一种鉴定黑木耳菌株185的方法及用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列

技术领域

本发明涉及一种鉴定黑木耳菌株的方法及用于鉴定黑木耳菌株的基因序列。

背景技术

黑木耳菌株185，隶属于真菌门、担子菌纲、木耳目、木耳科、木耳属，该菌株适于椴栽和袋栽的晚生品种，木耳子实体颜色黑，耐水淋，袋栽单片无耳基，是一个很优良的黑木耳菌株，拥有广阔的市场前景。

现有鉴定黑木耳菌株185的方法主要有：表观形态鉴定法、酯酶同工酶鉴定方法和DNA分子指纹鉴定方法。

用表观形态特征为依据鉴定黑木耳菌株，周期长、易受环境因素的影响，而且对形态差异较小的黑木耳菌株很难区分。酯酶同工酶鉴定方法易受培养条件、培养时间和发育阶段的影响。DNA分子指纹(RADP、ISSR、SRAP等)鉴定方法是当今较先进的黑木耳菌株鉴定技术，但需筛选大量引物进行PCR扩增，再根据获得的数据构建遗传聚类图，确认菌株间的亲缘关系远近，过程繁琐，耗时耗力。另外目前也没有能够准确鉴定黑木耳菌株185的基因序列。

发明内容

本发明是为了解决现有鉴定黑木耳菌株185的方法存在鉴定结果易受外界环境条件、培养时间、发育阶段的影响，需要筛选大量的PCR引物、或者检测过程繁琐以及目前没有能够准确鉴定黑木耳菌株185的基因序列的问题，而提供一种鉴定黑木耳菌株185的方法及鉴定黑木耳菌株185的基因序列。

本发明鉴定黑木耳菌株185的方法按照如下步骤进行：一、提取待检测黑木耳菌株的总DNA，以5′-TCAAGGCAGCTTCTCAGC-3′为正向引物、5′-GCACAAACAAAGACACGGT-3′为反向引物对提取出的DNA进行PCR扩增；二、将步骤一PCR的扩增反应产物与3μL溴酚蓝指示剂混合，用1.2％(wt.)的琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液中以5V/cm的电压进行电泳，电泳后用浓度为0.5μg/mL的EB对凝胶染色15min，扫描凝胶成像结果；扩增出316bpDNA片段的即为黑木耳菌株185。

本发明用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列长度为316bp。

本发明用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列为黑木耳菌株185的特异性基因。

本发明的黑木耳菌株185购买于陕西宁强县真菌研究所。

本发明通过琼脂糖凝胶电泳检测是否能够扩增出316bp的DNA片段，扩增出316bp的DNA片段的即为黑木耳菌株185。

用本发明的方法鉴定黑木耳菌株不受外界环境条件、培养时间、菌株发育阶段的影响；亦无需筛选大量PCR扩增引物；对PCR反应条件的改变不敏感，鉴定结果可靠性和可重复性强。

附图说明

图1为具体实施方式二的方法鉴定黑木耳菌株结果图，其中M代表DL2000Plus，1代表黑木耳菌株185，2代表黑29，3代表黑威981，4代表黑威9，5代表黑木耳931，6代表黑木耳Au86，7代表黑木耳8808。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式鉴定黑木耳菌株185的方法按照如下步骤进行：一、提取待检测黑木耳菌株的总DNA，以5′-TCAAGGCAGCTTCTCAGC-3′为正向引物、5′-GCACAAACAAAGACACGGT-3′为反向引物对提取出的DNA进行PCR扩增；二、将步骤一PCR的扩增反应产物与3μL溴酚蓝指示剂混合，用1.2％(wt.)的琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液中以5V/cm的电压进行电泳，电泳后用浓度为0.5μg/mL的EB对凝胶染色15min，扫描凝胶成像结果；扩增出316bpDNA片段的即为黑木耳菌株185。

本实施方式能够扩增出316bp的DNA片段的为黑木耳菌株185。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中PCR反应体系为25μL由2.5μL的10×buffer、2.0μL浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液、0.2μL浓度为10mmol/L的dNTPs、1.0μL浓度为20μmol/L的正向引物、1.0μL浓度为20μmol/L的反向引物、0.2μL浓度为5.0U/μL的TaqDNA聚合酶、0.2μL浓度为60μg/mL的DNA模板和余量的无菌双蒸水组成；PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s、53℃退火60s、72℃延伸80s，共45个循环，72℃延伸10min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

本实施方式以DL2000Plus为Marker，DNA Marker自上至下条带分别为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

采用本实施方式的方法分别对以下品种的黑木耳进行检验：黑29、黑威981、黑威9、黑木耳931、黑木耳Au86、黑木耳8808和黑木耳菌株185进行检验，检测结果如图1所示，从图1中能够看出本实施方式的方法能够准确鉴定黑木耳菌株185。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中PCR反应体系为25μL由2.5μL的10×buffer、2.5μL浓度为20mmol/L的MgCl₂溶液、0.2μL浓度为10mmol/L的dNTPs、1.0μL浓度为20μmmol/L的正向引物、1.0μL浓度为20μmol/L的反向引物、0.2μL浓度为5.0U/μL的TaqDNA聚合酶、0.2μL浓度为60μg/mL的DNA模板和余量的无菌双蒸水组成；PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s、53℃退火60s、72℃延伸80s，共45个循环，72℃延伸10min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

将本实施方式鉴定为黑木耳菌株185的菌株分别进行DNA分子指纹(RADP)、酯酶同工酶和表观形态特征的验证。本实施方式鉴定为黑木耳菌株185的DNA分子指纹与原保藏的黑木耳菌株185的DNA分子指纹完全一致，本实施方式鉴定为黑木耳菌株185的菌株的酯酶同工酶酶谱与原保藏的黑木耳菌株185的酯酶同工酶酶谱完全一致，本实施方式鉴定为黑木耳菌株185的菌株与原保藏黑木耳菌株185菌株形态相同并且无拮抗现象。说明本实施方式鉴定黑木耳菌株185的方法精准。

具体实施方式四：本实施方式用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列为TCAAGGCAGCTTCTCAGCTCCTGGCTGACGGCATCGACGCGTGTTGAACGCGGCGCTGGACAACATATGTAAGTTTTACTGTCAGCGGGGCCAGCGGGTGTTACACGTTTGGATTATTCCCTCGTTTTCACTTCGTTGATACAATCTGAATGGGTCTAAAGAAACCCCCCTCCTTAGATTTGGGGGCTGCGTGTTCAGTGTAGTCTATGTTTTAATCCGATGACCTTATCATTTGGGTCCCAGCCGACTTCAGGGCCGGTCACACTGGAAATGGCTCCGAAAGCCTCTCCCGCTCAGACCGTGTCTTTGTTTGTGC。

采用以下实验验证本实施方式用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列的特异性：

一、RAPD-PCR

1、提取总DNA：(1)菌丝体制备：取cPDA液体培养基80mL装入250mL三角瓶，121℃灭菌30min。冷却后，将采用本实施方式的序列判断为黑木耳菌株185与原保藏的黑木耳菌株185同时转接于液体培养基内，25℃静止培养2～3天，再以130r/min的转速25℃恒温摇床培养2～5天，菌球圆润，无色素产生即可；(2)取新鲜菌丝称重0.5g左右，加入液氮，待液氮蒸干后迅速研磨至糊状；用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取菌丝体总DNA。

2、RAPD-PCR扩增引物：用20条RAPD引物对供试黑木耳菌株进行PCR扩增，引物编号及核苷酸序列如表1所示(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)：

表1  供试RAPD引物编号及核苷酸序列

PCR反应体系(25μL)中含有1×PCRbuffer，浓度为2.0mmol/L的MgCL₂，浓度为0.1mmol/L的dNTPs，1.0U的TaqDNA聚合酶，浓度为0.5μmol/L的引物(表1中各引物)，15ng模板DNA。

PCR反应条件：95℃预变性2min；进行45个循环：94℃变性40s，36℃退火60s，72℃延伸80s；最后72℃延伸5min。以无菌双蒸水代替模板DNA设为阴性对照。

将各引物的PCR反应产物与3μL溴酚蓝指示剂混合，用1.0％(wt.)琼脂糖凝胶，0.5×TBE缓冲液，5V/cm电压电泳，0.5μg/mL EB染色15min，以DL2000为Marker，凝胶成像扫描记录结果。将琼脂糖凝胶上出现DNA片段的记为1，不出现的记为0，统计后输入电脑，用NT-SYS软件体系进行聚类分析，构建遗传相关聚类图谱。通过NT-SYS软件体系进行聚类分析，构建遗传相关聚类图谱，采用本实施方式序列判断为黑木耳菌株185与原保藏菌株185相似度为100％；采用本实施方式序列判断不是黑木耳菌株185的菌株与原保藏菌株185相似度小于100％。

以上的实验说明本实施方式用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列能够准确鉴定黑木耳菌株185。

二、酯酶同工酶技术检测黑木耳菌株185

将采用本实施方式序列判断为黑木耳菌株185、采用本实施方式序列判断不是黑木耳菌株185的菌株与原保藏黑木耳菌株185分别转接于OGF培养基，静止培养15天，培养液过滤分别收集菌丝2～3g，用蒸馏水冲洗2～3次，分别加入0.1mol/L TBE缓冲液1～2滴，在-20℃的条件下冷冻16h；在冰浴的条件下将菌丝研磨成糊状，在4℃的条件下以12000r/min的速度分别离心30min，上清液即为各菌株的酯酶同工酶样品。

用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶质量浓度为7.5％、pH值为8.9；浓缩胶质量浓度为2.5％、pH值为6.7；电极缓冲液Tris-Glycine系统，pH值为8.3；点样35μL，溴酚兰作指示剂，在4℃的条件下电泳，浓缩胶电压为120V，分离胶电压为220V，电泳4.0h，待指示剂距前沿线1.0cm时取下凝胶；用醋酸-α-萘酯和坚牢兰染色，直至酯酶同工酶谱带出现为止，用日光白板或凝胶成像系统检测供试黑木耳菌株的酯酶同工酶谱带，采用本实施方式序列判断为黑木耳菌株185与原保藏菌株185的酯酶同工酶谱带完全相同；采用本实施方式序列判断不是黑木耳菌株185的菌株与原保藏菌株185的酯酶同工酶谱带不完全相同。

说明本实施方式用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列能够准确鉴定黑木耳菌株185。

三、表观形态特征

将菌丝表观形态观察与对峙实验相结合鉴别黑木耳菌株185，首先采用cPDA培养基活化黑木耳菌株。将已活化的黑木耳菌株185和其他黑木耳菌株同时转接于cPDA固体培养皿(培养皿直径90mm)中。各菌株取2×2mm²，分别与黑木耳菌株185两两配对接种于cPDA平皿中心两侧，相距3cm，25℃恒温避光培养7天后，观察菌丝生长情况和菌落交界处情况，每一试验组合设3个重复。

选出与原保藏黑木耳菌株185形态相同并且无拮抗现象的菌株，这些选出的菌株即为黑木耳菌株185，将这些选出的菌株用具体实施方式三的方法进行扩增检验，均能扩增出本实施方式用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列。

以上的实验说明本实施方式用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列只存在于黑木耳菌株185的DNA中，具有特异性。

序列表

<110>黑龙江省科学院微生物研究所

<120>一种鉴定黑木耳菌株185的方法及用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列

<160>3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增黑木耳菌株185特异性基因的正向引物。

<400>1

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增黑木耳菌株185特异性基因的反向引物。

<400>2

<210>3

<211>316

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于鉴定黑木耳菌株185的基因序列。

<400>3