一种注射剂中致热物质含量的全热原检测方法

技术领域  本发明涉及一种生物医药检测技术，特别涉及一种注射剂中致热物质含量的全热原检测方法。

背景技术  自100多年前出现注射用药至今，非肠道使用医用制品中的热原对人体的危害即热原反应已经为人所共知，临床上主要表现为如下症状：发热、寒颤、恶心、呕吐、头痛、腰及关节痛，肤色灰白，白细胞下降，血管通透性增强，严重者造成昏迷甚至休克、死亡。因此，凡是非肠道使用制品包括药品、生物制品和医疗器械装置都应进行热原检查，有效地对其热原进行控制和检查是临床上安全使用的重要保证。

热原是指能够导致机体发热的物质，主要分为内源性和外源性两大类。发热机理是外源性热原通过刺激哺乳动物体内的免疫细胞分泌细胞因子产生内源性热原，从而引起机体发热。热原检测的目的主要是对外源性的热原进行总量控制，使其对机体不产生危害性的影响。

目前的热原检测方法主要有家兔检查法、细菌内毒素检查法和体外热原实验法。其中前两种方法已经收录进入了2005版《中国药典》，是国家法定的检测方法。

家兔检查法的优点是能够真实反映外源性热原引起哺乳动物复杂升温反应过程，用于评价药品中总的致热物质。其缺点是：(1)由于我国目前的家兔繁育、饲养管理等一系列问题，使得家兔种属差异和个体差异较大，造成重复性较差，而且家兔和人发热的情况并不完全一致；(2)灵敏度低，容易造成检测结果的假阴性；(3)对某些能影响家兔正常生理尤其是体温的制品如细胞因子、病毒制品、抗生素、致泻药、某些镇静剂、止痛剂、胞质蛋白和放射性药物等也不可能进行正常检测；(4)试验费用及日常维护成本较高，且检测时间长(一般为5个小时)，特别是当热原含量严重超标而出现毒性时，家兔体温下降，也不能正确反映结果。现目前全部中药注射剂、生物制品类注射剂及部分对细菌内毒素检查有干扰的化学注射药品采用的是家兔检查法。

细菌内毒素检查法是以节肢动物鲎的血细胞溶解物与微量细菌内毒素产生凝集反应为基础的。自1968年由Liven和Bang建立了细菌内毒素检查法以来，在大部分的注射化学药品和抗生素药品中应用广泛。其优点是快速、简便、可定量、可标准化、相对兔法而言检测费用较低。缺点主要是：(1)该方法只能特异性地检查革兰氏阴性菌的内毒素，对其他热原质表现为阴性，且易受到多种物质的干扰，不能完全反映药品中所含的热原物质；(2)细菌内毒素检查法不能完全反映哺乳动物对热原的反应过程，因为来自不同细菌的内毒素对哺乳动物致热活性差别很大，从没有致热性到有很强的致热性，这种差异与其凝集活性的差异没有相关性，故该法实际能够检测到的仅仅是内毒素对鲎血细胞的凝集活性，而不是内毒素对人体的发热活性或化学概念上的含量；(3)该方法对一些酶抑制剂、钙镁离子鳌合剂和多聚核苷酸和中药注射剂等很难进行检测；(4)研究发现，某些生物制品和抗生素与内毒素之间还存在协同作用，而这种协同作用是细菌内毒素检查法无法检测到的；(5)该法是检测内毒素的灵敏方法，其应用的前提是必须确定药品内的热原物质主要是内毒素，其他致热物质如抗原或半抗原性不是主要致热物质，并需排除干扰和协同发热的可能，而我们都知道药品中的热原的种类繁多，而内毒素只是热原中的一类，现在为了细菌内毒素的检测的方便而人为地将内毒素等同于热原来看待；(6)鲎作为一种远古生物，因不合理利用使其濒临灭绝，现目前也急需寻找能完全替代它的检测方法。

体外热原实验法(IPT法)是利用内毒素可诱导人血细胞释放细胞因子这一原理，采用ELISA方法测定新鲜或冷藏的人全血中IL-1、IL-6、TNF、PG-E2、干扰素等的释放量来检测外源性热原。该法尚停留在实验室阶段，并未在国际间广泛应用，其优点是以人体的发热机理进行热原检测，它消除了种属差异造成的结果不准确性，并能够检测至今为止所知的各主要发热物质。其缺点是：(1)现目前对各热原的致热活性以及它们之间的相互关系还没有完全明晰的认识；(2)在实际工作中，外热原进入血液后可能导致多种因子的不均衡释放，检测单一的因子能否代表其完全的致热活性还有待进一步地研究评价；(3)试验中使用的试剂、培养基、血清等如何去除热原的问题，以及不同试验室之间和同一实验室不同时间的细胞存在着差异；(4)除了细菌内毒素外，其他的致热物质还没有标准品，对人的致热阈也不清楚，其限值不易确定；(5)具有内在致内热原分泌或抑制的物质不适合用该法检测；(6)由于采用的检测细胞各有优缺点，存在着人体对热原敏感度的差异，故采用的检测指标还没有完全肯定、统一。而这些缺点也限制了体外热原实验法的推广应用，至今还没有被任何一国药典正式收载，所以该法还不是一种法定的热原检测方法。

发明内容  本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种注射剂中致热物质含量的全热原检测方法。它的检测原理是只要当热原物质刺激人体免疫细胞时就会产生热原反应，同时必然会伴随发热。而根据氧热等量原理，发热是必须要耗氧的，所以我们可以通过检测耗氧量的变化程度来间接测定热原物质的含量。它的作用原理不同于以往的任何一种热原检测方法，可适用于所有热原物质的检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种注射剂中致热物质含量的全热原检测方法，其特征在于包括以下步骤：

a)、制备人全血试验液

将采集而来的体外人全血经过阿氏液作抗凝处理后，再将经过阿氏液作抗凝处理后的体外人全血用生理盐水0.9％氯化钠注射液稀释成为体积比浓度为2％v/v，的人全血试验液；

b)、将细菌内毒素工作标准品用生理盐水0.9％氯化钠注射液稀释后进行线性考察，做出标准曲线

将细菌内毒素工作标准品用生理盐水0.9％氯化钠注射液稀释成100EU/ml、10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml、0.01EU/ml，分别取各级稀释液0.1ml和步骤a中的人全血试验液1.5ml到耗氧测定仪的呼吸室内，呼吸室温度恒定在37.5±0.1℃，混匀速度控制为80转/分钟，待平衡后分别进行检测，以处理浓度为横坐标、耗氧水平为纵坐标，根据实验得到的数据绘制标准曲线，当相关系数|r|>0.980，变异系数CV<10％，表明试验条件符合要求；

相关系数|r|和变异系数CV相关公式和计算方法：

变异系数CV为各个实验数据的标准差s除以平均值x。

公式为：cv＝s/x×100％，x>0；

相关系数为描述两个或两个以上变量间关系密切程度的统计分析指标。公式较为复杂，为：

$r=\frac{\mathrm{n\Sigma xy}-\left(\mathrm{\Sigma x}\right)\left(\mathrm{\Sigma y}\right)}{\sqrt{\mathrm{n\Sigma }{x}^2-{\left(\mathrm{\Sigma x}\right)}^2}·\sqrt{\mathrm{n\Sigma }{y}^2-{\left(\mathrm{\Sigma y}\right)}^2}},$

可以通过EXCEL软件进行计算；

c)、选择适宜的注射剂稀释浓度

将注射剂样品用生理盐水0.9％氯化钠注射液稀释成注射剂样品原液的浓度，再从原液浓度开始进行倍半稀释，即用生理盐水0.9％氯化钠注射液稀释至2、4、8、16、32、64倍，分别向各级稀释液中等量添加1EU/ml的细菌内毒素工作标准品稀释液，分别计算其回收率R，当50％≤R≤200％时，该浓度的稀释液符合下一步检测的要求，可以进行致热物质的含量检测；R越接近100％时，检测效果越好，选择R最接近100％的稀释液进行致热物质的含量检测；

d)、注射剂样品中致热物质含量的确定

根据步骤c的试验结果所得到的试验液浓度作为样品检查浓度，以生理盐水0.9％氯化钠注射液作为空白对照，分别加入耗氧测定仪进行检测，然后将扣除空白对照后的试验结果按稀释步骤进行计算后就得到该注射剂样品中致热物质的含量；

e)、注射剂样品中所含的致热物质是否超标的判定

将该注射剂样品中所含的致热物质的含量和热原物质的具体标准规定进行比较，从而判定该注射剂样品中所含的致热物质是否超标，最终得到该注射剂样品热原的安全性质量检查是否合格的结论。

所述的步骤c中将注射剂样品用生理盐水0.9％氯化钠注射液稀释成注射剂样品原液的浓度；

对注射用的粉针和冻干剂根据其具体的内包装规格进行稀释，即冻干剂的内包装是5ml规格的西林瓶，则加生理盐水0.9％氯化钠注射液2～5ml进行稀释(加氯化钠注射液进行稀释的量是根据试验样品的内包装的规格和样品的溶解效果而定，具体情况具体分析，没有一个统一的标准)，然后将稀释液作为样品原液；

对于水针剂而言，则将其直接作为样品的原液；以此为最高浓度依次进行稀释，找到回收率R最接近100％的稀释液作为最终正式的实验浓度进行检查。

在本发明中，实验载体除了人全血试验液(WBT)以外，还有人外周血单核细胞(PBMNC)、兔全血和各种细胞株(比如：THP-1、MM6、RAW264.7、J774、U937、HL60、MM6-CA8、心脏肝脏细胞等)、线粒体(人或动物的心脏、肝脏)等都可以作为本发明注射剂中致热物质含量的全热原检测方法的实验载体。如果采用本发明的方法，用上述载体进行注射剂中致热物质含量的全热原检测，都将落入本发明的保护范围。

方案优点：

1.文字说明：

我们研究发明的全热原检查法和家兔检查法、细菌内毒素检查法、体外热原实验法相比较具有很大的优势，它检测范围更广，可以覆盖绝大部分中药、化学药、生物制品等非肠道用药制品；检测数据更客观，更真实地模拟了热原在人体内的实际情况；而且，其灵敏度高，重复性好，专属性强，能定量和标准化，对试验的底物材料消耗少，试验成本较低，可大批量的进行试验，也符合保护动物的3R(减少、替代、优化)精神，能够可持续地发展。这在热原检测方法的发展里程中，无疑具有革命性的意义。我们坚信在不久的将来，全热原检查法一定能够在非肠道用药制品的热原检测中占据极其重要的地位。

2.方法对比说明：

注射用苯巴比妥，收录入了2005年版《中国药典》(二部)，是一种镇静催眠、抗惊厥的药物，因其对家兔的中枢及外周体温调节有影响，故现行标准中均没有相关的热原检测方法，但对其进行热原的安全性质量控制是十分必要的。用我们发明的全热原检查法进行检测，线性、重复性、检测限均符合规定，填补了该品种热原检测的空白。

清开灵注射液，收录入了2005年版《中国药典》(一部)，因其是含有各种成分的复方中药注射剂，对细菌内毒素检查干扰较大而无法用细菌内毒素检查法进行检测，故药典只有采用家兔检查法。但由于家兔的个体差异及灵敏度低，容易造成检测结果的假阴性。用我们发明的全热原检查法进行检测，线性、重复性、检测限均符合规定。试验结果表明，全热原检查法可以用于全部中药注射剂品种(包括植物类药和动物类药)的热原安全性质量检测。

人血白蛋白，收录入了2005年版《中国药典》(三部)，因其是生物制品，组成成分较复杂，对细菌内毒素检测干扰较大，故药典采用家兔检查法。用我们发明的全热原检查法进行检测，线性、重复性、检测限均符合规定。试验结果表明，全热原检测法可以用于生物制品类注射剂的热原安全性质量检测。

3.经济效益分析

根据国家食品药品监督管理局官方网站数据显示，我国目前有药品生产企业6694家，其中生产注射剂品种的厂家1072家；医疗器械生产企业6322家，其中生产和血循环相关的医疗器械的厂家有59家。由此推断，全国有近千家药厂生产的几千个注射剂品种都需进行热原的质量控制检查。按照GMP要求，每个药厂都应该建有一个标准的动物房。据专家估算，动物房的建安成本为20500~26000元/m²，造价大大高于普通试验室，这还不包括日常维护的照明、通风、给排水、空调、动物购进、饲养和处理、人工成本等变动成本，这样算下来，建造一个中等规模的动物房成本在200～350万元，每年的运行维护成本还需近百万元，投入远大于产出，这对药厂而言无疑是个沉重的负担，可为了人民群众的用药安全又必须进行热原的质量控制。有没有什么办法既能控制药品的热原物质，又能大幅度降低动物试验的成本呢？

我们研究的全热原检查法完全能够解决上述难题。它在普通的实验室就可以进行检测，成本主要包括耗氧检测设备和检测耗材，大约在15万元左右，大大低于建设一个动物室的成本，仅此一项就可节约近二百万元，推广开来，全国如果有五百家药厂采用我们的技术，节约的费用就高达十个亿。无论对厂商，还是对整个国家，这项技术所产生的效益都是极具诱惑力的。这也表明，我们发明的全热原检查法未来的市场空间和经济效益都是巨大的，具有强大的市场竞争力。

本发明一种注射剂中致热物质含量的全热原检测方法的有益效果是，适用于所有热原物质的检测，既能控制药品的热原物质，又能大幅度降低动物试验的成本，提高了患者的用药安全性，市场空间和经济效益巨大，具有强大的市场竞争力。