琼脂糖。

采集受试者外周静脉血3ml，EDTA-K₂抗凝，用经典酚-氯仿法抽提基因组DNA[4]。用PCR-RFLP方法测定RAGE Gly82Ser变异。PCR在20μl反应混合物中进行，包括1.625mM MgCl₂，0.14mM dNTPs，1 U Taq酶(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)，2μl 10×PCR buffer(MBI Fermentas)，200ng基因组DNA和0.25μM的引物(正义：5′-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3′，反义：5′-GGCCAAG GCTGGGGTTGAAGG-3′)。最初95℃变性5分钟之后，94℃ 30秒，62℃ 40秒，72℃ 45秒，共35个循环扩增DNA，最后72℃ 10分钟延伸。得到的397bp的PCR产物被限制性内切酶Alu I(New EnglandBioLabs，Waltham，MA，USA)5个单位在37℃消化16小时，紧接着2％琼脂糖凝胶电泳。对临床资料未知的两位研究者单独检测基因型以互相验证。随机选择大约10％的样本做重复测验，结果100％一致。

(3)统计学方法：

用Stata Version 8.0(STATA Corporation，College Station，TX)进行所有的统计分析。所有的检验都是双侧的，P＜0.05被定义为有统计学意义。不符合正态分布的数值变量，用中位数表示，且用Mann-Whitney秩和检验分析。用Pearsonχ²检验来分析分类变量分布的差别。用拟合优度检验评估RAGE基因型的Hardy-Weinberg平衡。变异与胃癌风险的相关性用OR值和95％可信区间来表示。野生基因型82Gly/Gly携带者为参照组。粗的OR值通过Woolf近似法计算得到，校正的OR值通过非限制性logistic回归来校正年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病等情况。

2、结果

(1)RAGE基因型检测

PCR产物用Alu I限制性内切酶消化，然后在2％琼脂糖凝胶电泳分析，有249bp，123bp和26bp三个片段的为82Gly/Gly纯合子，有249bp，181bp，123bp，67bp和26bp五个片段的为82Gly/Ser杂合子，有181bp，123bp，67bp和26bp四个片段的为82Ser/Ser纯合子，结果见图1。

(2)胃癌病例和对照组基本情况

胃癌病例和对照组的基本情况见表1。胃癌病例和对照的性别和年龄(5岁以内)匹配良好。两组的吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病史相似。胃贲门癌和非贲门癌病人分别为83和200。绝大多数病例为腺癌(97.88％)。在275位可获取临床病理资料的胃癌病例中，48，31，133和63个分别为T1，T₂，T₃，和T₄；38，129和108个分别为高，中，低分化。177个病例为淋巴结转移阳性。

表1

^*中位数(25th-75th percentiles)

(3)胃癌病例和对照组RAGE基因型分布和风险评估

RAGE基因型分布和胃癌风险评估见表2。病例和对照的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡定律。病例和对照组的基因型频率有统计学差别(Pearsonχ²＝6.552，P＝0.038)。而且，病例组Ser82等位基因频率较对照组高(Pearsonχ²＝5.855，P＝0.016)。用82Gly/Gly基因型作为参照，变异基因型(82Gly/Ser和82Ser/Ser)的OR值，在校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病后，为1.47(95％CI：1.05-2.06，P＝0.024)。而且，82Gly/Ser杂合子增加了41％的胃癌风险(校正OR值：1.41；95％CI：1.00-1.99)，82Ser/Ser纯合子增加了150％的风险(校正OR值：2.50；95％CI：1.01-6.17)。

表2

^*基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，Pearsonχ²＝3.045，P＝0.081.

^校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病.

^GG：82Gly/Gly；GS：82Gly/Ser；SS：82Ser/Ser.

(4)变异的RAGE基因型和胃癌病人的临床病理学特征的关系

在此研究中，我们也分析了RAGE变异基因型与胃癌病人临床病理学特征的相互关系见表3。我们发现变异基因型和肿瘤浸润(T4)相关(校正OR值：3.20；95％CI：1.40-7.29)。

表3

^校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病.

^GG：82Gly/Gly；GS：82Gly/Ser；SS：82Ser/Ser.

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