对抗致病媒介的植物保护

本发明涉及用于保护植物对抗不同的致病媒介例如真菌、病毒和 细菌的组合物和方法。本发明可以单独使用或者替代和/或联用其他植 物保护方法，并适于多种植物种属的治疗。

在致病媒介中，引起真菌性或者隐花植物(cryptogamic)疾病的真菌 具有最大的经济影响。每个植物种属均易感染一种或者多种主要疾病， 所述疾病能够强烈降低它们的生命力、生长并最终降低作物的数量和 质量。

不同参数影响病情发展，例如土壤条件和施肥，品种易感性，生 长系统(前作，栽培，每公顷植物或者秧苗的数量，修剪系统，等等)， 尤其是气候条件。但作用于这些参数的某一些常常并不足以有效限制 疾病引起的损害。所以，为了避免这些损害、优化并确保产量，农民 在合适的时间使用作物保护产品、通常是保护性的产品来处理作物。 多数情况下，使用的产品是化学品。它们中的大多数非常有效，但对 使用它们的人可能造成健康风险，并且在处理过的产品、土壤和排水 中留下残留物。此外，重复使用作用于相同代谢位点的某些杀真菌剂 使菌株对这些杀真菌剂产生抗性。

为了克服这一点，必须限制每年用同类农用化学产品的处理次数， 交替使用不同作用方式的化学品类别，并使用所有其他的对致病媒介 不利的方法。

在这种情况下，确实非常需要抵御植物疾病的替代解决方案。理 想的，这些解决方案应该以不同于现有化学杀真菌剂的方式起作用， 在产品和环境中没有化学残留，对使用它的人更安全和更健康。这种 处理可以单独使用或者替代和/或联用现有的化学处理或者所有其他的 处理，以防止这些致病媒介以及它们的抗性菌株的产生并限制其发展， 限制对人和环境的风险。

发明概述

本发明提供新的组合物和方法，用于植物对抗致病媒介的治疗或 者保护。具体地，本发明涉及证明了酵母细胞壁出乎意料地具有有效 保护植物抵御致病媒介感染的能力。这种效果通过简单的将植物接触 细胞壁就可以获得，例如通过喷雾。

所获结果显示用酵母细胞壁处理植物不仅为植物被处理的器官或 者被处理的部分提供保护(接触点的直接作用)，而且为后面出现的 任何器官提供保护。细胞壁无法通过渗入植物内部由树液转运，因此 它不是内吸作用。同时，这种结果表明了植物免疫防御机制的诱导， 因此使我们预见本发明组合物和方法的一个月或者更长的长期保护以 及多用途作用。

因此，本发明的一个实施方式涉及酵母细胞壁或者包含酵母细胞 壁的组合物在治疗或者保护植物对抗致病媒介尤其是真菌、细菌或者 病毒造成或者引起的疾病中的用途。

本发明的另一个实施方式涉及酵母细胞壁或者包含酵母细胞壁的 组合物诱导或者刺激植物对抗致病媒介的免疫防御的用途。

本发明还涉及治疗或者保护植物对抗致病媒介尤其是真菌、细菌 或者病毒造成或者引起的疾病的方法，包括给植物或者其部分施用酵 母细胞壁或者包含酵母细胞壁的组合物。

本发明的另一个实施方式是诱导或者刺激植物的免疫防御机制 (对抗致病媒介)的方法，由给植物或者其部分施加酵母细胞壁或者 包含酵母细胞壁的组合物构成。

在下文中还将进一步描述，本发明能够用于各类种植，尤其是禾 本科和双子叶植物，一年生、二年生和多年生植物，蔬菜，谷类包括 小麦、大麦和水稻，玉米，高粱，粟，含油种子作物，蛋白质作物 (proteaginous)，马铃薯，甜菜，甘蔗，烟草，木本植物，树(果树 或非果树)，藤本植物，观赏植物，等等。此外，致病媒介可以是各 种类型的，例如真菌，细菌，病毒，支原体，螺原体或者类病毒。

本发明使用的酵母细胞壁可以来自酵母的任何种属，尤其是糖酵 母菌属(Saccharomyces genus)，尤其是酿酒酵母(S.cerevisiae)，可 以根据本领域技术人员已知的技术获得或者制备，这将在下文中描述， 尤其是自溶，分离，浓缩，等等。

本发明的另一个实施方式涉及一种包括酵母细胞壁的(植物药物) 组合物，其可以给药或者施用于植物上或者与植物或者只与其任意特 定器官接触，尤其是叶，花，果实，茎，干或者根。这种组合物可以 被描述为植物药物产品。

所述组合物可以采用以下形式：浓缩或非浓缩的液体，可湿的或 非可湿的粉剂，可分散的或者其他团粒，或者适合将酵母细胞壁施用 到治疗靶标植物器官的所有其他形式，例如，在水或者其他载体中稀 释、悬浮或者其他处理后喷雾在土壤中植物的地上部分，或者通过在 植物根部供给溶液，等等。

优选的，本发明的组合物还包括制剂、分散剂、稳定剂、表面活 性剂，等等。

本发明的另一目的涉及一种与杀真菌剂、抗病毒剂或者抗细菌剂 组合的包括酵母细胞壁的(植物药物)组合物，这样的话它们可以同 时、分别或者在不同的时间施加。

本发明还涉及一种抵御植物中致病媒介引起的疾病的方法，包括 施用酵母细胞壁，或者包括酵母细胞壁的组合物，任选替代或者组合 另一种抗所述致病媒介的积极疗法。

本发明还涉及一种预防或者限制致病原对一组特定活性物质产生 抗性的方法，其中植物用酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的组合物处 理以减少抗性菌株对所述活性物质组的选择压力；或者其中来自所述 活性物质组的物质对植物的处理被酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的 组合物对所述植物的处理替代或者与其联用。

本发明还涉及包括酵母细胞壁的组合物通过降低感染水平和/或 限制接种物的释出，在提高植物卫生保护的整体功效中的用途。

本发明还旨在使用包括酵母细胞壁的组合物来获得长期、部分或 者完全的植物检疫保护，例如至少一个半月。

本发明还涉及在作物或者植物处理期间限制在消费品之中或之 上、土壤中和水中农用化学品的残留量。该方法包括用酵母细胞壁或 者包括酵母细胞壁的组合物处理所述作物或者植物。

本发明还涉及酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的组合物在有机或 者生态农作中预防或者治疗疾病的用途。

发明具体内容

如先前所述，本发明涉及一种作为预防或者治愈的抵御植物中致 病媒介的方法和产品。尤其是，本发明取决于证明酵母细胞壁有益和 出乎意料的特性，并计划它们在抵御致病媒介引起的植物疾病中的用 途。

本发明尤其基于以下发现：酵母细胞壁能够保护用本发明组合物 直接处理(即，它们直接作用于接触部位)的植物器官或者部分，还 有处理后出现的植物器官或者部分。细胞壁无法渗入植物来通过树液 转运，它不是内吸作用。但是，扩散到整株植物和新形成器官的保护 表明本发明组合物诱导或者刺激了免疫防御机制，例如已知的、利用 b-氨基丁酸，2，6-二氯异烟酸，阿拉酸式苯-S-甲基 (acibenzolar-s-methyl)，或者一些藻类提取物(专利或者专利申请 FR2,868,253；WO03/092384；WO97/14310和WO99/53761)的机制，和 可以预期长达一月或者更长的长期保护以及多能作用。

此外，根据本发明，酵母细胞壁较少能引起抗性，因为它们对致 病媒介没有直接作用。

本发明公开的结果是特别令人惊讶的，因为它们显示无需使用纯 化的分子，而完整的酵母细胞壁无需事先离析或者分离它们的组分就 是有活性的。此外，无需对酵母细胞壁的进一步化学修饰。

因此，本发明涉及酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的组合物在保 护植物对抗致病媒介引起的疾病中的用途。

本发明还涉及酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的组合物诱导或者 刺激植物抗致病媒介的免疫防御机制的用途。

本发明还涉及诱导或者刺激植物抗致病媒介的免疫防御的方法， 包括给植物或者其部分施用酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的组合 物。

本发明使用的酵母细胞壁可由不同种属的酵母或者可能由其混合 物制备。优选面包酵母(Baker＇s yeast)。面包酵母是一种属于糖酵母菌 属(Saccharomyces genus)的酵母，基本按照参考书籍《Yeast technology》 (酵母技术)第6章《Baker＇s yeast production》(面包酵母的生产)所 公开的通过扩增或者好氧生长进行制备。酵母也可以是啤酒酵母 (brewer＇s yeast)，酒类(oenological)酵母或者酒精酵母(distillery yeast)。 其他类型的酵母也可以在本发明的背景下使用，例如来自克鲁维酵母 属(Kluyveromyces spp)、毕赤酵母属(Pichia spp)、梅奇氏酵母属 (Metschnikowia spp)和念珠菌属(Candida spp)的组别的酵母。

酵母是一种大致由包膜和内容物组成的细胞。该包膜被称为“细 胞壁”。

称为酵母“细胞壁”的工业产品，可以利用本领域已知的技术， 从不同类型的酵母，任选作为其混合物，以不同的方法制备。

在方法的一种具体实施方式中，酵母细胞壁可以通过酵母细胞的 裂解(自溶作用或者异种溶解)制备，例如酿酒酵母，然后分离可溶 和不溶部分，例如，通过物理方法例如离心，然后收集不溶部分。这 样，通常通过离心去除可溶部分以收集不溶部分。不溶部分被称作“酵 母细胞壁”。所获可溶部分颜色是透明的，有点混浊，被称作“酵母 提取物”。

酵母的自溶作用是酵母的细胞内容物被其自身酶水解。这通常通 过在某些物理介质条件下悬浮酵母和/或接触活化剂引起酵母死亡和其 酶释放入细胞体来实现。细胞内容物的水解产生可溶性化合物。这种 分离和收集的可溶部分组成“酵母提取物”。从所述分离步骤收集的 不溶部分组成了称为“酵母细胞壁”的产品。这种产品包括酵母的细 胞骨架以及通过自溶作用或者异种溶解产生的不溶解的膜和成分。通 常通过酵母细胞壁的水悬浮液收集不溶部分，其干物质含量通常是10 到15％(重量/体积)。细胞壁相当于整个酵母细胞干重的约25到45％， 平均大约为35％。

细胞壁还可以进一步进行化学处理，例如提取或者功能化，例如 去脂作用。在本发明一个优选的实施方式中，可以使用未修饰的酵母 细胞壁，尤其是不进行所述处理。

在本发明中，可以使用来自相同类型的酵母或者其不同类型或者 种属的酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的任意组合物。

这样的产品也可以是商品化供应的，尤其是来自Biospringer SA (F-94Maisons-Alfort)的Springcell 8001 0 PW或者来自Prodesa(Bra. Valinhos)的Pronady。

在本发明中，所有具有不同脱水程度的包括酵母细胞壁的产品可 以用作原料。在一种优选的实施方式中，使用酵母细胞壁的水悬液， 优选浓度小于20％干物质含量，更优选小于17％或者甚至14％。在另 一个优选的实施方式中，使用液体悬浮液干燥产生的产品，例如通过 粉化，并包括超过80％的干物质含量，优选超过85、90、93或者 95％。

在本发明的一种具体实施方式中，按照上面的定义，可以制备植 物检疫(或者植物药物)组合物(或者制品)，带有或多或少的浓缩， 以便为了它们的应用与液体或者固相载体混合，包括酵母细胞壁作为 活性成分。专业农作经常用浓缩的植物检疫产品，所述产品用水稀释 进行喷雾，或者与肥料混合或者用于人造土壤的改良。因此在一个具 体实施方式中，本发明的组合物是一种采用干燥或者液体制剂的浓缩 植物检疫组合物。

在本发明的另一种具体实施方式中，制备即用组合物，任选液体 或者固体形式。在即用制品中，活性成分(包括酵母细胞壁)已经与 用于植物的合适载体混合，例如，注入喷雾器的液体，肥料，地下生 长基质，等等。

这种产品或者组合物除了活性成分以外，还可以包括任意合适配 方制剂。

因此，本发明的一种具体实施方式涉及所有包括酵母细胞壁的组 合物，尤其是植物药物或者植物检疫组合物。

根据第一种实施方式，组合物是一种干燥组合物，例如粉剂或者 颗粒。

在另一种实施方式中，组合物是一种液体组合物，优选是水成液。 它具体可以是悬浮液，凝胶，膏剂，糊剂，等等。

在一种优选的实施方式中，组合物还包含一种或者多种配方制剂。 通常，本发明的组合物包含大约0.1％到99.9％(重量)的活性成分和 一种或者多种固体或者液体配方制剂。

配方制剂可以包含任意化合物或者任意惰性物质，所述化合物或 者惰性物质能够转运或者促进或优化转运，活性成分到植物或者其部 分的贮存、操纵和/或应用。这类试剂适合本发明目的：活性剂的保存， 在储存期间或者用于治疗性药剂制备期间维持细胞壁或者其他活性物 质悬浮的试剂，抗苔藓剂，防尘剂，植物粘合剂等。这种或者这些试 剂可以是固体或者液体，单独或者混合使用。

配方制剂，尤其是那些适于喷雾的，可以选自表面活性剂，分散 剂，防腐剂，湿润剂，乳化剂，粘合剂，缓冲剂等等，并可以单独或 者混合使用。

在一种具体实施方式中，组合物还包括另一种活性剂，优选的是 杀真菌剂、抗细菌剂或者抗病毒剂。杀菌剂可以选自，例如，有机农 用化学杀真菌剂或者基于硫和/或铜的无机矿物杀真菌剂。

现有的有机农用化学杀真菌剂的实例具体是氯腈(chloronitriles)， 包括四氯异苯氰，氨基甲酸酯，包括二硫代氨基甲酸酯例如代森锰锌， 酞酰亚胺(phtalimides)，包括克菌丹，磺胺，胍，醌，喹啉，噻二嗪， 酰苯胺，羟基酰苯胺，和苯胺，咪唑啉酮，恶唑烷二酮，嗜球果伞素， 氰基咪唑，氟啶胺，敌螨普，硅噻菌胺，二甲酰亚胺，咯菌腈，有机 磷，盐酸霜霉威，二苯胺，吡啶基胺，固醇生物合成抑制剂(SBI)包 括咪唑，嘧啶，羟基嘧啶，苯胺基嘧啶，三唑，螺恶茂胺，吗啉和哌 啶，环酰菌胺，恶霉灵，草酰胺，乙霉威，苯并咪唑，戊菌隆，喹氧 灵，异丙菌胺，霜脲氰，烯酰吗啉，膦酸盐，三嗪，等等。

本发明还可用于替代、结合或者联合使用作为植物防御引发剂的 一种或者多种组分，例如b-氨基丁酸，2，6-二氯异烟酸，阿拉酸式苯-s- 甲基，或者一些藻类提取物(专利或者专利申请FR2,868,253； WO03/092384；WO97/14310和WO99/53761)。这类化合物的实例具体 是昆布素和石莼聚糖。

可以采用不同的方式并根据不同的处理方案或者程序应用本发明 的产品或者组合物。

根据一个优选的实施方式，通过喷雾尤其是叶子或者土壤粉碎物 来应用所述产品或者组合物。

或者，产品或者组合物可以作为肥料、栽培支持物、水剂或者其 他的混合物应用。组合物还可以通过喷洒到土壤、机械掺入、作为与 肥料的混合物、土壤改良、预混合或者其他方式施用于根部。

因此，本发明涉及任意的包括酵母细胞壁作为活性成分的组合 物，尤其是是植物药物(或者植物检疫)或者即用的。这种组合物有 利地包括一种或者多种适于应用于植物的赋形剂，例如喷雾或者粉剂 形式，尤其是供家庭或者园艺使用。这种组合物还可以包括一种或者 多种其他活性剂，例如杀真菌剂、抗细菌剂、抗病毒剂或者一种或者 数种肥料，供它们同时、分别或者相继地应用于植物。可以使用其他 即用组合物，例如与用于土壤摄入的肥料或者栽培支持物混合。

本发明的产品或者组合物可以应用于完整的植物或者只应用于其 一个或者多个部分，例如，叶、茎、花、干和/或根。它们还可以在土 壤中或不在土壤中用于植物繁殖材料，例如幼苗、种子或者植物。因 为它们的作用方式，本发明的产品将在一个较长时间段内有效保护植 物抗致病媒介，可能超过1个月。使用者可以预期在选择的间隔时间 内重复应用。

应用量由本领域人员确定，尤其取决于待治疗的致病媒介，植物 类型，使用组合，等等。应用量优选的足以保护植物抗致病媒介，或 者限制或者终止这种致病媒介的发展和作用。这种量可以通过例如现 场检验来确定。

根据本发明，当产品用于喷雾直到流失点(point of run-off)时，应 用或者使用组合物的有效剂量超过1mg/L酵母细胞壁，或者当与少量 水一起喷雾时，超过1g/公顷(ha)。优选的，当产品用于喷雾直到流 失点时，有效剂量为1到1000mg/L酵母细胞壁，或者在其它情况下也 从1到1000g/公顷。

在一种具体实施方式中，当产品用于喷雾直到流失点时，应用或 者使用组合物的有效剂量为1到250mg/L酵母细胞壁，优选从2.5mg 到25mg/L，或者在其它情况下，例如当与少量水一起喷雾时，也从1 到250g/公顷，优选在2.5和25g/公顷之间。与使用剂量无关，可以制 备、运输和/或出售不同浓度的组合物。这样的话，当产品是干燥形式 时，例如，它可以包含以重量计96％的酵母细胞壁。液体产品可以采 用悬浮形式，包括，例如，13％的干材料酵母细胞壁。产品还可以是 即用的，即，包括大约25mg/l浓度的酵母细胞壁。本领域技术人员可 以调整本发明产品中的活性物浓度或者在其应用期间的活性物浓度， 并可以使用比上述更高的剂量。

此外，如先前所述，本发明的产品和组合物可用于替代或者联用 一种或者多种其他治疗方法。

本发明还涉及一种抵御植物中真菌引起的疾病的方法，包括给植 物应用酵母细胞壁，或者包括酵母细胞壁的组合物，以替代或者联用 抗真菌治疗方法。

本发明的一种具体实施方式涉及抵御植物中细菌引起的疾病的方 法，包括给植物应用酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的组合物，以替 代或者联用抗细菌治疗方法。

本发明的另一个具体实施方式涉及预防和限制真菌菌株对杀真菌 剂家族产生抗性的方法，其中植物用酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁 的组合物处理，以减少菌株对所述杀真菌剂家族抗性的选择压力，或 者其中来自所述杀真菌剂家族的物质对植物的处理被使用酵母细胞壁 或者包括酵母细胞壁的组合物对所述植物的处理所替代或者与其联 用。

本发明的另一个实施方式涉及预防和限制细菌菌株对抗细菌剂家 族产生抗性的方法，其中植物用酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的组 合物处理，以减少菌株对所述抗菌剂家族产生抗性的选择压力，或者 其中来自所述抗菌剂家族的物质对植物的处理被酵母细胞壁或者包括 酵母细胞壁的组合物对所述植物的处理所替代或者与其联用。

本发明可以应用于野外、果园、森林、温室、或者室内或园林植 物中的任何植物。本发明还可应用于禾本科和双子叶植物，一年生、 二年生和多年生植物，蔬菜，谷类包括小麦、大麦和水稻，玉米，高 粱，粟，含油种子，蛋白质作物，马铃薯，甜菜，甘蔗，烟草，木本 植物，树，果树或非果树，藤本植物，观赏植物，等等。

根据第一种具体实施方式，植物是果树，例如，仁果类水果树， 尤其选自苹果树、梨树和柑桔树。

在另一种具体实施方式中，植物选自藤本植物，谷物，尤其是小 麦，油菜，甜菜，马铃薯，豆，番茄，黄瓜，莴苣或者草莓。

本发明不限于植物的任何特殊类型；它可以用于所有植物。

本发明的方法可用于抵御所有类型的致病媒介，尤其是真菌，病 毒，细菌，支原体，螺原体或者类病毒。致病媒介的一些特定实例是 以下真菌链格孢(Alternaria spp)属，例如茄链格孢(A.Solani)，壳 二孢属(Ascochyta spp)例如蚕豆壳二孢(A.Fabae)或豌豆壳二孢 (A.Pinodella)，葡萄孢属(Botrytis spp)例如灰葡萄孢菌(B.Cinerea)， 盘梗霉属(Bremia spp)，例如莴苣盘梗霉(B.Lactucae)，尾孢属 (Cercospora spp)，例如甜菜生尾孢(C.Beticola)，有枝孢属 (Cladosporium spp)，例如洋葱有枝孢(C.allii-cepae)，刺盘孢属 (Colletotrichum spp)，例如真菌禾生刺盘孢(C.Graminicola)，白粉 菌属(Erysiphe spp)，例如小麦白粉菌(E.Graminis)，镰刀菌属 (Fusarium spp)，例如尖镰孢菌(F.Oxysporum)和粉红镰刀菌(F. Roseum)，盘长孢属(Gloeosporium spp)，例如果生盘长孢(G. Fructigenum)，球座菌属(Guignardia spp)，例如葡萄球座菌(G. Bidwellii)，长蠕孢菌属(Helminthosporium spp)，例如小麦褐斑长蠕 孢霉(H.tritici-repentis)，盘二孢菌属(Marssonina spp)，例如蔷薇盘 二孢菌(M.Rosae)，丛梗孢属(Monilia spp)，例如仁果褐腐丛梗孢 (M.Fructigena)，球腔菌属(Mycosphaerella spp)，例如芸苔生球腔菌 (M.Brassicicola)，青霉菌属(Penicilium spp)，例如扩张青霉菌(P. Expansum)或者指状青霉(P.Digitatum)，霜霉菌属(Peronospora spp)， 例如白菜霜霉菌(P.parasitica)，无柄盘菌属(Pezicula spp)，多胞 锈属(Phragmidium spp)，例如P.rubi-idaei，疫病菌属(Phytophtora spp)包括致病疫霉(P.Infestans)，单轴霉属(Plasmopara spp)包 括葡萄生单轴霉(P.viticola)，叉丝单囊壳(Podosphaera spp)，例如 白叉丝单囊壳(P.Leucotricha)，假小尾孢属(Pseudocercosporella spp) 包括云台假小尾孢(P.Brassicae)，假霜霉菌属(Pseudoperonospora spp)，例如古巴假霜霉菌(P.Cubensis)，假盘菌属(Pseudopeziza spp)， 例如苜蓿假盘菌(P.Medicaginis)，柄锈菌属(Puccinia spp)禾柄锈菌 (P.Graminis)，腐霉属(Pythium spp)，柱隔孢属(Ramularia spp) 包括甜菜柱隔孢(R betae)，丝核菌(Rhizoctonia spp)，例如立枯丝 核菌(R.Solani)，根霉属(Rhizopus spp)，例如黑根霉(R.Nigricans)， 喙孢属(Rynchosporium spp)，例如直喙孢霉(R.Secalis)，核盘菌属 (Sclerotinia spp)或者例如油菜核盘菌(S sclerotiorum)，壳针孢属 (Septoria spp)，例如狗牙根壳针孢(S.Nodorum)或者小麦壳针孢 (S.Tritici)，单囊丝壳属(Sphaerotheca spp)例如草莓单囊丝壳(S. Macularis)，外子囊菌属(Taphrina spp)，例如李外囊菌(T pruni)， 钩丝壳属(Uncinula spp)，例如葡萄钩丝壳(U.Necator)，黑粉菌属 (Ustilago spp)，例如小麦散黑粉菌(U.tritici)和黑星病菌属(Venturia spp)，例如苹果黑星病菌(V.Inaequalis)。

导致苹果树黑星病(apple-tree scabs)的特定致病媒介是苹果黑星病 菌。

影响作物的细菌实例特别包括以下种类：棒状杆菌 (Corynebacterium)，棍状杆菌(Clavibacter)，短小杆菌 (Curtobacterium)，链霉菌(Streptomyces)，假单胞菌(Pseudomonas)， 黄单胞菌(Xanthomonas)，欧文氏菌(Erwinia spp)和属，尤其是解 淀粉欧文氏菌(E.Amylovora)，胡萝卜软腐欧文氏菌(E.Carotovora)， 菊欧文氏菌(E.Chrysanthemi)。感染作物的病毒实例是例如烟草花叶 病毒或者马铃薯Y病毒。

本发明的一种具体实施方式涉及酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁 的组合物在治疗黑星病，特别是果树，更特别是苹果树黑星病中的用 途。本发明的另一个方法涉及治疗黑星病，特别是果树，更特别是苹 果树中黑星病的方法，包括应用酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的组 合物。

本发明的另一种实施方式涉及诱导或者刺激植物对抗黑星病的免 疫防御机制的方法，包括给所述植物或者其部分应用酵母细胞壁或者 包括酵母细胞壁的组合物。

本发明的另一种实施方式涉及预防或者限制黑星病菌株对杀真菌 剂产生抗性的方法，其中所述杀真菌剂对植物的处理被酵母细胞壁或 者包括酵母细胞壁的组合物对所述植物的处理所替代或者与其联用。 在一种具体的实施方式中，该方法用于限制抗性苹果黑星病菌和/或梨 黑星病(Venturia pirina)株的产生。

本发明的另一种具体实施方式涉及酵母细胞壁或者包括酵母细胞 壁的组合物在有机或者生态农作中预防或者治疗黑星病的用途。

本申请的另一种具体实施方式涉及酵母细胞壁或者包括酵母细胞 壁的组合物在治疗尾孢菌病(cercosporiosis)，尤其是甜菜中尾孢菌病 的用途。本发明的另一个实施方式涉及治疗尾孢菌病，尤其是甜菜中 尾孢菌病的方法，包括给植物或者其部分应用酵母细胞壁或者包括酵 母细胞壁的组合物。

本发明的另一个实施方式涉及用于诱导或者刺激植物对抗尾孢菌 病、尤其是甜菜中尾孢菌病的免疫防御机制的方法，包括给植物或者 其部分应用酵母细胞壁或者包括酵母细胞壁的组合物。

本发明的另一种具体实施方式涉及酵母细胞壁或者包括酵母细胞 壁的组合物在有机或者生态农作中预防或者治疗尾孢菌病的用途。

在下列实施例中给出本发明的其他实施方式和优点，这应被认为 是说明性的但不是排他的。

实施例

实施例1：检测组合物利用酵母膜抗苹果黑星病的功效。

由于黑星病是感染仁果类水果树的主要疾病，由苹果树上的苹果 黑星病菌引起。

当不处理时，黑星病将导致产量和品质下降达作物价值的70％， 这导致树木栽培工作者在整个季节要以10到15次植物检疫处理以保 护其果园，意味着了显著的经济和环境影响。

所用活性成分的量占据全世界用于苹果树的活性农用化学成分的 一半以上，苹果树是用植物检疫产品最多的作物。这种作用在土壤、 水和果实本身上产生了相当量的残留。

现有的抗黑星病处理可分为4个家族的产品：

不渗透皮肤的接触产品，因此容易被雨水洗掉，需要固定，并且 在处理后出现的新器官是不受保护的，因为新器官(叶子，果实)的 出芽或者生长从而需要再处理。

苯胺嘧啶部分渗透，但不保护处理后出现的器官，选择黑星病菌 的抗性菌株。

嗜球果伞素，稍微进入植物，产生抗性菌株。

固醇生物合成抑制剂(SBI)具有内吸作用：它们扩散进树液。因 此它们保护处理后产生的器官。这些产品也可产生抗性。

限制抗性要求只能使用相同家族的农用化学品2或者3次和家族 间交替使用。

在这些情况下，一种新的组合物，其作用不同、产生持久功效并 且不产生任何化学残留，对于树木栽培者、消费者和环境来说将是真 正有优势的。

这第一个实施例证明了酵母细胞壁用于苹果树抗黑星病保护的功 效。

材料和方法

在温室受控条件下对播种的苹果树树苗进行试验。

4℃在装有沙和潮湿到饱和的陪替培养皿中将自由授粉的种子群 以人工方法促进发育90到120天。每15天维持沙的潮湿。

从第一批种子萌芽开始，将种子种于40×30×15厘米塑料种子 盘，每盘60粒种子，其中只有50粒用于试验。种子种于包含肥料混 合物(2kg/m³NPK 7-7-10和2kg/m³NPK 15-8-12缓释)的盆栽土壤床(来 自DCM公司的CombiTree B MG)中的再水化泥炭填料中。

盘用盆栽土壤重新覆盖，潮湿，在被栽入18℃的地面之前保持大 约10℃的温度一周。任选试验期间使用杀虫剂。

在3-4片平展的叶片阶段，籽苗接受2次连续处理，间隔一周。 在第二次处理后3天接种致病媒介(苹果黑星病菌)。在接种后14和21 天进行观察。

统计框架包括3个重复，每个对应于一个50颗籽苗的盘。

该试验将的3个剂量的酵母细胞壁的水性悬浮液(软化水)OY与用 软化水处理的对照作比较，所述3个剂量分别添加2.5mg/l，25mg/l和 250mg/l细胞壁。

这里使用的细胞壁是Biospringer SAS，(Maisons-Alfort，France)的 Springcell 8001产品，含有干物质含量96％的细胞壁。

表1

在振摇后用手动500ml喷雾器(BIRCHMEIER)进行喷雾处理。直 到流失点才终止喷雾。在处理前一天最新展开的叶片被命名为“F1”， 通过叶柄上的固定环进行标记。

处理后第一个新形成的或者展开的第一片叶子，其没有以组合物 处理，被称作“F0”。如果这个叶子已经形成，但在处理时没有展开， 喷雾期间它被覆盖。处理后3天进行接种。在此期间F0至少部分展开。

如下制备接种物苹果黑星病菌。

夏天中从不同的果园收集有斑点的叶子。干燥20天后，叶子放入 塑料袋，-18℃冷冻。使用当天，将叶子放于包含200ml雨水的1升瓶 中，手动振摇10分钟。经布过滤悬浮液，测量所获体积。

显微镜下在Bürker血球计数板上计数所获分生孢子，2次计数2 ×144方形，计算平均值。分生孢子数乘以Bürker常数(250,000)，为 了获得活分生孢子的数目，用分生孢子发芽系数校正，产生前一天进 行试验的结果。

根据这个数据，稀释孢子悬浮液以获得每ml150,000个活分生孢 子。接种1000棵植物需要大约1升悬浮液。

通过手动喷雾每ml 150,000个黑星病菌活分生孢子的悬浮液接种 植物，转移到湿度饱和室48小时。

评定F1和F0的分数，叶子的孢子形成表面表示为叶表面的百分 比。

对于每个重复计算每50棵植物的平均分数。每个方案(或者方法) 的3个重复的平均值就是各方案的平均值。最后，利用Abott公式计算 功效：

功效＝[(“水”分数)-(检测的方法的分数)]/(“水”分数)

结果

结果显示于下面的表2。

表2

结果表明本发明的产品能够诱导孢子形成表面的显著下降，对于 F1叶子和处理后形成的F0叶子均是如此。

在后一种情况下，细胞壁无法渗入植物以通过树液转运，因此它 可能不是内吸作用。但是，该结果表明植物免疫防御机制的诱导。

实施例2：检测包括酵母细胞壁的组合物抗黑星病的功效。

在盆栽移植植物上进行试验。使用3个种属：‘Reinette des Capucins’，‘Jonagold’和‘Reinette de Waleffe’，嫁接到M9根 茎。在不同时间植物在塑料通道中生长，以便它们在试验时均处于相 同阶段：开始于Reinette de Waleffe，然后15天后是Reinette des Capucins，然后1周后是Jonagold。

植物用品种标记，在接种前接受处理方法。

处理方法、接种物制品、接种和观察与实施例1描述的那些类 似。

相继处理植物两次，间隔10天。第二次处理后当天，鉴定最后展 开的叶子“F1”。

第二次处理后2天，直接在潮湿室接种1.5×10⁵分生孢子/ml剂量 的致病原(苹果黑星病菌)。接种后在潮湿室18℃孵育48小时，然后将 植物维持在温度为18±2℃和相对湿度为80±10％的盒中。

按如下所示组织研究：

表3

OY2酵母细胞壁相当于25mg/l Biospringer SAS(Maisons-Alfort)， France)的Springcell 8001产品的水性悬浮液，含干物质含量96％的细胞 壁。

在对最后2片处理的叶子(F2和F1)接种后第21天和对处理后 新形成的叶子(F0)进行观察，每个对象大约25片叶子。结果显示于 下面的表4。

表4

所有品种和所有类型叶子的平均功效是60.8％，对F2和F1处理 叶子来说平均为68.8％，对新形成的F0叶子来说为46.6％。

该功效类似于、但总是高于相同时期利用BABA实现的功效。

处理后41天的观察给出下列结果。

表5

这时候，新叶已经展开：F-1和F-2，通过自然污染产生疾病，不 再进行任何再接种。

所有品种和所有类型叶子的平均功效表现为63.4％。对处理的叶 子：F1和F2它达到76％的平均值，对新形成的叶子：F0、F-1和F-2 为50％。

再一次，功效类似于、但总是高于相同时期BABA的功效。

值得注意的是杀真菌剂作用的长期持续，超过农用化学品(7到 15天之间)。

实施例3：防御甜菜尾孢菌病的检验

在温室中对甜菜尾孢菌病进行小规模试验。这种真菌病是由甜菜 褐斑菌(Cercospora beticola)引起的。

在发芽器中种入FORTIS品种的甜菜种子，已知它们易感染尾孢 菌病。在它们出芽时，年幼的籽苗在24℃温室种于盆栽中，每天光照 期16小时。

试验方案由每种方法(或者目标)8棵植物的2个块(2重复)组 成。

植物在4-叶阶段通过用包括酵母细胞壁的溶液喷雾叶子上被处理 一次。

所述溶液，称为OY，包含水性悬浮液中的酵母细胞壁(Biospringer SAS的Springcell 8001，含有干物质含量96％的细胞壁)。

处理方法由振摇后利用手动喷雾器喷雾所获溶液组成。在甜菜的 4叶阶段进行的处理，针对完全发育的最后2片叶子，覆盖叶子两边直 到流失点。

被处理的植物维持在恒定湿度的封闭空间中，所述恒定湿度通过 定时向基质中注水来保持。

1周后在6叶发育阶段接种植物，通过向叶子两边喷洒甜菜褐斑 菌株524的分生孢子悬浮液，每ml 20,000孢子，直至流失点，然后植 物维持在潮湿气氛中。

选择甜菜褐斑菌株524是因其迅速蔓延的性质，该菌株由“让布 鲁学院大学植物病理学部门(Unitéde Phytopathologie de la Faculté Universitaire de Gembloux)”(Belgium)提供。在陪替培养皿的V8培养 基中以个体化集落培养该菌株。在温度为24℃的生长室黑暗中孵育5 天后，将个体化集落收集到包含3ml无菌蒸馏水的无菌试管中。然后 涡旋振荡所获溶液以释放病原体的分生孢子。然后分生孢子悬浮液用 于接种包含新制备的V8培养基的新陪替培养皿。制备的培养物在24 ℃生长室中孵育，光照期为16小时。孵育一周后，收集培养物，利用 手术刀片轻刮培养物到蒸馏水中以制备分生孢子悬浮液。然后利用 Bürker细胞小室计数分生孢子悬浮液中的分生孢子数目，将分生孢子 悬浮液调整到每毫升蒸馏水20,000个分生孢子。

在高湿度中维持接种的植物。

1个月后评估症状程度，利用The Royal Belgian Institute for the Improvement of Beet(甜菜改良皇家比利时学会，IRBAB)的视觉等级， 其具有从0到9的10个值，其中9表示100％的叶子表面是健康的(未 被病灶覆盖)，0表示0％的叶子表面是健康的(未被病灶覆盖)。

利用称为OY的细胞壁悬浮液以不同的浓度OY1、OY2、OY3，进 行处理，如下面表6所述。

表6

每种方法的得分，两次重复的平均，报告于下面表7。

表7

在该实施例中，细胞壁能够从“不足”标准达到“非常合格”的 平均损伤标准。

实施例4：小麦抵御壳针孢属的检验。

壳针孢(狗牙根壳针孢或者小麦壳针孢)在欧洲是小麦的主要叶 片疾病，导致高达40％的作物产量下降。化学控制通常由在2-3节期的 系统处理继以抽穗期的处理构成。

该试验显示早期使用基于酵母细胞壁的产品可以延迟疾病的出现 并替代第一次化学处理，产生对农民和消费者的毒理水平(残留)和 环境水平的益处。

材料和方法

该试验于2005年10月6日开始于法国露地，在Orvantis品种的 软冬小麦作物上进行。

该试验根据CEB方法N°M189(法国植物保护协会，生物试 验委员会)(Commission des Essais Biologiques，de 1’Association Francaise pour la Protection des Plantes，Paris)进行，并符合标准实验规 范(Good Experimental Practice)的标准。

统计架构由费舍(Fisher＇s)随机区组构成。每种方法由4次重复 组成，每种对应于8×2.5m的基本块(20m²)。

该试验的目的是比较水性悬浮液中使用的酵母细胞壁用于抗壳针 孢(septoriosa)的处理程序开始时的作用(Springcell 8001，来自 Biospringer SAS，干物质含量96％的细胞壁)，名为OY。

此处使用的化学参照品是以1L/公顷使用的Opus(依普座125g/L， BASF Agricultural Products)。

利用配有2.50m喷雾杆的手推车式喷雾机，以200L/公顷进行处 理。

处理程序根据使用的方法而不同，如下表所示。在第一次处理后 所有方法都是1L/公顷40天。

表8

在试验期间进行5次观察，以便评价壳针孢攻击的频率和强度：

-观察1：2006年4月4日在T1(BBCH31)：1cm穗期

-观察2：2006年4月28日在T3(BBCH 32)：第二节期；

-观察3：2006年5月15日在T4(BBCH 39)：最后一片叶子 展开期。

-观察4：2006年5月29日在T4+15天(BBCH 55)：抽穗中 期。

-观察5：2006年6月22日在BBCH 71：谷粒灌浆期。

因此，试验计划如下(N＝观察)：

对于每次观察，在3叶阶段(F1，F2，F3)已经确定频率和强度， 其中F1是指25个随机选择的茎的最后一片完全展开的叶。

频率相当于感染壳针孢的叶子的百分比。

强度相当于感染疾病的叶子的平均百分比。

每次重复计算25个茎的平均值。每种方法4次重复的平均值获得 各方法的平均值。最后，利用Abott法计算功效：

结果

对于前4次观察，疾病的强度一直较弱(在未处理的对照中>3％)。 OY方法的功效没有显示统计上有显著意义。在第5次观察中，疾病是 明显的，其强度在F3叶子上高于未处理对照95％。

这时候，结果、差异程度和功效百分比如下所示：

表9

结果显示第一次处理80天后F1和F2上疾病强度的显著下降，与 使用的OY剂量无关。此外，观察到的OY对F1和F2的平均功效统 计意义上都等于Opus化学参照品观察到的平均功效。

实施例5：蛋白质豌豆抵御炭疽病的检验。

炭疽病是感染豌豆的主要叶疾病之一，显著减少粮食产量。它是 由真菌豌豆壳二孢(Ascochyta pisi)引起的。

材料和方法

该试验于3月22日开始，在法国露地的Lumina品种的春蛋白质 豌豆作物上进行。

该试验根据CEB方法N°M215(法国植物保护协会，生物试 验委员会)(Commission des Essais Biologiques，de 1’Association Francaise pour la Protection des Plantes，Paris)进行，并遵照标准试验规 范(Good Experimental Practice)的标准。

统计架构包括费舍随机区组。每种方法由4次重复组成，每种对 应于8×2.5m(20m²)的基本块。

该试验包括：

-2个对照：1干燥和1用水处理：方法1和2

-1个化学参照品(Dithane Neotec：代森锰锌75％，Dow Agroscience)应用2次：方法3

-使用不同浓度的水性悬浮液中酵母细胞壁的3种方法 (Springcell 8001，来自Biospringer SAS，干物质含量96％的细胞壁)， 名为OY，方法4-6：

○方法4：25g/公顷

○方法5：250g/公顷

○方法6：两次处理间隔1周，25g/公顷然后是25g/公顷

利用配有2.50m喷雾杆的手推车式喷雾机，以200L/公顷进行处 理。

2006年5月17日在7-8叶阶段进行第一次应用。

2006年5月19日利用ARBIOTECH公司提供的豌豆壳二孢的菌 丝体和新鲜孢子对大麦谷粒(20kg谷粒/1000m²)进行人工染污。

如下进行处理：

表10

2006年6月10日在BBCH 67期(开花期)进行观察，以便评价 炭疽病攻击叶片的频率和强度。

因而试验计划如下(N＝观察)：

观察期间，在3叶阶段(低-中-高)对25个茎在基本块上对频率 和强度进行估算。

频率相当于感染疾病的叶子的百分比。

强度相当于感染的叶表面的平均百分比。

每次重复计算25个茎的平均值。每种方法4次重复的平均值获得 各方法的平均值。最后，利用Abott法计算功效：

分析差异，进行Neuman-Keuls检验，以确定方法之间差异的显著 性(相同字母：与5％风险度相同的结果；不同字母：与5％风险度不 同的结果)。

结果

尽管是人工染污，但炭疽病感染仍然非常弱(在未处理的对照中 强度<8％)。

观察、结果和功效百分比显示于下表。

表11：炭疽病攻击叶的强度和功效

评价涉及低和中水平，因为高水平未被攻击。所有OY的检验剂 量证明等于化学参照品的功效。

实施例6：藤本植物抗粉孢子抵御(葡萄白粉菌，Erysiphe necator) 的检验。

粉孢子(葡萄钩丝壳，葡萄白粉菌)是一种存在于所有葡萄园中 的藤本植物真菌病，根据地区和藤本植物的类型显示不同强度。它是 世界上最熟知的藤本植物疾病。粉孢子攻击藤本植物的所有器官，可 以导致非常严重的产量损失。

材料和方法

在温室、盆栽中对Cinsaut品种的幼苗进行检验。控制条件，人工 进行污染。

在温室中从1个芽插条生长籽苗，产生同系组。

统计架构包括6个重复，每个1盆。在分析期间结果与平均值相 差最大的重复被剔除。

利用具有非气助喷雾和覆盖整株植物的恒压的喷雾架进行处理， 同一组中的植物同时接受处理。该架由在轨道上匀速移动的喷雾推车 构成，并包括5个喷头(每边2个，1个低于植物)。处理的体积等于 每公顷600升。

处理期间，在第3片充分发育的叶子下通过固定彩色环对叶水平 进行标记，以便能够观察处理对新形成叶子(处理后形成)的作用。

在人工染污前14天或者7天进行处理。一组植物处理2次，在污 染前14天，然后是7天。

待测产品是用于水性悬浮液中的酵母细胞壁(Biospringer SAS的 Springcell 8001，含有干物质含量96％的细胞壁)，称为OY。

检测4个剂量：

-剂量N/10：2.5g/公顷

-剂量N：25g/公顷

-剂量2N：50g/公顷

-剂量10N：250g/公顷

根据下面的处理计划测试剂量：

表12

真菌材料包括来自菌株的分生孢子，所述菌株对杀真菌剂具有正 常的敏感性。

试验中所有的植物在有机玻璃接种塔内通过喷撒干孢子到植物上 而污染。

使用的真菌材料包括来自先前在存活的叶子或者植物上大量繁殖 的粉孢子的孢子。使用的接种物对藤本植物粉孢子来说是12到14天 龄。利用放置在接种塔内植物水平的Malassez细胞验证接种的质量。 使用每cm² 800到1000孢子的密度。

所有植物污染后都在气候适宜的室中孵育，温度21±2℃，白天光 照14小时。在小型围隔中各试验条件与其他完全隔离。

植物保持在该条件下14天。该阶段结束时，观察真菌损害。

观察

高于叶水平F2、F1和F0的叶子(处理后形成的水平)被指定分 数。每片叶子通过目测打分。没有给出频率(感染疾病的叶子的百分 比)，因为所有叶子都被感染。按照0到100的尺度评价强度(叶面 感染的平均百分比)。

在平均强度的基础上，利用Abott法计算功效，并分析差异。 Neuman-Keuls检验能够评价方法之间差异的显著性(相同字母：与5％ 风险度相同的结果；不同字母：与5％风险度不同的结果)。

结果

表13：用称为OY的溶液(Springcell 8001，来自Biospringer SAS) 在不同日期(接种葡萄白粉菌前14和7天)处理的植物的损伤率。观 察敏感叶片F2，F1，F0：

接种前14天单次应用不保护叶子。

但是，污染前7天进行的应用具有抵御粉孢子的作用。更大的剂 量(2N50g/公顷和10N 250g/公顷)具有更显著的作用。

接种前14天应用25g/公顷(剂量N)继之以接种前7天同样的 应用，获得非常好的结果。

实施例7：藤本植物抵御霜霉菌(葡萄霜霉菌，Plasmopara viticola)的检验。

霉菌来自于真菌(葡萄霜霉菌，Plasmopara viticola)。不同程度 的存在于世界上大部分葡萄园中，它损害了作物的产量和质量，如果 不进行处理将导致完全的破环。

材料和方法

在温室、盆栽中对Cabernet-Sauvignon品种的幼苗进行试验。控 制试验条件，人工污染。

在温室中从1个芽插条制备植物，产生同系组。

统计构架包括6个重复，每个1盆。在分析期间结果与平均值相 差最大的重复被剔除。

利用具有非气助喷雾和覆盖整个植物的恒压的喷雾架进行处理， 同一组中的植物同时接受处理。该架由在轨道上匀速移动的喷雾推车 构成，并包括5个喷头(每边2个，1个低于植物)。处理的体积等于 每公顷600升。

处理期间，在第3片充分发育的叶子下通过固定彩色环对叶水平 进行标记，以便能够观察处理对新形成叶子(处理后形成)的作用。

在人工染污前14或者7天进行处理。一组植物处理2次，在污染 前14天，然后是7天。

待测产品是用于水性悬浮液中的酵母细胞壁(Biospringer SAS的 Springcell8001，含有干物质含量96％的细胞壁)，称为OY。

检测4个剂量：

-剂量N/10：2.5g/公顷

-剂量N：25g/公顷

-剂量2N：50g/公顷

-剂量10N：250g/公顷

按照下面的处理计划检测剂量：

表14

通过喷洒来自葡萄霜霉菌菌株的孢子囊悬浮液同时接种植物，所 述葡萄霜霉菌对杀真菌剂具有正常敏感性。

临到污染前制备孢子囊悬浮液。通过用滤砂软化的水洗涤感染的 叶子收集真菌孢子。利用Malassez细胞进行滴定。使用的浓度是50 000 孢子/ml。

在植物叶子底面喷雾10ml孢子悬液。在所有水平的现有叶片上， 单独污染每株植物。

然后通过方法对植物重新编组，在分离的围隔中分离。

在雾下，21℃的温度，每天光照14小时的条件下维持植物以有利 于疾病的发展，为期8天。在此阶段结束时进行观察。

观察

目视观察每片叶子。频率(感染疾病的叶子的百分比)没有记分， 因为所有的叶子都被感染。

按照0到100的尺度评价强度(叶面感染的平均百分比)。

利用Abott法，根据平均强度，计算功效。

结果

强度和功效的结果被重新分为处理的叶子或者新形成的叶子，即 未处理的叶子。

表15

细胞壁的所有待测剂量对被处理或者新形成的叶子上的霉菌均有 作用，与处理和污染之间的时段无关。

功效倾向于随剂量增加。

实施例8：藤本植物抵御霉菌的露地检验。

材料和方法

在法国接近波尔多的露地对Cabernet-Sauvignon品种的藤本植物 进行检测。检验根据标准试验规范(Good Experimental Practice)的标 准进行。

建立试验计划，2006年5月25日在BBCH55阶段进行第一次应 用。统计构架由费舍随机区组组成。每种方法由4次重复构成，每个 对应于10条藤干的基本块。该试验包括：

-1个未处理的对照；

-2种利用水性悬浮液中OY的方法(Biospringer SAS的 Springcell 8001，干物质含量96％的细胞壁)。

利用Solo喷雾器以1000L/公顷进行处理。

从5月25日(BBCH 55阶段)以周为基础进行处理。

表16

在应用前进行观察。因为疾病的出现晚，在2006年8月18日进 行观察。

每个基本块对50片随机取样的叶子评估叶子的频率和强度，即来 自每条藤干的5片叶子。

该频率对应于受疾病影响的叶子的百分比。强度对应于被感染叶 子表面的平均百分比。

每次重复计算50片叶子的平均值。用于完成方法的4次重复的平 均值获得方法的平均值。

最后，利用Abott法根据平均强度计算功效。

结果

功效的结果和百分比如下所示。

表17：8月18日-BBCH 83叶子的霉菌分数

在2种试验剂量100和250g/公顷下，观察产品的功效。