葡萄糖吸收调节剂和用于治疗糖尿病或糖尿病并发症的方法

具体实施方式

在下文中将会参照附图来详细描述本发明的示例性实施方案。

葡萄糖吸收调节剂是指任何可通过增加组织对胰岛素的反应性来降低血糖水平的药剂。

对胰岛素抗性高血压敏感的患者是指表现出胰岛素抗性并且因此可能表现出高血压的患者。这类患者是本领域普通技术人员所熟知并且很容易辨别的。治疗是指胰岛素抗性和/或高循环胰岛素水平所致的血压的任何降低。预防是指依据疾病的严重程度，部分地至完全地避免胰岛素抗性患者体内的高血压。

“单位剂量”是指适合于医学或兽医目的给药形式的葡萄糖吸收调节剂的离散量。因此，理想的单位剂量应该是含有用于特定目的(例如治疗或预防抗糖尿病药物治疗导致的肥胖症)的精确量的葡萄糖吸收调节剂的一个单位或其整数量。对于药物制剂领域中的普通技术人员来说显而易见的是，葡萄糖吸收调节剂可以被配制成常规的单位剂量。这些单位剂量可以被包装成各种形式，例如片剂、硬胶囊、箔包装、玻璃安瓿等等。类似地，单位剂量可以用药物滴管或泵式喷雾器送递。然后这些不同的单位剂量可以以各种可药用的液体给药形式来给予，即口服或肠胃外给药。因此，例如，箔包装的内容物可以在水中溶解并经口摄入，或者小玻璃瓶的内容物可以被注射。类似地，离散量形式例如药物滴管或泵式喷雾器可以在水中溶解。

“哺乳动物”是指一类高等脊椎动物(哺乳动物类)中的任何动物，包括人和所有其他用乳腺分泌的乳养育幼崽并且具有通常被或多或少的毛发覆盖的皮肤的动物。这一定义特别包括人，其耐力、精力或运动能力不是最佳的。普通医师或兽医可以容易地诊断这类人和非人类的动物。

葡萄糖稳态可通过对肝葡萄糖产生和细胞葡萄糖吸收的精细控制来维持。如果我们的身体不能维持葡萄糖稳态，我们就会患上高血糖或各种代谢紊乱病症。在寻找新的增强3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的因子时，我们应用了新的基于系统性平行柱色谱、蛋白酶过滤和灵敏的MS分析的综合方法，并且对LPC进行鉴定。

我们发现LPC以剂量依赖性和时间依赖性的方式刺激葡萄糖吸收。LPC治疗所刺激的葡萄糖吸收对LPC的酰基链长度的变化和其极性首基的差异都很敏感。对3T3-L1进行的LPC处理会导致质膜处GLUT4水平的显著升高。LPC对葡萄糖吸收的作用可被PKCδ的抑制剂楸毒素(rottlerin)和显性负性PKCδ的表达消除。将LPC给予小鼠会导致血糖水平的显著下降。此外，LPC能改善I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和Ⅱ型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病)小鼠模型中的血糖水平。这些结果表明LPC可能会引发对葡萄糖稳态的新观念和治疗糖尿病的新方式。

溶血磷脂调节各种生物过程，包括细胞增殖、肿瘤细胞侵袭和炎症。通过磷脂酶A₂(PLA₂)作用产生的LPC是主要的血浆脂质成分并且将脂肪酸和胆碱转运到组织中。也已知LPC与葡萄糖稳态的调节高度相关。最近，已经证明LPC会增强胰细胞的葡萄糖依赖性胰岛素分泌。已经报道的LPC的生理作用之一是诱导胰细胞分泌胰岛素。最近，Takatoshi等人鉴定了一种孤儿G蛋白偶联受体GPR119，它是一种新的针对LPC的Gs蛋白偶联受体。所述GPR119主要在胰细胞中表达且LPC对GPR119的激活会导致葡萄糖依赖性胰岛素分泌。

LPA是一种有效的多生物活性的磷脂，它已知能通过特异性G蛋白偶联受体来调节多种细胞事件。LPA可以调节血小板凝集、肌动蛋白细胞骨架活化、成纤维细胞增殖和轴突收缩。已经推断有两种主要的LPA细胞外产生途径。第一种途径是通过活化的血小板释放LPA。另一种途径是通过自分泌运动因子(溶-LPD)由溶血磷脂产生LPA。最近，有报导称由于自分泌运动因子的分泌，可以在脂肪细胞的胞外培养基中产生LPA。LPA可能参与在总能量平衡调节中起关键作用的脂肪组织的发育控制。

作为一种生物活性溶血磷脂，溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)被认为与免疫调节相关。但是LPS对细胞活性的作用以及其靶分子的身份还没有得到完全阐明。LPS也存在于卵巢癌患者的腹水内。已有报导称它会诱导卵巢癌和乳腺癌细胞系中细胞内钙浓度的暂时性增加。LPS也会刺激Jurkat细胞内的白细胞介素-2的生成，表现出对Jurkat细胞增殖的抑制作用。此外，LPS治疗增强了大鼠肥大细胞内的神经生长因子诱导的组胺释放以及PC12细胞的神经生长因子诱导的分化。由于仅有有限的报导证明了LPS在一些生物应答调节中的作用，所以应该对它在各种细胞活性中的作用以及其作用机制进行研究。

本发明研究了尾加压素(UCN)作为葡萄糖稳态调节中胰岛素作用的辅因子的新作用。众所周知，UCN起血糖增高剂的作用。但是，我们发现UCN可以致敏信号传导分子的胰岛素诱导活化，所述信号传导分子例如IR过表达(hIRcB)细胞和C2C12肌管中的胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物(IRS)和蛋白激酶B(AKT)。值得注意的是，体内尾加压素在血糖水平的调节中的作用会随剂量而不同。在低剂量(0.1pM)时，尾加压素会下调血糖水平并且因此增加小鼠骨骼肌内的IR磷酸化。总之，我们示出了尾加压素会增强胰岛素敏感性的生理现象，表明尾加压素可被应用为糖尿病的治疗靶标。

尾加压素是具有40个氨基酸的肽，它是促皮质素释放因子(CRF)家族的一员。已知尾加压素是下丘脑-脑垂体-肾上腺(HPA)轴调节中的一种主要下丘脑因子。此外，有越来越多的证据表明UCN还在能量平衡调节中具有重要作用。在各种动物模型中，UCN通过儿茶酚胺能系统来抑制食欲并活化产热作用和胃排空，并且刺激结肠运动功能。最近，有一些关于外周组织(如骨骼肌)中UCN表达的报导。但是葡萄糖调节中的外周UCN的作用仍旧是未知的。

溶血磷脂调节各种生物过程，包括细胞增殖、肿瘤细胞侵入。通过磷脂酶A₂(PLA₂)对溶血磷脂酰胆碱的作用产生的LPC会促进炎性效应，包括增加内皮细胞粘附分子和生长因子的表达、单核细胞趋化性和巨噬细胞活化。本发明首次提供了LPC是涉及葡萄糖稳态的血源性激素(blood bornehormone)的证据。为了寻找这种分子，我们使用了新的包括平行柱色谱、蛋白酶过滤和高灵敏度MS分析的综合方法(Baek，M.C.et a1.Proteomics 6 pp1741-1749，2006)。LPC治疗通过PI3-激酶依赖性PKCδ激活快速刺激3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收。此外，给予糖尿病模型小鼠LPC会导致血糖水平的显著下降。除LPC外，已知许多溶血磷脂(LPL)具有各种生理和病理功能。但是，没有报导称它们参与葡萄糖稳态的调节。作为与葡萄糖代谢相关的内源脂质，脱氢表雄酮(DHEA)已经被报道过。尽管最近的研究已经证明DHEA会增加脂肪细胞中的葡萄糖吸收速率，但是没有报导称它对动物模型有效。因此，我们认为LPC可能是第一种调节糖尿病模型小鼠以及正常小鼠体内血糖水平的内源脂质。

为了寻找新的活性配体，我们在先设计了称为LPI的新方法学，所述方法学是基于平行HPLC和MS分析的活性成分谱的概念之上的。如在先的报告所述，所述平行HPLC是通过增加产率来有效鉴定活性分子的。在本文中，我们向平行HPLC中加入了蛋白酶过滤法以更有效地纯化。蛋白酶通常被用于蛋白质作图或蛋白质鉴定，但是所述蛋白酶过滤法同柱色谱一样使用蛋白质酶作为纯化工具。蛋白酶过滤特别适用于排除具有与活性分子类似的物理化学性质的无活性肽。虽然所述无活性肽不容易通过常规的顺序色谱除去，但是通过蛋白酶处理切割无活性肽会使无活性肽产生结构变化并且通过接下来的柱色谱将其从活性分子中分离出来。通过将蛋白酶过滤法与平行HPLC联合起来，我们设计了一种新的配体鉴定方法并且更容易地鉴定了LPC。因此，这种综合方法可用于从少量原料中搜索各种生物活性分子例如孤儿GPCR研究。

LPC治疗导致的小鼠体内3T3-L1脂肪细胞中对葡萄糖吸收的刺激和血糖的降低对于LPC酰基链长度的变化敏感。棕榈酰LPC和肉豆蔻酰LPC增强3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收，但是硬脂酰LPC对于3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收的刺激没有作用。当用几种溶血磷脂(它们与棕榈酰LPC仅在极性首基上有结构差异)处理3T3-L1脂肪细胞时，没有刺激葡萄糖吸收。LPC的这种结构特异性在小鼠模型中也得到了确认。这些结果表明酰基链长度和磷脂酰胆碱首基均对于小鼠体内3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的刺激和血糖的降低都是至关重要的。

基于LPC作用的快速起效性和结构特异性，本发明的发明人推测，LPC的生物活性可以通过LPC与细胞表面的特异性LPC受体的结合来解释。已有报导称几种溶血磷脂是这一GPCR家族的配体。有报导称LPC是结合并活化G2A和GPR4的直接配体。但是最近在其他独立的研究中报道，LPC能激活G2A和GPR4但并不与它们直接结合。因此，LPC是通过直接结合G2A和GPR4还是间接通过另一种未知的途径来刺激葡萄糖吸收仍旧是待研究的问题。

很久以前就认识到在脂肪细胞和肌肉细胞中的葡萄糖吸收促进过程中包括PKCδ激活，但是PKCδ激活还控制葡萄糖转运。在激活葡萄糖转运的过程中有PKCδ参与，这一点最初是通过使用药剂和胰岛素的研究来阐明的。在大鼠骨骼肌细胞中，由胰岛素刺激的GLUT4向质膜的易位和葡萄糖吸收可被楸毒素抑制。此外，PKCδ的过表达诱导GLUT4向质膜的易位，并可使基础葡萄糖吸收增加到通过胰岛素达到的水平。在本研究中，LPC诱导的葡萄糖吸收增强可被楸毒素和显性负性PKCδ的表达抑制。但是，已经证明常规PKC抑制剂G6976的预处理和显性负性PKCζ的表达对LPC刺激的葡萄糖吸收没有作用。这些研究结果表明只有PKCδ对于LPC刺激的葡萄糖吸收是必不可少的。

已经报道的LPC的生理作用之一是诱导胰β细胞分泌胰岛素。最近，Takatoshi等鉴定了一种孤儿G蛋白偶联受体GPR119，它是一种新的针对LPC的Gs蛋白偶联受体(Soga，T.et al.Biochem Biophys Res Commun326，pp744-751，2005)。所述GPR119主要在胰β细胞中表达，并且LPC对GPR119的激活会导致葡萄糖依赖性胰岛素分泌。在本研究中，我们在禁食条件下给予小鼠LPC。我们也观察到在给予小鼠LPC后血清胰岛素的浓度没有变化。这表明小鼠体内的血糖浓度下降不是由胰岛素分泌介导，而是由LPC刺激后LPC的直接作用介导。

总之，我们目前的研究表明LPC刺激3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收。这一作用是受非PI3-激酶依赖性、PKCδ依赖性的信号传导途径介导的。此外，LPC会直接降低糖尿病小鼠模型中的血糖水平。关于LPC降血糖功能的这一新发现可能有助于重新阐明葡萄糖稳态和葡萄糖代谢相关生物学的其他方面。LPC和代谢综合征之间的关系也值得进一步的研究。最后，我们的研究结果增加了LPC成为用于开发糖尿病药物疗法的有用靶标的可能性。

已知UCN是血糖增高剂，但是在本发明中在正常ICR小鼠体内注射的UCN会下调血糖水平(图14A)，并且与单独注射胰岛素相比，在链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)小鼠体内共同注射胰岛素和UCN会进一步下调血糖水平(图14B)。此外，本发明研究了UCN介导的血糖水平下调的分子机制。本发明的发明人发现，UCN可致敏IR过表达(hIRcB)和分化C2C12肌管中的胰岛素介导的IR磷酸化(与IR激活有关)(图12、13)。并且这些作用与C2C12肌管中的葡萄糖吸收相关。这是第一次发现GPCR配体可特异性致敏胰岛素诱导的IR激活和葡萄糖调节生理学功能。

已知胰岛素是血液中主要的葡萄糖调节剂。但是，为了有效和精细地调节血糖水平，已经表明需要胰岛素功能辅因子。这些辅因子可能在生理和病理条件之间具有不同的功能权重。在正常生理条件下，胰岛素起主要的葡萄糖调节剂的作用，所以辅因子在葡萄糖稳态调节中可能会被忽视。但是在病理务件(如糖尿病和肥胖症)下，胰岛素的作用可能会被高度弱化，此时辅因子可能通过增强胰岛素的作用而在葡萄糖调节中起很大作用。

UCN表现出降血糖作用，虽然是在少数小鼠体内并且在STZ小鼠体内的葡萄糖调节中与是胰岛素协同作用。因此，UCN可能在病理条件下的葡萄糖调节中具有更强的作用。总之，本发明揭示了胰岛素介导的葡萄糖调节的新机制和UCN的新功能。值得注意的是IR活性可被GPCR调节，并且UCN在葡萄糖稳态方面在CNS和外周系统中具有相反的功能。

本发明的药物组合物可以被用作预防或治疗糖尿病或糖尿病并发症的药剂。糖尿病的实例包括胰岛素依赖性糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病等等。此外，本发明的药物组合物可被用作预防或治疗糖尿病并发症(例如神经病、肾病、视网膜病变、大血管病变、冠状动脉疾病、骨质减少等)的药剂。此外，本发明的药物组合物可被用作治疗受损的葡萄糖耐受的药剂。

此外，将本发明的药物组合物与胰岛素分泌增强剂、双胍和α-葡糖苷酶抑制剂等联合使用可提供更优良的降血糖效果。

本发明药物组合物或其各个活性成分的剂型包括口服剂型，例如片剂、胶囊(包括软胶囊和微胶囊)、粉末、颗粒、糖浆等；非口服剂型，例如注射剂(例如皮下注射剂、静脉内注射剂、肌内注射剂、腹膜内注射剂等)、外用形式(例如鼻喷雾制剂、经皮制剂、软膏剂等)、栓剂(例如直肠栓剂、阴道栓剂等)、球剂、点滴注射剂等。

本发明药物组合物的剂量可以参考各种药物的推荐剂量来适当地确定，并可以根据个体受试者、受试者的年龄和体重、目前临床状况、给药时间、剂型、给药方法、药物的组合等进行适当选择。胰岛素致敏剂和厌食剂的剂量可基于临床所用剂量来适当地选择。例如，对于将胰岛素致敏剂给予成年糖尿病患者(体重：50kg)，每日剂量通常是0.01至1000mg，优选0.1至500mg。该剂量可以一天给予一次至数次。

参照下述实施例进一步更详细地解释本发明。但是，这些实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

方法和材料

材料：合成的14:0、18:0、18:1的LPC、胰岛素和链脲佐菌素(STZ)购自Sigma(St.Louis，MO)。其他溶血磷脂购自Avanti polar lipids。所有的脂质都溶于MeOH中制成50mM储液。所有的脂质储液都在-70℃氮气下以单次用量等分形式存储于小玻璃瓶中，并且在一个月内使用。G6976和楸毒素购自Calbiochem。抗体购自下述来源：多克隆抗GLUT4抗体购自Biogenesis Ltd(Sandown，NH)。抗磷酸-Ser473 AKT1抗体购自Sigma。抗磷酸-Tyr989 IRS1是我们实验室制备的。[¹⁴C]2-脱氧-D-葡萄糖(300mCi/mmol)购自Moravek Biochemicals。胰蛋白酶购自Roche(德国曼海姆)。组织培养基和胎牛血清购自GIBCO。所有其他的试剂都是分析纯级。

细胞培养：3T3-L1成纤维细胞在DMEM中生长至汇合并维持在37℃下含5％CO₂的潮湿气氛中，所述DMEM中含有高浓度的葡萄糖、10％胎牛血清、青霉素50U/ml和链霉素50μg/ml。如在先的文献所述(van den Berghe，N.et al.Mol Cell Biol 14，pp.2372-2377，1994)，诱导3T3-L1分化为脂肪细胞。

动物。雄性ICR小鼠购自hyochang science(ROK)。C57BLKSJ-db/db小鼠购自SLC(日本)。在静脉内注射LPC后，用便携式葡萄糖计(Gluco-Dr，ROK)在断尾后定期测量血糖。为测量血清胰岛素，用胰岛素-RIA试剂盒(LINCO，Missouri)测定小鼠的血液样品。在雄性ICR小鼠中通过连续两天在腹膜内注射溶于柠檬酸钠(pH5.5)的STZ(200mg/Kg)来诱导胰岛素缺陷型小鼠。在最后一次STZ注射后第三天，静脉内注射载体、LPC或胰岛素后如上所述分析急性降葡萄糖作用。

HPLC纯化。将约350ml新鲜人血清与70％(v/v)丙酮、1 M乙酸和20mMHCl混合，并在4℃下以20,000g离心30分钟。收集所得上清液并用乙醚萃取三次。在4℃下以20,000g离心水相30分钟并将上清液上样到SepPakC18(Waters)卡套柱(cartridge)上预纯化。将洗脱液直接上样到C18反相HPLC柱上(Vydac 218TP1022，22mm×250mm)。每10ml收集一个级分，并将每个级分取约1％用于测定3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收。将活性级分在37℃下胰蛋白酶处理12小时，然后分别等量上样到C4反相HPLC柱(Vydac 214TP5215，2.1mm×150mm)和阳离子交换HPLC柱(AmershamPharmacia Min-S HR 5/5，4.6mm×50mm)上。

质谱和数据分析。用装备了纳米-ESI源的QSTAR PULSAR I hybrid Q-TOFMS/MS(Applied Biosystems/PE SCIEX，Toronto Ontario)进行ESI-MS和串联质谱(MS/MS)分析。将样品溶于0.1％三氟乙酸中，用protana纳米喷嘴(Odense，Denmark)送递到ESI源中。用Applied Biosystems(AB)提供的Analyst QS软件计算所有用QSTAR检测到的质量。以8,000-10,000的分辨率、10-30ppm的质量精度和24小时的外部校准进行QSTAR。喷嘴的电压设定在2300V。为了通过质量信息鉴定共同质量(common mass)，使用了结合在线数据库；Dictionary of Natural Products(Chapman&Hall/CRC)。

葡萄糖吸收测量。为测量3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收，使细胞在无血清DMEM中生长16小时，然后在不存在或存在胰岛素或溶血磷脂的情况下于37℃下按标明的时间进行培养。通过加入1μCi的[¹⁴C]2-脱氧-D-葡萄糖和3mM的2-脱氧-D-葡萄糖来测量吸收。10分钟后，通过用冰预冷的PBS快速洗涤两次来终止测定。用0.5ml含有0.5 N NaOH和0.1％SDS的裂解缓冲液来裂解细胞。用细胞裂解产物进行液体闪烁计数，并在存在10μM细胞松弛素B的情况下测定非特异性吸收(van den Berghe，N.et al.MolCell Biol 14，pp.2372-2377，1994)。

脂肪细胞的膜分级。为获得3T3-L1脂肪细胞的总膜(TM)，将细胞收集到10ml用冰预冷的HES缓冲液中(250mM蔗糖、1mMEDTA、1mM苯甲基磺酰氟[PMSF]、1μM胃蛋白酶抑制剂、1μM抑肽酶、1μM亮抑酶肽和20mM HEPES，pH7.4)，随后在4℃下用玻璃Dounce匀浆器匀浆30次。在4℃下以1,000g离心5分钟去除未破碎细胞后，在4℃下以212,000g离心上清液90分钟以获得总细胞膜的沉淀。为从3T3-L1脂肪细胞获得质膜(PM)亚细胞级分，使用了如在先文献所述(Perrini，S.et al.Diabetes 53，pp.41-52，2004)的差速超速离心。

PKC同种型的腺病毒转染。以前已经描述过了用于PKCδ或ζ重组腺病毒的腺病毒表达载体。在所培养的3T3-L1脂肪细胞分化后，吸出培养基并用含有PKCδ或ζ重组腺病毒的病毒培养基感染培养物24小时。然后用DMEM洗涤所述培养物两次并重新培养。使用感染后48小时的细胞进行葡萄糖吸收测定或免疫印迹。

免疫印迹。为制备总细胞裂解产物，用不含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS洗涤3T3-L1脂肪细胞，然后在裂解缓冲液(50mM HEPES、pH7.2、150mM NaCl、50mMNaF、1mM Na₃VO₄、10％丙三醇、1％Tririon X-100)中裂解。在4℃下以15,000rpm离心裂解产物15分钟。通过在95℃下在Laemmli样品缓冲液中煮沸5分钟使蛋白质变性，并通过SDS-PAGE分离。用Hoefer湿转系统将SDS胶转移到硝酸纤维素膜上。在含有5％脱脂奶粉的TTBS(20mM Tris-HCl、pH7.6、150mM NaCl、0.05％Tween 20)中封闭膜30分钟，然后用抗体孵育3小时。用TTBS洗膜几次后，将所述印迹用HRP(辣根过氧化物酶)缀合的山羊抗兔抗体孵育1小时。将所述印迹用TTBS洗涤几次并且进行ECL。

统计分析。所有数据都表示为平均值±SE。用Student’s t检验进行统计分析。*P＜0.01，认为表明具有统计显著性。

实施例1

在3T3-L1脂肪细胞中鉴定溶血磷脂酰胆碱为来自人血清的葡萄糖吸收刺激分子。

为研究可刺激3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的内源因子，我们使用了一种新的基于系统性平行柱色谱、蛋白酶过滤法和灵敏的MS分析的综合方法(图1A)。平行HPLC的基本原理是使用谱图分析而非常规的顺序纯化来鉴定靶分子(Baek，M.C.et al.Proteomics 6，pp，1741-1749，2006)。由于随着纯化的进行，每个柱之后的产率都呈指数下降，所以多步骤导致的低产率是顺序柱纯化的主要限制因素。这种新方法将顺序HPLC步骤减到最少，并且使用部分纯化的HPLC级分来鉴定靶分子，因此与多步骤顺序HPLC相比仅需要少量原料。

除平行HPCL外，我们使用了蛋白酶过滤法来进行有效的纯化。如果在特定蛋白酶处理后活性级分没有失去其活性，则我们可以得到含有活性分子的级分，并且该级分可通过接下来的柱色谱被彻底从各种无活性肽中分离出来。因此，这种方法可用于非肽分子(如脂质、胺和碳水化合物)的纯化。利用这种新的综合方法，首先，我们用C18反相(C18)HPLC对从人血清(350ml)中分离出的丙酮萃取物进行了分级分离。然后用这些HPLC级分处理3T3-L1脂肪细胞并且通过测定[¹⁴C]2-脱氧-D-葡萄糖吸收的增加来测量葡萄糖吸收(van den Berghe，N.et al.Mol Cell Biol 14，pp.2372-2377，1994)。

如图1B所示，至少存在四种活性级分(A-D)，并且我们检验了胰蛋白酶处理是否会减少它们的活性。只有级分D的活性不受胰蛋白酶处理的影响，所以将级分D用胰蛋白酶处理，并且用C4反相(C4)和阳离子交换(SCX)平行HPLC进一步分离。通过测量3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖吸收来筛选C4和SCX的所有级分(图1C和1D)。

用ESI-QTOF质谱分析每个柱的活性级分(C4 37分钟的级分、SCX6分钟的级分)。为寻找共同质量，对每个质谱进行比较，仅存在一个单同位素质量为495.33的共同质量值(图1E的上图和图1E的中图)。利用这一质量信息我们检索了结合在线数据库(Dictionary of Natural Products)并且鉴定其为棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(LPC)。为确认所述靶分子是否是LPC，我们用MS/MS谱分析了标准LPC和495.33质量的每种片段化模式(图1F)。正离子模式下的标准LPC产物-离子谱显示有几种来源于磷酸胆碱首基的碰撞诱导解离的离子，包括在m/z 183处最强的峰(图1F下图和图1G)。来自C4和SCX的495.33质量的片段化模式与标准LPC完全匹配(图1F上图和图1F中图)。基于上述物理性质，我们推断所述活性物质为LPC。

图1A至1E示出了从血清中鉴定新的葡萄糖吸收刺激分子。图1A示出了鉴定可刺激3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的血清因子的鉴定策略的示意图。图1B示出了血清的C18反相HPLC(Vydac 218TP1022，22mm×250mm)的洗脱图。相对2-脱氧-D-葡萄糖吸收被表示为在3T3-L1脂肪细胞中通过每个级分处理获得的增量与载体处理的增量的比例。活性级分D是人为选定的，并用胰蛋白酶处理以进一步纯化。图1C示出了级分D的C4反相HPLC(Vydac 214TP5215，2.1mm×150mm)的洗脱图。图1D示出了级分D的阳离子交换HPLC(Amersham Phamacia Mini-S HR 5/5，4.6mm×50mm)洗脱图。图1E示出了用ESI-TOF质谱仪进行的质量分析。图1C(上)、图1D(中)和标准棕榈酰(16:0)LPC(下)的活性级分的质谱图。图1F示出了图1E的每个质谱中495.33质量的质量片段化模式分析及其MS/MS谱。

实施例2

LPC对3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的作用。

为了研究LPC对葡萄糖吸收的作用，在存在各种浓度的标准LPC的情况下将3T3-L1脂肪细胞培养不同时间。LPC刺激3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的时间和剂量依赖性增加。LPC对葡萄糖吸收的统计学显著作用最开始是在1μM浓度时观察到的，最大的作用是在20μM时(图2A)。用20μM LPC时，在用LPC培养10分钟后葡萄糖吸收增加到最大(图2B)。这一浓度的LPC没有细胞毒性并且在40至50μM的临界胶粒浓度以下(Chaudhuri，P.etal.Circ Res 97，674-681，2005)。

已知骨骼肌葡萄糖代谢中具有重要作用，且骨骼肌中葡萄糖代谢的缺损通常会导致糖尿病(Petersen，K.F.et al.Am J Cardiol 90，11G-18G，2002；Beck-Nielsen，H.et al.Diabetologua 37，pp217-221，1994)。尽管该报导主要集中在3T3-L1脂肪细胞，我们也发现LPC以剂量依赖方式增加C2C12肌肉细胞中的葡萄糖吸收率(数据未示出)。这些结果意味着LPC在脂肪细胞和肌肉细胞的葡萄糖调节中都起到重要作用。

为了确定LPC的酰基链长度的变化是否影响葡萄糖吸收，测试了几种LPC。值得注意的是，肉豆蔻酰LPC和棕榈酰LPC刺激3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收，而硬脂酰LPC不刺激该葡萄糖吸收(图2C)。为了评估其他溶血磷脂是否能增强3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收，用几种溶血磷脂处理3T3-L1脂肪细胞。如图2D所示，棕榈酰LPE、棕榈酰LPG和棕榈酰LPI不刺激3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收，表明LPC的首基可能有助于3T3-L1脂肪细胞中由LPC刺激的葡萄糖吸收中的结构选择性。

图2A至2D示出了LPC对3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的作用。图2A示出了将6孔板中生长的3T3-L1脂肪细胞在不含葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液中平衡1小时并且用LPC(0-30μM)或胰岛素(10nM)孵育10分钟。在这些处理后，按材料方法部分所述测量[¹⁴C]2-脱氧-D-葡萄糖吸收10分钟。图2B示出了用LPC(20μM)孵育3T3-L1脂肪细胞0-20分钟。图2C和2D示出了3T3-L1脂肪细胞中相对[¹⁴C]2-脱氧-D-葡萄糖吸收，所述3T3-L1脂肪细胞在不存在(对照)或存在等摩尔浓度(20μM)的肉豆蔻酰溶血磷脂酰胆碱(14:0 LPC)、棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(16:0 LPC)、硬脂酰溶血磷脂酰胆碱(18:0 LPC)、棕榈酰溶血磷脂酰乙醇胺(16:0 LPE)、棕榈酰溶血磷脂酰肌醇(16:0 LPI)、棕榈酰溶血磷脂酰甘油(16:0 LPG)的情况下孵育10分钟。数值为三次独立的重复进行三次的实验的平均值±SE。*与基值相比P＜0.05。

实施例3

LPC刺激3T3-L1脂肪细胞中的GLUT4易位。

为了评估LPC增强3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖转运的能力是否是由LPC诱导的细胞表面葡萄糖转运蛋白的蛋白量的变化介导，测定了基态或者用LPC或胰岛素处理后质膜级分中GLUT4的蛋白水平，GLUT4蛋白是3T3-L1脂肪细胞中表达的主要葡萄糖转运蛋白同种型。同胰岛素一样，LPC诱导质膜中GLUT4蛋白含量显著增加(基值的180％)(图3A和3B)。结果表明胰岛素和LPC都会刺激GLUT4易位，且这些结果与葡萄糖吸收实验中的观察结果一致。

图3A和3B示出了LPC刺激3T3-L1脂肪细胞中的GLUT4易位。A)3T3-L1脂肪细胞中胰岛素对GLUT4向质膜(PM)易位的作用。LDM：低密度微粒体。用100nM胰岛素或20μM溶血磷脂刺激3T3-L1脂肪细胞10分钟。在每个实验中，计算用化合物刺激后GLUT4的整合密度值的相对增加或减少。B)定量描述了相对增加的量。数值为三次独立的重复进行三次的实验的平均值±SE。*P＜0.05。

实施例4

LPC通过PKCδ激活来刺激葡萄糖吸收。

脂肪细胞中葡萄糖吸收的胰岛素刺激需要激活IRS1、PI 3-激酶和随后激活AKT(Burgering，B.M.et al.Nature 376，pp.599-602，1995；Baumann，C.A.et al.Nature 407，pp202-207，2000)。因此，为确定响应于LPC而增加的葡萄糖吸收是否与胰岛素依赖性信号传导途径相关，检查了IRS1和AKT磷酸化。同预期的一样，用10nM胰岛素处理3T3-L1脂肪细胞会导致IRS1和AKT磷酸化的增强(附加数据)。相反，用LPC处理脂肪细胞对IRS1和AKT磷酸化无作用(附加数据)。由于LPC已经被证明能在各种细胞中激活常规的和新的PKC(Chaudhuri，P.et al.cell migration.Circ Res 97，674-681，2005)，接下来评估了LPC诱导增强的葡萄糖转运中是否涉及这些PKC。用2μM G6976(常规的PKC抑制剂)对3T3-L1脂肪细胞进行的30分钟预处理没有改变LPC刺激的葡萄糖吸收。但是，LPC刺激的葡萄糖吸收被10μM楸毒素(PKCδ抑制剂)的预处理完全抑制(图4A)。

为了更直接地测试PKC的作用，我们使用了腺病毒表达系统在3T3-L1脂肪细胞中过表达特定的PKC同种型和显性负性PKC同种型。我们测定了过表达野生型、显性负性PKCδ或显性负性PKCζ的3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收。与对照3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖转运活性相比，野生型PKCδ的表达诱导了LPC刺激状态的葡萄糖转运活性的少量增加。PKCδ的显性负性突变体的表达显著降低了LPC刺激的葡萄糖转运活性。相比之下，显性负性PKCζ的过表达既没有改变LPC诱导的葡萄糖吸收也没有改变胰岛素诱导的葡萄糖吸收(图4B)。这些研究结果证明PKCδ可能参与了LPC诱导的葡萄糖转运激活。

图4A和4B示出了LPC通过PKCδ激活来刺激葡萄糖吸收。图4A示出了将6孔板中生长的3T3-L1脂肪细胞在不含葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液中平衡1小时并且如所示地用2μM G6976、10μM楸毒素或单独用缓冲液处理30分钟。然后，将细胞用载体(空白条)或20μM LPC(填充条)处理10分钟。在这些处理后，按材料方法部分中所述测量[¹⁴C]2-脱氧-D-葡萄糖吸收10分钟。图4B示出了PKCδ和PKCζ蛋白的表达水平。用抗PKCδ或PKCζ抗体对对照3T3-L1脂肪细胞和表达PKCδ WT、PKCδDN或PKCζDN的3T3-L1脂肪细胞的裂解产物进行免疫印迹(上)，并且测量3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收(下)。用载体或20μM LPC或10nM胰岛素孵育对照3T3-L1脂肪细胞和表达PKCδWT、PKCδDN或PKCζDN的3T3-L1脂肪细胞10分钟。数值为三次独立的重复进行三次的实验的平均值±SE。*P＜0.05。

实施例5

小鼠模型中LPC的降葡萄糖作用。

在雄性白化(albino)ICR(癌症研究所)小鼠体内测验了LPC的体内效果。通过静脉内注射(i.v.)急性给予小鼠LPC(15或30μmol/kg)会在30分钟内使血糖水平呈现统计学显著性下降(图5A)。这种作用是剂量依赖性的并且不是由血液胰岛素水平的变化导致的(图5C)。

为确定LPC的不同分子种类是否活性不同，以30μmol/kg的等摩尔剂量给予(i.v.)具有不同长度酰基链的LPC分子或其他溶血磷脂或溶血磷脂酰乙醇胺。值得注意的是，只有棕榈酰LPC具有显著的降血糖作用(图5B)。接下来我们给链脲佐菌素(STZ)-处理的胰岛素缺陷小鼠注射(i.v.)30μmol/kg LPC。LPC显著降低了血糖浓度，该效果类似于胰岛素注射诱导的效果(图5D)。

接下来，我们研究了在胰岛素抗性肥胖db/db小鼠体内注射LPC是否也对糖血有作用。当注射LPC时，血糖下降到接近正常水平(图5E)。综上所述，这些数据表明LPC能够在I型和II型糖尿病小鼠模型以及正常小鼠体内调节血糖水平。

图5A至5E示出了静脉内注射给予的LPC在糖尿病小鼠模型中的抗糖尿病效力。图5A和5B示出了ICR小鼠体内LPC导致的急性葡萄糖降低。给八周龄雄性小鼠静脉内注射PBS、胰岛素、LPC或LPE。在给药后(0-120分钟)监测血糖。图5C示出了单次静脉内注射LPC后八周龄雄性小鼠体内的血清胰岛素水平。图5D示出了链脲佐菌素(STZ)-处理的胰岛素缺陷ICR雄性小鼠体内LPC导致的急性葡萄糖降低。图5E示出了胰岛素抗性肥胖C57BLKSJ-db/db小鼠体内LPC导致的急性葡萄糖降低。所有动物可以自由获得水。按学会指南进行动物管理。所有数据都表示为平均值±SE(n＝5-6)。*P＜0.05。

实施例6

LPS对葡萄糖吸收的作用。

6-1：LPS对3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的作用。

按照与LPC相关实施例基本相同的方法，测试LPS在3T3-L1脂肪细胞中的作用，结果在图6A和6B中示出。

将6孔板中生长的3T3-L1脂肪细胞在不含葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液中平衡1小时，并在存在等摩尔浓度(20μM)的溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷脂酰甘油(LPG)的情况下孵育10分钟。图6A示出了LPC和LPS特异性地刺激3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收。图6B示出了LPS以剂量依赖性方式(0-30μM)刺激葡萄糖吸收。数值为三次独立的重复进行三次的实验的平均值±SE。与基值相比*P＜0.05。

6-2：糖尿病小鼠模型中LPS的降葡萄糖作用。

按照与LPC相关实施例基本相同的方法，测试LPS在小鼠体内的作用，结果在图7A至7D中示出。

图7A至7B示出了糖尿病小鼠模型中静脉内给药的LPS的降葡萄糖效力。给八周龄雄性小鼠静脉内注射PBS、胰岛素、LPS。在给药后(0-120分钟)监测血糖。如图7所示，LPS以剂量依赖性方式降低正常小鼠体内的血糖水平。其他溶血磷脂(如S1P和LPE)不降低正常小鼠体内的血糖水平(图7B)。接下来，测量了单次静脉内注射LPS后八周龄雄性小鼠体内的血清胰岛素水平。这种作用不是由血液胰岛素水平的变化导致的(图7C)。接下来，我们给链脲佐菌素(STZ)-处理的胰岛素缺陷小鼠注射LPS。LPS显著降低了血糖浓度，该效果类似于通过胰岛素注射诱导的效果(图7D)。从这些数据来看，LPS剂量依赖性地降低了血糖水平并且不会影响胰岛素分泌。此外，LPS对胰岛素缺陷的I型糖尿病模型小鼠体内的葡萄糖调节有作用。所有动物可以自由获得水。按学会指南进行动物管理。所有数据都表示为平均值±SE(n＝5-6)。*P＜0.05。

实施例7

LPA对3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的作用。

7-1：LPA对3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的作用。

按照与LPC相关实施例基本相同的方法，测试LPA在3T3-L1脂肪细胞中的作用，结果在图8A和8B中示出。

为研究LPA对葡萄糖吸收的作用，在存在各种浓度的标准LPA的情况下将3T3-L1脂肪细胞培养不同时间。LPA刺激3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖吸收的时间和剂量依赖性增加。LPA对葡萄糖吸收的统计学显著作用最初是在1μM浓度时观察到的，最大的作用是在20μM时(图8A)。用20μM LPA时，在用LPA培养10分钟后葡萄糖吸收增加到最大(图8B)。图9A示出了将6孔板中生长的3T3-L1脂肪细胞在不含葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液中平衡1小时，并且用LPA(0-20μM)或胰岛素(10nM)孵育10分钟。在这些处理后，按材料方法部分中所述测量[¹⁴C]2-脱氧-D-葡萄糖吸收10分钟。图8B示出了用LPA(20μM)孵育3T3-L1脂肪细胞0-20分钟。

7-2：LPA刺激的葡萄糖吸收中的信号传导机制。

按照与LPC相关实施例基本相同的方法，测试LPA在3T3-L1脂肪细胞中的作用，结果在图9A和9B以及图10A和10B中示出。

为研究LPA是否通过其受体关联来影响葡萄糖吸收，我们使用了LPA受体拮抗剂Ki16425。图9A示出了LPA的葡萄糖吸收刺激作用被Ki16425的预处理所完全抑制。接下来，我们通过使用Gαi抑制剂-百日咳毒素检测了LPA是否激活与Gαi偶联的LPA受体。

图9B示出了LPA通过Gαi激活来刺激葡萄糖吸收。

已经有明确报导称胰岛素通过PI3-激酶依赖性信号传导途径刺激葡萄糖吸收。为研究LPA是否通过PI3-激酶依赖性信号传导途径增强葡萄糖吸收，我们检测了Akt(PI3-激酶的下游信号)受LPA处理的影响。图10A示出了LPA刺激Akt磷酸化。该磷酸化作用被PI3-激酶抑制剂LY294002的预处理所抑制。接下来，为检验LPA实际上是通过PI3-激酶信号途径刺激葡萄糖吸收，我们用LY294002预处理并测量3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖吸收。图10B示出了LPA对葡萄糖吸收的刺激依赖于PI3-激酶激活。

7-3：小鼠模型中LPA的降葡萄糖作用

按照与LPC相关实施例基本相同的方法，测试LPA在小鼠模型中的降葡萄糖作用，结果在图11A至11D中示出。

图11A至11B示出了小鼠模型中静脉给药的LPA的降葡萄糖效力。给八周龄雄性小鼠静脉内注射PBS、胰岛素、LPA。在给药后(0-120分钟)监测血糖。图11A示出了单次静脉内注射LPA后八周龄雄性小鼠体内的血清胰岛素水平。LPA以剂量依赖性方式降低正常小鼠体内的血糖水平。其他溶血磷脂(如S1P和LPE)不降低正常小鼠体内的血糖水平(图11B)。这种作用不是由血液胰岛素水平的变化导致的(图11C)。

最后，我们检测了LPA的降葡萄糖作用是否依赖于LPA受体激活。在LPA给药前，注射LPA受体抑制剂Ki16425。图11D示出了LPA的降葡萄糖作用被LPA受体抑制剂所抑制。从这些数据来看，LPA剂量依赖性地降低了血糖水平并且不会影响胰岛素分泌。此外，LPA的降葡萄糖作用受LPA受体激活的介导。所有动物可以自由获得水。按学会指南进行动物管理。所有数据都表示为平均值±SE(n＝5-6)。*P＜0.05。

实施例8

UCN对hIRcB细胞中的IR自磷酸化的作用

材料：达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(DMEM)购自BioWhittaker。胎牛血清(FBS)和马血清(ES)购自HyClone(Logan，UT)。促皮质素释放因子(CRF)、尾加压素(UCN)、应激素(stresscorpin)相关肽(SRP)和应激素由Anygen(Kwangju，Korea)合成。磷酸-胰岛素受体抗体、IRS抗体、IR抗体和AKT抗体购自Cell Signaling Technology Inc(Beverly，MA)。[¹⁴C]2-脱氧-葡萄糖购自Moravek (Mercury，CA)。所有其他的化学试剂均购自Sigma(St.Louis，MO)。

所有的实验(包括免疫印迹)最少独立重复三次。所有示出的免疫印迹都代表了超过三次独立的实验。定量的数据表示为平均值±SE。在适合的地方使用student’s t检验。P＜0.05的概率被认为是具有统计学显著性的。

图12A示出了CRF家族中的胰岛素致敏作用比较，该比较是通过用1μM CRF家族和/或2nM胰岛素或者单独用培养基孵育细胞1分钟获得的。UCN的胰岛素致敏作用以剂量(12B、12C)和时间(12D)依赖方式增加。图12B是通过用2nM胰岛素和不同剂量的UCN(从2nM到1μM)孵育细胞1分钟获得的。图12C是通过用100nM UCN和不同剂量的胰岛素孵育细胞1分钟获得的。用抗pTyr抗体通过蛋白质印迹来评估IR的磷酸化。图13D是通过用100nM UCN和/或10nM胰岛素孵育细胞0、2、10、30和60分钟获得的，然后用抗pIR抗体通过蛋白质印迹来评估IR磷酸化。用Image Gauge软件(Fuji Film)来定量测量IR自磷酸化作用。数值为三次实验的平均值±SE。*P＜0.05。

细胞培养

在补加10％(v/v)FBS的DMEM中培养hIRcB细胞。细胞在37℃下5％CO₂和95％空气的潮湿气氛中生长。

免疫沉淀和免疫印迹

按所述时间和剂量进行配体处理后，用冷PBS洗涤细胞并用含有蛋白酶抑制剂(0.5 mM PMSF、1μg/ml亮抑酶肽和5μg/ml抑肽酶)和磷酸酶抑制剂(30mM NaF、1mM Na₃VO₄和30mM Na₄O₇P₂)的裂解缓冲液(50mM HEPESpH 7.5、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、10％甘油)裂解。在4℃下孵育细胞裂解产物1小时。离心后(14,000×g，15分钟)，用5μg抗IR抗体和30μl树脂体积的固定蛋白A孵育等量的可溶提取物4小时。为进行凝胶电泳，将沉淀溶于Laemmli样品缓冲液中。样品用SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher and Schuell，BA85)。用含有5％脱脂奶粉的TTBS缓冲液(10mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl和0.05％Tween20)封闭。所述膜在室温下用一抗进行3小时检测。随后洗涤所述免疫印迹并在室温下用辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1小时，用TTBS缓冲液漂洗4次并用辣根过氧化物酶依赖型化学发光试剂(Amersham International.United Kingdom)显影。

在本实施例中，发现与其他家族(应激相关肽(SRP)和应激素(SCP))相比，尾加压素(UCN)和促皮质素释放因子(CRF)加强了IR过表达(hIRcB)细胞中胰岛素介导的IR磷酸化作用(图12A)。UCN和CRF单独对IR磷酸化都没有影响。尽管UCN和CRF都加强了胰岛素介导的IR磷酸化，但是与CRF相比，由于UCN与CRF受体1(CRFR1)的高亲和力使得UCN更有效力。UCN诱导的对胰岛素介导的IR磷酸化的增强以剂量(图12B)和时间(图12D)依赖性方式发生。此外，如图12C所示，低浓度胰岛素中的UCN对IR磷酸化的作用更有效力。这表明UCN特异性致敏hIRcB细胞中胰岛素介导的IR磷酸化。

实施例9

UCN对C2C12肌管中葡萄糖吸收和IR磷酸化的作用。

UCN增强了胰岛素诱导的葡萄糖吸收和IR、IRS和Akt的磷酸化。用2nMUCN和/或不同的胰岛素剂量(0-50nM)孵育肌管1分钟(插入的免疫印迹数据)。用抗pIRS和抗pAkt抗体通过蛋白质印迹分析评估IRS和Akt的磷酸化。葡萄糖吸收测定如下。

细胞培养

在补加10％(v/v)FBS的DMEM中培养C2C12细胞。细胞在37℃下5％CO₂和95％空气的潮湿气氛中生长。为了使C2C12细胞分化，将生长培养基换为补加2％(v/v)ES的DMEM，并培养7天。

葡萄糖吸收测定法

分化之后，洗涤细胞并用2ml Krebs-Ringer磷酸盐(KRP)培养3小时，所述Krebs-Ringer磷酸盐含有130mM NaCl、5mM KCl、1.3mM CaCl₂·2H₂O、1.3mM MgSO₄·7H₂O和10mM Na₂HPO₄·7H₂O(pH 7.4)。为测定UCN对葡萄糖吸收的作用，按所述条件用1ml KRP培养10分钟。通过加入[¹⁴C]2-DG(1μCi/ml)和非放射性2-DG(终浓度20mM)的混合物来进行反应，反应持续10分钟。吸出溶液并用冰预冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS，含8g NaCl、0.2gKCl、1.15g Na₂HPO₄·12H₂O和0.2g KH₂PO₄，溶于1L H₂O中)快速洗涤细胞两次。通过在1N NaOH中裂解细胞并进行闪烁计数来测定细胞相关的放射性。通过用细胞松弛素B(20μM/ml)孵育细胞来测量非特异性吸收。从总吸收中减去非特异性吸收以获得特异性吸收的值。

免疫沉淀和免疫印迹按实施例8的方法来进行。

已知IR激活在肌肉的葡萄糖吸收中起关键作用。UCN能够加强胰岛素介导的IR激活，所以它可能会调节葡萄糖吸收。为确证这一点，我们研究了C2C12肌管中的葡萄糖吸收和胰岛素介导的信号。在存在UCN的情况下，胰岛素诱导的IR磷酸化会被增强，而且胰岛素刺激的葡萄糖吸收也会显著升高(图13)，但是单独的UCN无此作用。这些结果表明UCN会加强C2C12肌管中胰岛素刺激的葡萄糖吸收，这可能是通过它对胰岛素介导的信号途径的致敏作用来诱导的。

实施例10

UCN对正常小鼠和STZ小鼠体内血糖控制的作用

已知UCN通过刺激HPA轴起到血糖增高剂的作用。UCN的这一体内功能与我们之前的体外结果(UCN涉及血糖水平的下调)相左。因此，为辨清它们之间的矛盾之处，我们给小鼠注射了不同剂量的UCN并检测血糖水平的变化。

图14A示出了UCN导致ICR小鼠体内血糖下降。所插入的免疫印迹数据是关于骨骼肌中UCN导致的IR磷酸化。给小鼠注射(静脉内)载体(溶于盐水的0.1％BSA)或UCN(0.1-100pM)。数值为四个对照以及四只UCN处理小鼠的平均值±S.D。图14B示出了UCN处理导致STZ小鼠体内血糖下降。所插入的免疫印迹数据是关于STZ小鼠骨骼肌中UCN处理导致的IR磷酸化。给小鼠注射(静脉内)载体(溶于盐水的0.1％BSA)、UCN(0.1pM)和/或胰岛素(1nM)。并在45分钟内测量血浆中的葡萄糖水平。数值为每组六只小鼠的平均值±S.D。*P＜0.05。

10-1：试验动物的准备

为准备正常的试验动物，从Hyochang Science购得重20-25g、8周龄的雄性癌症研究所(ICR)小鼠，在温度和光线受控的房间(20-22℃；12小时明，12小时暗的周期；在07:00时开灯)内将所述小鼠四只一组关在笼子里，并且按时提供饲料并不限量地提供水。按照韩国政府关于实验室动物使用管理的指南进行实验室操作。在体内研究中，禁食过夜后，给小鼠静脉内注射1％BSA盐水或UCN，然后用葡萄糖分析仪(Model AGM-2100，Allmedicus Inc.Anyang，Korea)按时测量血浆葡萄糖。

为准备STZ小鼠，从Hyochang Science购得重20-25g、8周龄的雄性癌症研究所(ICR)小鼠。在将雄性ICR小鼠禁食1天后，通过给所述动物腹膜内注射给予STZ(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(75mg/kg)来准备STZ诱导的糖尿病小鼠。并且在第二天再注射一次STZ。血浆葡萄糖浓度≥280mg/dl的小鼠被认为患有I型糖尿病。所有的试验都在注射STZ三天后进行。

10-2：小鼠骨骼组织内IR信号传导的分析

在禁食过夜后，给小鼠静脉内注射激动剂。15分钟后，通过快速切除比目鱼肌来处死小鼠并且立即在液氮中冷冻。通过在含有蛋白酶抑制剂(0.5mM PMSF、1μg/ml亮抑酶肽和5μg/ml抑肽酶)和磷酸酶抑制剂(30mM NaF、1mM Na₃VO₄和30mM Na₄O₇P₂)的裂解缓冲液(50mM HEPES pH 7.5、150mMNaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、10％甘油)中匀浆所述组织来制备裂解产物。通过在4℃下以14,000rpm离心10分钟来移除碎片。按之前所述进行免疫沉淀和蛋白质印迹。

同预期的一样，从100pM开始，单独的UCN可以增强血糖水平，但是值得注意的是，单独的0.1pM UCN会下调血糖水平。与体外系统相比，血液中存在基础胰岛素，所以我们认为在小鼠体内UCN可能与基础血液胰岛素共同发挥降葡萄糖作用并且在低于皮摩尔的浓度中HPA轴不会被激活。UCN可能会调节胰岛素分泌并且以不依赖胰岛素的方式下调血糖水平。因此，我们使用了胰岛素缺陷模型系统——链脲佐菌素(STZ)处理的小鼠来研究UCN在胰岛素介导的生理学中的功能。

如图14B所示，单独的UCN对血糖水平的变化没有作用。这表明在血糖水平的调节中UCN需要依赖胰岛素。但是，当UCN与无活性浓度的胰岛素被共同注射时，STZ小鼠体内血糖水平显著下降。这些结果与小鼠骨骼肌中IR的磷酸化高度相关。UCN显著地致敏了小鼠骨骼肌中胰岛素诱导的IR磷酸化。这些结果表明在体内尾加压素也具有胰岛素致敏作用。