公开/公告号CN101300343A
专利类型发明专利
公开/公告日2008-11-05
原文格式PDF
申请/专利权人 RNL生物技术株式会社;
申请/专利号CN200580051945.5
申请日2005-12-20
分类号C12N5/08(20060101);A61K35/12(20060101);
代理机构32200 南京经纬专利商标代理有限公司;
代理人楼高潮
地址 韩国首尔市
入库时间 2023-12-17 20:58:06
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-02-19
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N5/08 授权公告日:20110622 终止日期:20121220 申请日:20051220
专利权的终止
2011-06-22
授权
授权
2008-12-31
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-11-05
公开
公开
技术领域
本发明涉及来自人类脂肪组织的多能成体干细胞，具体涉及来自人类乳房脂肪组织的多能成体干细胞，其可通过形成球体而长时间保持未分化状态，并具有较高的增殖率。此外，本发明还涉及用于分离和保持成体干细胞的方法，用于将成体干细胞分化成神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和胰岛素释放胰腺β细胞的方法，用于治疗骨关节炎、骨质疏松症和糖尿病的细胞治疗剂，以及用于形成乳房组织的细胞治疗剂。
背景技术
21世纪生物技术以提高人类繁荣为最终目标提供了食物、环境和健康问题上新解决办法的可能性。近年来，使用干细胞的技术已经被认为是治疗不可治愈的疾病的新途径。以前，器官移植、基因治疗等被提出用于治疗不可治愈的人类疾病，但是由于免疫排斥、器官源短缺、载体发展的不足以及缺乏对疾病基因知识，不能将它们高效地使用。
由于这种原因，随着对干细胞研究兴趣的增加，人们已经认识到通过增殖和分化具有形成所有器官的能力的全能干细胞不仅能够治疗绝大多数疾病，而且基本治愈器官损伤。而且，许多科学家已经提出干细胞用于再生所有器官和治疗不可治愈疾病的适用性，包括帕金森症、各种癌症、糖尿病和脊柱损伤。
干细胞指的是不仅具有自我复制能力而且具有分化成至少两种细胞的能力的细胞，其可被分成全能干细胞、亚全能干细胞和多能干细胞。
全能干细胞是具有能够形成一个完整个体的全能性的细胞，卵母细胞和精子受精后到8细胞期的细胞具有这些性质。当这些细胞被分离并移植到子宫中时，它们可发育成一个完整个体。
亚全能干细胞是能够形成来源于外胚层、中胚层和内胚层的各种细胞和组织的细胞，亚全能干细胞来自定位在受精4-5天后产生的胚泡内的内部球团。这些细胞被称为“胚胎干细胞”，并可分化成各种其它组织细胞，但不能形成新的活体组织。
多能干细胞是仅能分化成对含有这些细胞的组织和器官具有特异性的细胞，多能干细胞不仅在胎儿、新生儿和成人阶段的各种组织和器官的生长和发育中涉及，而且还在保持成人组织的内环境平衡和当组织损伤时诱导再生的功能中涉及。组织特异性多能细胞统称为“成体干细胞”。
成体干细胞通过从各种人类器官中收集细胞并使细胞发育成干细胞而获得，其特征在于它们仅仅分化成特定组织。但是，近年来，用于将成体干细胞分化成各种组织包括肝细胞的实验也明显获得成功。
多能干细胞首先从成人骨髓细胞中分离(Jiang等人，Nature，418：41，2002)，然后在其它各种成人组织中均被发现(Verfaillie，Trends Cell Biol.，12：502，2002)。换言之，虽然骨髓是最广为人知的干细胞源，但多能干细胞在皮肤、血管、肌肉和脑中也被发现(Tomas等人，Nat.Cell Biol.，3：778，2001；Sampaolesi等人，Science，301：487，2003；Jiang等人，Exp.Hematol.，30：896，2002)。但是，成人组织诸如骨髓中的干细胞存在非常少，这些细胞在不诱导分化的情况下难以培养，在不存在特定筛选培养基的情况下同样也难以培养。也就是说，在体外保持这些分离的干细胞非常困难。
近年来，发现脂肪组织是一种新的多能干细胞源(Cousin等人，BBRC.，301：1016，2003；Miranville等人，Circulation，110：349，2004；Gronthos等人，J.Cell Physiol.，189：54，2001；Seo等人，BBRC.，328：258，2005)。也就是说，据报道通过吸脂术得到的人类脂肪组织中含有一组未分化细胞。其具有分化成脂肪细胞、成骨细胞、成肌细胞、成软骨细胞的能力(Zuk等人，Tissue Eng.，7：211，2001；Rodriguez等人，BBRC.，315：255，2004)。这种脂肪组织具有的优点是可以被大量提取，因此，作为克服现有技术的缺点的新干细胞源而引起注意。
而且，使用动物模型实验所进行的新近研究表明，脂肪组织源细胞具有再生肌肉并刺激神经血管分化的能力。因此，这些脂肪组织源细胞作为新的干细胞源而引起注意。
到目前为止已知的脂肪组织源干细胞包括可分化成上皮细胞的人脂肪源成体干细胞(Brzoska等人，BBRC，330：142，2005)，可分化成成骨细胞和脂肪细胞的人脂肪源成体干细胞(Cao等人，BBRC，332：370，2005)，可分化成神经细胞的人脂肪源成体干细胞(Safford等人，BBRC，294：371，2002)，可分化成脂肪细胞的鼠脂肪源干细胞(Ogawa等人，BBRC，319：511，2004)，可分化成成骨细胞和成软骨细胞的鼠脂肪源干细胞(Ogawa等人，BBRC，313：871，2004)，可分化成软骨细胞的人脂肪源干细胞(Biomaterials，25：3211，2004)，可分化成神经细胞的鼠脂肪源干细胞(Fujimura等人，BBRC，333：116，2005)，可分化成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或者肌肉细胞的脂肪源干细胞(美国专利US6777231)。
但是，到目前为止绝大多数已知的脂肪源干细胞是来源于除人类以外的其它动物的脂肪组织的干细胞。即便它们是来源于人类脂肪组织的干细胞，它们也被限制在通过腹部脂肪吸脂术获得的组织来源，并且由这些干细胞分化而成的细胞的种类也是有限的。特别地，分离的干细胞具有低增殖率，并且难以长期保持在未分化状态，因此，在应用方面受到限制。
因此，本发明的发明人付出了极大的努力来开发具有高增殖率的成人多能干细胞，它们可通过形成球体而长期保持在未分化状态，并可分化成更多种细胞，结果发现，从人类脂肪组织中分离的多能干细胞可分化成各种细胞，包括成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、星形细胞、脂肪细胞和胰岛素释放胰腺β细胞，具有非常高的增殖率，并可通过形成球体长期保持在未分化状态，由此完成本发明。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供脂肪组织源多能成体干细胞，其具有高增殖率并可通过形成球体长时间保持在未分化状态，本发明还提供了这种多能干细胞的生产方法。
本发明的另一个目的在于，提供将所述多能干细胞分化成神经细胞、星形细胞、软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞以及胰岛素释放胰腺β细胞的方法，以及含有所述分化细胞或者成体干细胞的治疗剂。
为了实现上述目的，本发明提供了用于生产成体干细胞的方法，包括在含有N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的培养基中培养人脂肪组织源球团，然后收集培养的细胞，所述成体干细胞的特征在于：(a)对所有CD73、CD90、CD29、CD44和CD105产生阳性免疫应答，并对所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR产生阴性免疫应答；(b)附着于塑料生长，显示梭状形态学特征，并在含有CORM-2的培养基中形成球体，从而能够长时间保持为在分化状态；和(c)具有分化成中胚层源细胞的能力。
在本发明中，含NAC的培养基另外包括抗坏血酸、钙、rEGF、BPE、胰岛素和皮质醇。
另一方面，本发明提供了一种将成体干细胞细胞保持在未分化状态的方法，该方法包括在含有CORM-2的培养基中培养由所述方法制备的成体干细胞使其形成球体。
在本发明中，含有CROM-2的培养基优选为无血清培养基，其另外包含抗真菌抗生素溶液、皮质醇、胰岛素、rEGF、FGF、B27和β-巯基乙醇。
在又一方面，本发明提供了由所述方法生产的成体干细胞，其特征在于：(a)对所有CD73、CD90、CD29、CD44和CD105产生阳性免疫应答，并对所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR产生阴性免疫应答；(b)附着于塑料生长，显示梭状形态学特征，并在含有CORM-2的培养基中形成球体，从而能够长时间保持在未分化状态；和(c)具有分化成中胚层源细胞的能力。
在本发明中，成体干细胞优选以未分化状态培养到至少16代，中胚层源细胞优选为软骨细胞、成骨细胞、神经细胞、星形细胞、脂肪细胞、以及胰岛素释放胰腺β细胞。
在再一方面，本发明提供了将成体干细胞分化成神经细胞的方法，所述方法包括下列步骤：(a)在含有BME和FBS的DEME培养基中预培养成体干细胞；和(b)用DMSO和BHA处理预培养的培养液以便诱导分化成神经细胞。而且，本发明提供了用于治疗神经疾病的细胞治疗剂，其含有所述分化的神经细胞作为活性成分。
在还一方面，本发明提供了用于将成体干细胞分化成软骨细胞的方法，所述方法包括在含有TFG-β1、L-抗坏血酸盐-2-磷酸盐和胰岛素的α-MEM培养基中培养成体干细胞。而且，本发明提供了用于治疗骨关节炎的细胞治疗剂，其含有所述分化的软骨细胞作为活性成分。
在又一方面，本发明提供了用于将成体干细胞分化成成骨细胞的方法，所述方法包括将成体干细胞与磷酸三钙(TCP)混合并同基因移植(isotransplanting)该混合物。而且，本发明提供了用于治疗骨缺损的细胞治疗剂，其含有所述分化的成骨细胞作为活性成分。
在还一方面，本发明提供了用于将成体干细胞分化成脂肪细胞的方法，所述方法包括在含有地塞米松、抗炎吲哚酸、胰岛素和IBMX的α-MEM培养基中培养成体干细胞。而且，本发明提供了用于形成乳房组织的细胞治疗剂，其含有所述分化的脂肪细胞作为活性成分。
在再一方面，本发明提供了将成体干细胞分化成胰岛素释放胰腺β细胞的方法，所述方法包括下列步骤：(a)将成体干细胞在含有尼克酰胺、β-巯基乙醇和FBS的低葡萄糖DEME培养基中培养12-72小时；和(b)将培养的细胞在含有尼克酰胺、β-巯基乙醇和FBS的高葡萄糖DEME培养基中培养4-7天。而且，本发明提供了用于治疗糖尿病的细胞治疗剂，其含有所述胰岛素释放胰腺β细胞作为活性成分。
在又一方面，本发明提供了用于治疗神经疾病的细胞治疗剂，其含有具有分化成神经细胞能力的成体干细胞作为活性成分。
在又一方面，本发明提供了用于治疗糖尿病的细胞治疗剂，其含有具有分化成胰岛素释放胰腺β细胞能力的成体干细胞作为活性成分。
在又一方面，本发明提供了用于治疗骨关节炎的细胞治疗剂，其含有具有分化成软骨细胞能力的成体干细胞作为活性成分。
在又一方面，本发明提供了用于治疗骨缺损的细胞治疗剂，其含有具有分化成成骨细胞能力的成体干细胞作为活性成分。
在又一方面，本发明提供了用于形成乳房组织的细胞治疗剂，其含有具有分化成脂肪细胞能力的成体干细胞作为活性成分。
通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的上述和其它目的、特征和实施方式将会更显而易见地被理解。
附图说明
图1显示了根据本发明的人脂肪组织源多能干细胞的放大100倍拍摄的照片。
图2显示了根据本发明的人脂肪组织源多能干细胞的累计倍增数目水平(CPDL)。A-1和A-2：根据本发明的人脂肪组织源多能干细胞；B和C：根据现有技术的脂肪源干细胞。
图3显示了根据本发明的人乳房脂肪组织源多能干细胞培养7天后形成的球体的放大200倍拍摄的照片。
图4显示了通过干细胞在琼脂中增殖形成的球体形状的放大200倍拍摄的照片。
图5示出了放大100倍拍摄的照片，其显示了巢蛋白，Oct4，SH2，SH3/4在本发明的人脂肪组织源多能干细胞中的表达，该人脂肪组织源多能干细胞在含有MEBM的CORM-2培养基中培养成球体然后免疫染色。
图6显示了根据本发明的人脂肪组织源多能干细胞分化成神经细胞和星形细胞。
图7显示了由根据本发明的人脂肪组织源多能干细胞分化而成的脂肪细胞的放大200倍拍摄的照片。A：分化阶段对比；B：通过油红O染色法染色。
图8显示了由根据本发明的人脂肪组织源多能干细胞分化而成的软骨细胞的放大100倍拍摄的照片。A：分化阶段对比；B：爱尔新蓝染色结果，显示分化成软骨细胞。
图9显示了由根据本发明的人脂肪组织源多能干细胞分化而成的成骨细胞。A：TCP单独处理组；B：TCP和骨髓干细胞处理组；和C：TCP和脂肪源干细胞处理组。
图10显示了由根据本发明的人脂肪组织源多能干细胞分化而成的胰岛素释放胰腺β细胞的免疫染色结果。
具体实施方式
本发明涉及从人乳房脂肪组织分离的多能干细胞。
在本发明中，多能干细胞首先以下列方式从人乳房脂肪组织中分离并纯化。分离的人脂肪组织用PBS清洗，并精细地切割然后在添加了1型胶原酶(1mg/ml)的DMEM培养基中在37℃消化2小时。用PBS清洗后，将组织以1000rpm离心5分钟。吸去上清，用PBS清洗保留在底部的球团，然后以1000rpm离心5分钟。得到的球团通过100μm筛过滤除去残渣，接着用PBS清洗。然后，球团在DMEM培养基(10％FBS，2mM NAC，0.2mM抗坏血酸)中培养。过一夜后，用PBS将未附着的细胞洗去，剩余细胞在K-NAC培养基(角质化细胞-SFM培养基+2mMNAC+0.2mM抗坏血酸+0.09mM钙+5ng/ml rEGF+50μg/ml BPE+5μg/ml胰岛素+74ng/ml皮质醇)中培养，同时每隔两天更换一次培养基，从而得到人乳房脂肪组织源多能干细胞溶液。
检查分离的人乳房脂肪组织源多能干细胞的增殖率，结果发现，CPDL逐渐增加到16代数，表明干细胞具有高增殖率。
同时，对于干细胞的球体培养物，将5×104-1×105细胞/ml分离的人乳房脂肪组织源多能干细胞接种到含有MEBM培养基(10μM CORM-2(三羰基二氯代钌(II)二聚体)、B27、5ml抗真菌抗生素溶液(100X)，1μg/ml皮质醇、5μg/ml胰岛素，20ng/ml EGF，40ng/ml FGF和β-巯基乙醇)的6孔板的每个孔中，结果，它们从接种3天后就开始形成球体。这显示干细胞具有高增殖率并保持在未分化状态。
从上述得到的人脂肪组织源干细胞培养液中获得表达所需表面抗原的多能干细胞的方法包括，使用具有分选功能的流式细胞仪的FACS方法(Int.Immunol.，10(3)：275，1998)，使用磁珠的方法和使用抗体特异地识别多能干细胞的淘选方法(J.Immunol.，141(8)：2797，1998)。而且，用于从大量培养液中获得多能干细胞的方法包括其中在细胞表面上表达的抗体特异地识别分子(此后称为“表面抗原”)被单独使用或者结合成列(as column)使用的方法。
流式细胞仪可包括水滴电荷法和细胞捕获法。在这些方法的任何一种中，特异地识别细胞表面上的抗原的抗体被荧光标记，将与细胞表面上表达的分子结合的抗体发出的荧光强度转化成电信号，从而对抗原的表达量进行定量。还能够通过结合使用的荧光类型来分离表达多个表面抗原的细胞。在这种情况下可使用的荧光的例子包括FITC(荧光异硫氰酸酯)、PE(藻红蛋白)、APC(别藻蓝蛋白)、TR(Texas Red)、Cy3、CyChrome、Red 613、Red 670、TRI-Color、Quantum Red等。
使用流式细胞仪的FACS方法包括：其中从分离的细胞中通过例如离心并直接用抗体染色来收集上述干细胞培养液的方法；和其中细胞在合适的培养基上培养并生长然后用抗体染色的方法。细胞的染色通过将识别表面抗原的初级抗体与靶细胞样品混合并在冰上将混合物培养30分钟到1小时。当初级抗体被标记上荧光后，清洗后用流式细胞仪分离细胞。当初级抗体没有被标记上荧光时，清洗后混合与初级抗体反应的细胞和荧光标记的对初级抗体具有结合活性的第二抗体，并在冰上培养30分钟到1小时。清洗后，由初级抗体和第二抗体染色的细胞用流式细胞仪分离。
各种表面抗原可包括造血相关抗原、间叶细胞的表面抗原和对神经系统神经元特异的抗原。造血相关抗原包括CD34、CD35等，间叶细胞的表面抗原包括SH-2、SH-3等，对神经系统神经元特异的抗原包括NSE、GFAP等。识别上述表面抗原的抗体单独或结合使用允许获得所需细胞。
根据本发明的分离的多能成年干细胞使用流式细胞术分析，结果，对CD73、CD90、CD29、CD44和CD105显示阳性应答。而且，多能干细胞对所有的CD33、CD34、CD45、CD4，CD31、CD62p、CD14和HLA-DR显示阴性免疫应答。
另外发现，根据本发明的分离多能干细胞是可分化成神经细胞、星形细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及胰岛素释放胰腺β细胞的多能干细胞。
实施例
随后将通过实施例详细描述本发明。但是应当理解，这些实施例仅用于说明的目的，而不构成对本发明的范围的限制。
实施例1：从脂肪组织中分离多能干细胞
脂肪组织由首尔国立大学乳腺癌中心提供的妇女乳房组织中分离，用PBS清洗然后精细切割。切割的组织在添加了1型胶原酶(1mg/ml)的DMEM培养基中在37℃下消化2小时。消化的组织用PBS清洗然后以1000rpm离心5分钟，吸去上清，并用PBS清洗保留在底部的球团，然后以1000rpm离心5分钟。得到的球团经100μm筛过滤除去残渣，然后用PBS清洗。得到的细胞在DMEM培养基(10％FBS，2mM NAC，0.2mM抗坏血酸)中培养。过一夜后，用PBS洗去未附着的细胞，并在角质形成细胞-SFM培养基(含有2mM NAC，0.2mM抗坏血酸，0.09mM钙，5ng/ml rEGF，50μg/ml BPE，5μg/ml胰岛素和74ng/ml皮质醇)中培养，同时以两天为间隔更换培养基，由此分离多能干细胞。图1显示了上述分离的人脂肪组织源多能干细胞放大100倍拍摄的照片。
实施例2：脂肪组织源干细胞的增殖率检查
脂肪组织根据上述实施例1中描述的分离方法从每种不同人乳房组织样品获得。为了检查来自分离的人乳房脂肪组织的多能干细胞的增殖率，将2×105个细胞接种到T-75烧瓶中并测定CPDL(累计倍增数目水平)并表示为代数的函数。CPDL是细胞增殖率的指数表示并表示为下列方程。
CPDL＝ln(Nf/Ni)/ln2，其中Ni：初始接种细胞数；和Nf：最终细胞数。
结果，如图2的“A-1”和“A-2”中所示，根据本发明的成体干细胞(hMAD-MCS1和hMAD-MCS2)在传代16代数时显示了大约50的CPDL值。
同时，图2的“B”和“C ”显示了作为代数的函数的现有技术的人脂肪组织源干细胞的CPDL值(Lin等人，Stem Cells and Development，14：92，2005；Zuk等人，Tissue Eng.，7：211，2001)。如图2所示，在代数为7和13时细胞的CPDL值分别为30-35和21。
这些结果显示根据本发明的成体干细胞具有非常高的增殖率。
实施例3：脂肪源多能干细胞的免疫学特性
在实施例1中得到的脂肪组织源多能干细胞用PBS清洗并用胰蛋白酶处理。收集处理的细胞并以1000rpm离心5分钟。除去上清然后用2％FBS和PBS的混合物清洗，然后以1000rpm离心5分钟。除去上清，将细胞悬浮于PBS中，对每种样品将1×105个细胞分散到孔板中，将抗体(R-藻红蛋白结合的鼠抗人单克隆抗体)放置到每个孔中并在冰上培养40分钟。培养后，将培养基以1000rpm离心5分钟。除去上清并用PBS清洗细胞并以1000rpm离心5分钟。再次除去上清，用PBS清洗细胞并以1000rpm离心5分钟。除去上清后，将细胞与1％的多聚甲醛混合并使用流式细胞仪分析。
表1：脂肪源干细胞的表面抗原的FACS分析
结果，如表1所示，根据本发明的脂肪组织源成体干细胞显示了对CD73为91％，对CD90为97％，对CD29为96％，对CD44为83％，以及对CD105为80％的阳性应答。而且，本发明的干细胞对所有CD33、CD34、CD45、CD4、CD31，CD62p、CD14和HLA-DR显示阴性免疫应答。
实施例4：脂肪组织源多能干细胞的球体形成
将实施例1中得到的5×104-1×105/ml人乳房脂肪组织源多能干细胞接种到含有10μM CORM-2，5ml抗生素溶液(100X)，1μg/ml皮质醇，5μg/ml胰岛素，20ng/ml EGF，40ng/ml FGF，B27和β-巯基乙醇的无血清MEBM培养基的6孔板的每个孔中。结果，接种后3-7天细胞开始形成球体，如图3和图4所示，甚至在接种后7-10天细胞增殖形成球体。
而且，根据本发明的干细胞在琼脂中培养。结果，如图4所示，细胞形成球体。
同时，将实施例1中得到的5×104个干细胞接种到24孔板的每个孔中并在每个代数测定球体的数目(见表2)。结果，如表2所示，细胞保持球体，表明细胞可增殖并长期保持。而且，如图5所示，Oct4阳性表达，表明细胞具有高增殖率并保持在未分化状态。
表2
实施例5：脂肪组织源干细胞的免疫染色分析
将实施例4中得到的脂肪组织源干细胞球用PBS清洗3次并与含PBS的4％多聚甲醛混合30分钟。用PBS清洗3次后，将球体用含有0.1％Triton-X100的PBS渗透10分钟。用PBS清洗3次后，允许球体与10％NGS反应1小时，然后与含有初级抗体的PBS反应过夜。用PBS清洗3次后，允许球体与第二抗体在暗室中反应1小时。用PBS清洗3次后，对球体进行测定(mount)。
结果，如图5所示，根据本发明的多能干细胞球对所有可被认为是神经祖细胞的标记物的巢蛋白、可被认为是未分化细胞的标记物的Oct4和间叶细胞的标记物SH2(CD105)及SH3/4(CD73)都显示阳性应答。
实施例6：脂肪源多能干细胞分化成神经细胞和星形细胞
实施例1中得到的脂肪组织源多能干细胞在添加了1mM BME和10％FBS的DMEM培养基中预培养24小时。预培养后，为了诱导神经细胞分化，将干细胞在含有1％DMSO和100μM BHA(丁基羟基茴香醚)的培养基中培养90分钟以便诱导分化成神经细胞，接着进行免疫染色(图6)。结果，如图6所示，根据本发明的人脂肪组织源多能干细胞对神经系统中的星形细胞特异的抗原GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白)和神经细胞特异性物质MAP2(微管相关蛋白2)都显示阳性应答。
图6中第一行的照片显示阴性对照组的结果，表示分化的细胞本身没有显示FITC和TRITC的荧光。第二行左侧的MAP2照片显示TRITC红色荧光，表明MAP2表达。通过这些阶段对比照片和融合照片发现，红色荧光是由其中表达MAP2的细胞发出的荧光。而且，第三行左侧的GFAP照片显示FITC绿色荧光，从阶段对比照片和融合照片可以看出，绿色荧光是由表达GFAP的细胞发出的荧光。这些结果表明，根据本发明的人脂肪源多能干细胞分化成神经细胞和星形细胞。
实施例7：脂肪源多能干细胞分化成神经细胞
实施例1中得到的脂肪组织源多能干细胞在含有5％FBS，1μM地塞米松，200μM抗炎吲哚酸、10μg/ml胰岛素和0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)的α-MEM培养基中培养两周以便诱导分化成脂肪细胞然后使用油红O染色法进行分析。结果，如图7所示，观察到人脂肪组织源多能干细胞分化成脂肪细胞。
实施例8：脂肪源多能干细胞分化成软骨细胞
将实施例l中得到的107个干细胞以10μμl的量接种到24孔板的每个中心。然后，将细胞在含有5％FBS，10ng/ml TFG-β1，50μM L-抗坏血酸盐-2-磷酸盐和6.25μg/ml胰岛素的α-MEM培养基中培养两周，以便诱导分化成软骨细胞。然后，多能干细胞是否分化成软骨细胞使用爱尔新蓝染色法进行分析。结果，如图8所示，人脂肪组织源多能干细胞分化成软骨细胞。
实施例9：脂肪源多能干细胞分化成成骨细胞
将实施例1中得到的107个干细胞与TCP(磷酸三钙)混合并皮下同基因移植到狗的身体中。14天后，使用H&E染色法处理并分析。结果，如图9所示，用TCP单独处理的组(A)显示炎性细胞渗透到部分周围的TCP中，用TCP和骨髓干细胞的混合物处理的组(B)显示炎性响应保持与周围TCP未接触。但是，在用TCP和脂肪源干细胞的混合物处理的组(C)中，绝大多数TCP被吸收，并观察到典型的初始骨生成，还观察到成骨细胞状细胞、多核破骨细胞状细胞和骨基质。这些结果表明，人脂肪组织源多能干细胞分化成成骨细胞。
实施例10：脂肪源多能干细胞分化成胰岛素释放胰腺β细胞
实施例1中得到的脂肪组织源多能干细胞在含有10mmol/L尼克酰胺、1mmol/L β-巯基乙醇和10％FBS的低葡萄糖DMEM培养基中培养24小时，然后在含有10mmol/L尼克酰胺、1mmol/L β-巯基乙醇和5％FBS的高葡萄糖DMEM培养基中培养5天，以便诱导分化成胰岛素释放胰腺β细胞。诱导分化后，通过免疫染色法分析细胞，结果在图10中显示。如图10所示，细胞中存在C-肽和胰岛素。如同本领域已知的那样，被分成胰岛素和C-肽的胰岛素原在胰岛素释放胰腺β细胞中产生。因此，上述结果表明，根据本发明的脂肪组织源干细胞分化成了胰岛素释放胰腺β细胞。
虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，对本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅仅是优选实施方式，而不是对本发明的范围的限制。因此，本发明的实际范围将由所附的权利要求书及其等同物限定。
工业实用性
如上面详细描述的那样，虽然根据本发明的多能干细胞是成体干细胞，它们可分化成比现有脂肪源成体干细胞分化的那些细胞更多种类的细胞。特别地，本发明的成人多能干细胞具有分化成神经细胞、星形细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞或者胰岛素释放胰腺β细胞的能力，并有效地治疗骨质疏松症、骨关节炎、神经疾病、糖尿病等，还用于形成乳房组织。而且，本发明的成体干细胞在无血清培养基中形成球体，使它们可被高纯度地分离，长时间保持未分化状态并具有高增殖率。因此，本发明的成体干细胞作为细胞治疗剂是有用的。
机译： 包含人类脂肪组织和毛囊细胞衍生的多能干细胞的细胞治疗剂
机译： 包含源自人脂肪组织和毛细胞的多能干细胞的细胞治疗剂
机译： 源自人脂肪组织的多能干细胞和包含其的细胞治疗剂
