用VP16替代Nanog转录激活域CD2的Nanog基因突变体、携带其的载体,构建方法及其用途

具体实施方式：

实施例1：ES细胞系的培养

小鼠ES细胞(CGR8ES)培养在0.1％明胶包被基质上，用添加了20％胎牛血清FBS(Invitrogen，CA)、100mM非必需氨基酸(Invitrogen，CA)、0.55mMβ-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)、2mM L-谷氨酸(Invitrogen，CA)，以及1000单位/ml人重组LIF(CHEMICON，CA)的培养基在37℃培养箱中培养(参见Pan Guangjing等人，(2006)Faseb J 20(10)，1730-1732、Mitsui K等人，(2003)Cell 113(5)，631-642、Chambers，I等人，(2003)Cell 113(5)，643-655、Pan，G等人，(2005)J Biol Chem 280(2)，1401-1407)。

实施例2：Nanog-VP16突变序列(SEQ ID NO：4)及在ES细胞中表达Nanog-Vp16载体(pPyCAGIP-Nanog-VP16)的构建

如图1B所示，按如下方法构建Nanog-VP16突变序列，所述序列连接在pCR3.1的载体中

a.首先，用定点诱导突变的方法在Nanog-WR与Nanog-CD2间突变出一个kpn1限制性酶切位点(见图1B-a)，引物名称为WR(KPN)CD2(见表1).

b.然后以Kpn137℃处理4小时，在Nanog-WR和-CD2间切开，得到两个3’末端突出的粘性末端片断(见图1B-b)。

c.利用Klenow3’-5’外切核酸酶的活性，37℃处理半小时，将Kpn1粘性末端切平，得到在WR和CD2这两个结构域间切开的Nanog缺失CD2的突变中间体(见图1B-c)。

d.以VP16上下游引物(见表1)特异性扩增VP16转录激活结构域片断(见图1B-d，序列见SEQ ID NO：3)，在下游引物3’端加入一个NotI酶切位点。

e.将此VP16片断连入处理好的Nanog缺失CD2的突变中间体中，则可获得以VP16转录激活结构域替换CD2的Nanog重组突变体，即Nanog-VP16(见图1B-e，序列见SEQID NO：4)。

表1：克隆CD2与VP16片段的引物：

用于产生ES稳定遗传系的质粒通过在pPyCAGIP载体(下文以及图中将此空载体称为Mock质粒)的多克隆位点xhoI和NotI之间插入PCR片段构建的，即在室温下通过xhoI和NotI酶切pPyCAGIP载体4小时，然后用同样的酶将上述在pCR3.1载体中的Nanog-VP16片段切割下来，并在连接酶的存在下16℃连接4小时，用凝胶电泳分离纯化出携带有Nanog-VP16片段的pPyCAGIP-Nanog-VP16。

实施例3：构建稳定转染的细胞系并观察其形态

用含有10³u/ml LIF(Chemicon)的ES培养基培养的无滋养层的ES细胞(CGR8)种植在3.5cm培养皿中，将每种表达Mock和Nanog-Vp16突变体各质粒转染2ug。转染24小时后，细胞按1：50稀释，接种到新的6cm培养皿中用于筛选。筛选时在培养基中加入嘌呤霉素(2ug/ml，Invitrogen，CA)。经过10天的筛选，在OLYMPUS倒置显微镜下观察各组的一个ES细胞，如图2所示，整合了Mock空载体的稳定转染ES细胞系仍表现出典型的ES细胞表型，而整合了pPyCAGIP-Nanog-VP16载体的稳定转染ES细胞系则表现出分化的细胞表型。这表明，即使在LIF(在正常培养条件下能够强力维持干细胞多能性的因子)存在的情况下，Nanog-VP16基因的表达仍能够促使干细胞的分化。

裂解细胞用于进一步的Western和实时RT-PCR分析。所有培养均在37℃培养箱中进行。

实施例4：Western印迹反应检测ES细胞内源Nanog：

对于蛋白质印迹分析(参见Pan Guangjing等人，(2005)J Biol Chem 280(2)，1401-1407)将上述裂解的细胞系用PBS洗涤，用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCL，pH7.5，150mM NaCl，0.25％脱氧胆酸钠，0.1％NP40，0.1 ％Triton X-100)在冰上裂解10分钟，并15000rpm4℃离心15分钟去掉细胞残骸。加入等体积2x SDS上样缓冲液煮沸5分钟后，细胞裂解液用10％SDS-PAGE电泳分离并转移到PVDF膜上(Millipo re，MA)。上述膜用5％脱脂牛奶封闭并用小鼠抗Nanog抗体(1：1000，ABCAM，批号237819)孵育3小时，再用碱性磷酸酶偶联的抗小鼠二抗(1：5000，Sigma，St.Louis，MO)孵育1小时。然后用TBS和TBST交替洗涤上述膜各三次，每次5分钟。最后用显影液(四唑硝基蓝(NBT)/对甲苯胺兰(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate))室温孵育显影。

从图4中可以看出，在β-肌动蛋白表达水平相当的情况下，与转染了Nanog-Vp16突变体的ES细胞相比，仅转染了Mock对照质粒的ES细胞表达的内源Nanog远比转染了突变体的ES细胞中内源Nanog表达要大得多，这表明Nanog-VP16的表达显著抑制了ES细胞中内源Nanog的表达。

实施例5：Nanog-Vp16对报告基因p5N的激活

我们以前的研究已经表明，Nanog对我们所构建的p5N报告基因有十几倍的激活作用，该报告基因可以用来研究Nanog的活性。(Pan，G，J.和Pei，D.Q.(2003)Cell research 13(6)，499-502)。在本实施例的图3中，我们证明了我们所构建的Nanog-VP16由于用更强有力的转录激活域VP16替代了CD2，而对p5N报告基因有了更强的接近50倍的激活活性。

在报告基因分析中，种植在24孔板中的ES细胞用Lipofectamine2000(Invitrogen CA，USA)瞬时转染p5G-elb-荧光素酶(0.2ug每孔)和效应质粒(effector plasmid)(0.4ug每孔)，参见生产商的说明书。同时共转染pCMV-Renilla质粒(每24孔板共转染2ng，Promega，WI)作为内参，并且所有孔的转染的DNA总量用pCR3.1载体标准化。36小时后，细胞用PBS洗涤，并用50uL1 x PLB缓冲液(Promega，WI)裂解。用双重荧光素酶报告基因分析系统(Promega，CA)和TD2020光度计(Turner Design，CA)测量荧光素酶活性。每个转染都成对进行，并至少重复五次。

由图3可以看出，使用VP16替代了CD2的Nanog突变体对于p5N有更高的激活倍数，这在研究Nanog的其它结构域中有深远的意义，使得在其它结构域失去功能前后对p5N的激活倍数之间的对比更加明显，可以作为工具载体用于研究其它结构域的功能。

实施例6：对细胞分化的标志基因的半定量PCR分析

用QIAGEN公司的RNeasy^R Mini试剂盒(货号74104)，根据制造商的说明书，从上述稳定整合了Mock与pPyCAGIP-Nanog-VP16的ES细胞裂解后提取细胞的总RNA。

用终体积为20uL的体系逆转录2ug的总RNA(参见Pan，G等人，(2006)Faseb J 20(10)，1730-1732)。取出1ul的反应液作为模板，用表2中列出的引物，进行PCR，反应体系如下：

反应液：1ul

引物对：各1ul，5pm/ul

dNTP：1.6ul(2.5mM)

Takara公司的Tag聚合酶：0.2ul(5U/ul)

Takara公司Tag聚合酶缓冲液：2ul

水：13.2ul

反应条件如下：

95℃ 5分钟

以下条件：

95℃ 30秒

58℃ 30秒

72℃ 30秒

对于β-肌动蛋白扩增20个循环，对于其它标志物40个循环

72℃ 10分钟

4℃保存

用1％的琼脂糖凝胶电泳分离所得的PCR片段，如图5所示，可见，对于仅整合了Mock空载体的ES细胞，只有β-肌动蛋白可以被扩增出来，而对于整合了Nanog-VP16的ES细胞，在同等β-肌动蛋白表达量的前提下，各种胚层如原始内胚层，中胚层，甚至滋养外胚层的分化标志物Bmp2、gata4和gata6都被扩增出来，表明Nanog-VP16诱导了胚胎干细胞分化，且这种诱导是不定向的。

实施例6：对胚胎干细胞多能性的标志物以及分化标志物的实时定量PCR。

按照实施例5中所述的方法提取总RNA，用作实时PCR的模板，各个标志物的引物如图6所示。

按照生产商的标准规程，用实时PCRMasterMix(SYBRGREEN)试剂盒(TOYOBO)进行PCR反应。PCR用15uL的总体积运行45个循环。使用的引物见表2：

表2：半定量以及定量的实时PCR所用的标志物引物

如图6所示，以整合了空载体Mock并且培养基中添加了LIF的ES细胞所提取的RNA的实时定量PCR所检测到的标志物的量作为对照(设为1)，如果撤掉LIF将会导致多能性标志物Oct4和Rex1的减少，同时使得某些分化标志物如Gata4、Gata6、T有少量升高，表明撤掉LIF后会诱导胚胎干细胞的向原始内胚层(primitive endoderm)和腔壁内胚层(parietal endoderm)的定向分化。

但是对于整合了Nanog-VP16的ES细胞，即使在培养基中添加了LIF，仍然会导致ES细胞的分化。从图6中可以看出，在整合了Nanog-VP16的ES细胞进行实时定量PCR后的到的数据中，各个方向的分化标志物都升高了，而多能性标志物Oct4则显著降低(Rexl的标准偏差过大，不予考虑)，因此表明Nanog-VP16的表达将诱导ES细胞的分化，且这种分化是非定向的。

通过以上实验可以看出，我们所构建的Nanog-VP16能够诱导小鼠胚胎干细胞的分化，并且可以作为工具有助于对Nanog的其它结构域的研究。

序列表

<110>中科院广州生物医药与健康研究院

<120>用VP16替代Nanog转录激活域CD2的Nanog基因突变体、携带其的载体，构建方法及其用途

<130>参考

<160>33

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>918

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<220>

<221>Nanog基因

<400>1

<210>2

<211>189

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>Nanog CD2

<400>2

<210>3

<211>237

<212>DNA

<213>

<220>

<221>VP16

<400>3

<210>4

<211>978

<212>DNA

<213>人造

<220>

<221>Nanog-VP16基因

<223>用VP16替换CD2

<400>4

<210>5

<211>305

<212>PRT

<213>小鼠

<220>

<221>Nanog蛋白质

<400>5

<210>6

<211>326

<212>PRT

<213>人造

<220>

<221>Nanog-VP16蛋白质

<223>用VP16替换CD2

<400>6

<210>7

<211>49

<212>DNA

<213>引物

<400>7

<210>8

<211>49

<212>DNA

<213>引物

<400>8

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>9

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>引物

<400>10

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>11

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>12

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>13

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>14

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>15

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>16

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>17

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>18

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>19

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>21

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>22

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>23

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>24

<210>25

<211>20

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<213>引物

<400>25

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>26

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>27

<210>28

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>28

<210>29

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>29

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>30

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>31

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>p5N正向引物

<400>32

<210>33

<211>30

<212>DNA

<213>p5N反向引物

<400>33