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法律状态信息
法律状态
2014-10-01
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K45/06 授权公告日:20120905 终止日期:20130807 申请日:20080807
专利权的终止
2012-09-05
授权
授权
2011-09-28
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K45/06 申请日:20080807
实质审查的生效
2010-02-10
公开
公开
技术领域
本发明涉及一氧化碳释放分子和肝素的新用途，具体的说，涉及一种一氧化碳释放分子联合超微剂量肝素，早期应用治疗脓毒症时凝血功能障碍的药物。
背景技术
脓毒症是严重创伤、休克及感染后常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)，即便在基础与临床医学研究及重症监护手段高度发展的现代，临床治疗仍然收效甚微，死亡率居高不下。研究表明，严重脓毒症后重要脏器功能衰竭，特别是多脏器功能衰竭的死亡率很高。多脏器功能衰竭一旦发生，现有治疗措施很难使之逆转，因此预防或减轻脓毒症早期的脏器损害尤显重要。脓毒症后早期凝血功能即发生改变，并且全身炎症反应程度密切相关，伤后早期能否有效改善异常的凝血功能，控制炎症反应，预防SIRS的发生至关重要。
近年研究证实，凝血系统异常在脓毒症发生、发展过程中具有重要作用。脓毒症时，凝血系统活化，并促进炎症的进一步发展；炎症也可引起凝血系统活化，二者相互影响，共同促进脓毒症的恶化。抑制凝血系统的活化，则可抑制失控性炎性反应，改善脓毒症患者的预后。因此，研究凝血系统在脓毒症中的作用，有助于进一步揭示脓毒症复杂的发病机制，从而为脓毒症的治疗手段及方法提供新的思路。
另外，在脓毒症早期凝血系统即可通过外源性途径活化。血管内皮细胞以及单核细胞在内毒索(LPS)或炎性介质，如肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素(IL)-1b的诱导下可表达组织因子(tissue factor，TF)。组织因子与活化的VII因子(activated factorVII，FVIIa)组成复合物，激活X因子(factor X，FX)，导致凝血反应。此外，内皮细胞还可在炎性因子的诱导下，表达凝血调节蛋白、凝血酶受体、von Willebrand因子(vWF)和生长因子，以及E选择素、细胞间黏附分子-l(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞黏附分子-l(vascular cell adhesion molecule.1，VCAM-1)等，促进白细胞与内皮细胞黏附，并激活白细胞。研究证实，血小板在凝血酶、花生四烯酸代谢产物、肾上腺素的诱导下活化，并通过膜表面糖蛋白II bPIIIa黏附到内皮细胞、血小板、胶原蛋白、纤维蛋白沉淀物等表面，形成聚集。血小板活化后可分泌凝血因子和酶类、血管活性物质、细胞因子及其他物质，如V因子、VIII因子、纤维蛋白原、一氧化氮、5-羟色胺、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及IL-1等，从而促进血小板的凝聚反应，并促使中性粒细胞及白细胞聚集、活化，加重血管损伤和炎性反应；同时血小板也可释放前列腺素、组胺等扩血管物质，减轻内皮细胞和组织的损伤。
目前作为抗凝剂对脓毒症的有治疗作用的主要有活化蛋白C、TFPI、抗凝血酶(AT)等。活化蛋白C(activated protein C，APC)是凝血系统的一个重要调节因子，具有明显的抗炎作用。APC通过对FX-a和FVIIIa的降解作用，阻止凝血酶原活化，它还能通过抑制纤溶酶原激活抑制物促进纤维蛋白溶解。并且，APC还可抑制内毒索模型中促炎性细胞因子的生成。此外，APC的协同作用因子蛋白S上的糖可抑制E-选择素与人白细胞结合，从而缩短全身炎性反应期，减少患者体内中性粒细胞的活化以及由此对内皮细胞造成的损害。因此，APC除了具备抗凝血功能外，还具有抗炎作用，是防治严重脓毒症的有效途径；TFPI能够特异地灭活FVIIa/TF和FX-a，因而选择性抑制组织因子途径对凝血酶原的激活；抗凝血酶(AT)是丝氨酸蛋白酶抑制剂，对凝血酶、FX-a、FXI-a等均有灭活作用，在肝素存在条件下这一作用可显著增强。
凝血系统与炎性反应相互促进，都是脓毒症发生、发展的关键因素。但是，单一抑制凝血过程并不能有效防治脓毒症，只有同时针对抗凝和抗炎环节进行干预，才能在临床上取得理想的疗效。致力于阐明脓毒症时凝血功能障碍其确切的病理生理机制，寻找新的、有效的治疗靶点，才有希望逐步解决目前临床脓毒症防治的重重困难。
业已证明，内源性CO对SIRS或sepsis时炎症介质和细胞因子的释放具有有效的抑止作用，从而可有效保护细胞、维持器官功能。作为体内一种重要的化学气体信使，CO能与可溶性鸟苷酸环化酶结合，并将其激活，使GTP变成cGMP。升高的cGMP再刺激依赖cGMP的蛋白激酶、磷酸酶或通过调节离子通道，从而介导一系列生物学变化。在动物实验中发现吸入低浓度CO后，血管内皮细胞和小肠内皮细胞内sGC/cGMP途径被激活，引起早期抗凋亡分子Bcl-2上调，凋亡前信号Bax下调。我们的早期研究也发现CO在血管内皮细胞和胰岛细胞缺氧复氧过程中也是通过激活sGC/cGMP途径发挥抗凋亡作用。而外源性一氧化碳干预SIRS或Sepsis的研究较少，主要是由于外源性CO的给予方式及浓度控制比较困难，不利于长期观察实验结果。
外源性一氧化碳释放分子(Carbon monoxide-releasing molecules，CORMs)是近年来新合成的一种一氧化碳复合物，该一氧化碳复合物的制备方法和理化性能参数，在Motterlini R等所著文献(Curr.Pharm.2003；9：2525-39)中有详细的报道，该一氧化碳复合物通常可用于制备缓释的一氧化碳。
肝素应用在抗凝治疗中占有重要的地位。肝素除有减轻器官功能损伤、重建凝血抗凝平衡作用外，尚有抗感染、抗过敏、缓解支气管痉挛、降低血液黏稠度、改善微循环、降低血脂和扩张冠状动脉，促进炎症吸收等作用。但在脓毒症时单用大剂量的肝素，对凝血功能反而带来更大的损害。
能否将所述的一氧化碳释放分子联合超微剂量肝素，用于早期治疗脓毒症时凝血功能障碍，将能改善早期的全身炎症反应，具有十分重要临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一氧化碳释放分子和肝素在制备治疗脓毒症药物中的应用，以满足临床应用的需要。
本发明所述的药物，由制剂A和制剂B组成，所述的制剂A包括治疗有效量的一氧化碳释放分子和医药学上可接受的载体，所述制剂B包括治疗有效量的肝素和医药学上可接受的载体，一氧化碳释放分子和肝素的用量之间的比例为：6～10mg一氧化碳释放分子/100IU肝素，优选的比例为：7～9mg一氧化碳释放分子/100IU肝素，最优选的比例为：8mg一氧化碳释放分子/100IU肝素；
其中：单位IU指的是国际单位；
所述的载体选自DMSO或生理盐水中的一种；
制剂A中，一氧化碳释放分子的重量含量为20.5mg/ml，制剂B中，肝素的含量为1000IU/L；
发明人经过大量的动物试验发现，将所述的一氧化碳释放分子溶解在溶剂中，然后将其置于细胞培养液或生物体内，中可以持续性释放CO，故可作为一种外源性CO供体，同时联合应用超微剂量的肝素，并采用小鼠盲肠结扎和穿孔(CLP)脓毒症模型，进行早期干预，进行试验，发现一氧化碳释放分子联合应用超微剂量的肝素，可以作为早期改善脓毒症时凝血功能障碍的药物。
本发明的药物，制剂A可以通过静脉给药途径，制剂B可以通过腹腔给药途径，施加于需要治疗的患者，一氧化碳释放分子的剂量一般7～9mg/kg体重/天，肝素的剂量一般为100IU/kg体重/天，具体可由医师根据病人的病情等因素决定。
采用所述的一氧化碳释放分子联合应用超微剂量的肝素改善脓毒症凝血功能障碍，其浓度控制相对容易且正确，长期使用时追加方便，同时减少了肝素的用量及其副作用，能够满足临床应用的需要。采用所述的一氧化碳释放分子CORM-2联合超微剂量的肝素改善脓毒症时凝血功能障碍，其浓度控制相对容易且正确，长期使用时追加方便，能够满足临床应用的需要。
附图说明
图1为CLP 24h后肝、肺组织TF蛋白表达(Western Blot)。
具体实施方式
实施例1
药物的制备：
将20.5mg的一氧化碳释放分子与1ml的DMSO混合，获得浓度含量为40mM的制剂A，按8mg/kg体重的剂量使用；将20000IU/2ml的肝素与生理盐水混合稀释10倍，获得1000IU/L的肝素溶液制剂B，按100IU/kg体重的剂量使用。
实施例2
CORM-2+超微剂量肝素对脓毒症小鼠WBC、PLT计数、纤溶酶原(PLG)及抗凝血酶III(AT-III)活性的影响。
试验方法：
(1)动物及CLP脓毒症模型
雄性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重18±2克，于普通实验室饲养(商品化干块料，自由饮水)。实验动物按照随机数字表法分成三组：Sham组(n＝9)，CLP组(n＝9)及CLP+CORM-2+肝素组(n＝9)。
CLP组小鼠异氟烷吸入麻醉下，行盲肠结扎和穿孔术，伤后腹腔内注射生理盐水1.5ml抗休克；CLP+CORM-2+肝素组小鼠CLP后尾静脉注射CORM-2(8mg/kg)，并同时腹腔注射肝素100U/kg体重。
其中：Sham组采用的药物为生理盐水，CLP组采用的药物为生理盐水，CLP+CORM-2+肝素组采用的药物为实施例1的药物。(以下实施例均相同)
所有动物伤后24小时用异氟烷过度吸入致死后收集标本。
(2)检测指标
1.WBC、PLT计数：
血常规检查：1.0ml全血以0.1ml 15g/L EDTA-K2抗凝，采用日本SYSMEX KX-21N血细胞分析仪及相关试剂测定白细胞(WBC)、血小板(PLT)。
2.纤溶酶原(PLG)及抗凝血酶III(AT-III)活性检测：
纤溶酶原(PLG)及抗凝血酶III(AT-III)活性测定试剂盒购自上海太阳生物技术公司。
动物CLP后24小时用异氟烷过度吸入致死后采集血标本。检测WBC和PLT计数，并采用发色底物法测定纤溶酶原(PLG)及抗凝血酶III(AT-III)活性。
统计学处理：数据用均数±标准差表示，均数的比较采用t检验。P＜0.05为有统计学差异。差异显著性检验采用SAS6.02统计软件。
结果如下：
1.CORM-2+超微剂量肝素对CLP后小鼠血WBC、PLT计数的影响见表1：
表1
*与对照组比较，P＜0.05；△与CLP组比较，P＜0.05。
表1可见，CLP 24h后小鼠血WBC、PLT计数的变化。CLP后血小板计数(589±128)较正常组(750±102)减少，使用CORM-2+超微剂量肝素后血小板计数上升(718±104)(P＜0.05)，WBC计数未见明显变化。
2.CORM-2+超微剂量肝素对CLP后小鼠纤溶酶原(PLG)及抗凝血酶III(AT-III)活性影响见表2：
表2
*与对照组比较，P＜0.05；△与CLP组比较，P＜0.05
表2显示，CLP 24h后小鼠纤溶酶原(PLG)及抗凝血酶III(AT-III)活性的变化。CLP后抗凝血酶III活性(0.63±0.13)较正常组(1.49±0.11)下降，使用CORM-2+超微剂量肝素后抗凝血酶III活性明显提高(1.40±0.19)(P＜0.05)；CLP后纤溶酶原(0.69±0.22)较正常组(1.17±0.66)下降，使用CORM-2+超微剂量肝素后纤溶酶原明显增加(0.98±0.09)(P＜0.05)。
实施例3
CORM-2+超微剂量肝素对脓毒症小鼠凝血系统及血小板聚集的影响
试验方法：
(1)动物及CLP脓毒症模型
雄性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重18±2克，于普通实验室饲养(商品化干块料，自由饮水)。实验动物按照随机数字表法分成三组：Sham组(n＝9)，CLP组(n＝9)及CLP+CORM-2+肝素组(n＝9)。CLP组小鼠异氟烷吸入麻醉下，行盲肠结扎和穿孔术，伤后腹腔内注射生理盐水1.5ml抗休克；CLP+CORM-2+肝素组小鼠CLP后尾静脉注射CORM-2(8mg/kg)，并同时腹腔注射肝素100U/kg体重。所有动物伤后24小时用异氟烷过度吸入致死后收集标本。
(2)检测指标
1.脓毒症小鼠凝血系统检测：
①出血时间：CLP24h后小鼠经腹腔麻醉小鼠，在距尾尖2mm处将尾断，尾部远端3till浸入37℃盐水中，测定从尾部横断至流血终止的时间。
②凝血系统：CLP24h后小鼠心脏取血，即刻离心，血浆于37℃预热2min，与重组促凝血酶原激酶混合，记录血块形成时间，计算凝血酶原时间。
2.脓毒症小鼠血小板聚集功能的测定：
CLP24h后小鼠经腹腔麻醉小鼠，从腹主动脉取血，抗凝离心(1000r/min)后获得富含血小板的血浆(PRP)；再次离心(2500r/min)后获得少小板血浆(PPP)。用PPP将PRP调至3×108个血小板/mL，取45LPRP与5LADP混合，检测其OD值。计算血小板聚集率，根据公式计算药物对血小板的聚集抑制率。
聚集抑制率＝[(对照血小板聚集集一实验血小板聚集率)/对照血小板聚集率]×100％
统计学处理：数据用均数±标准差表示，均数的比较采用t检验。P＜0.05为有统计学差异。差异显著性检验采用SAS6.02统计软件。
结果如下：
CORM-2联合超微剂量肝素对CLP后脓毒症小鼠凝血系统的影响见表3。
表3
*与对照组比较，P＜0.05；△与CLP组比较，P＜0.05
表3显示，CLP 24h后小鼠出血时间(13.9±5.99)较正常组(12.8±4.23)未见明显延长，但使用CORM-2+超微剂量肝素后出血时间(21.2±4.80)明显延长(P＜0.05)；CLP 24h后小鼠凝血时间较正常组明显延长，使用CORM-2+超微剂量肝素后凝血时间更加明显延长(P＜0.05)。
CORM-2联合超微剂量肝素对CLP后脓毒症小鼠血小板聚集功能的影响见表4：
表4
*与对照组比较，P＜0.05；△与CLP组比较，P＜0.05
表4显示，CLP 24h后，血小板聚集率明显提高(98.33±24.65)，CORM-2联合超微剂量肝素对血小板聚集抑制作用较强，使血小板聚集率下降为(62.35±19.48)，可显著抑制凝血酶诱导的血小板聚集(P＜0.05)，聚集抑制率达36.9％。
实施例4
CORM-2+超微剂量肝素对脓毒症小鼠肝、肺组织的组织因子(TF)表达的影响
试验方法：
(1)动物及CLP脓毒症模型
雄性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重18±2克，于普通实验室饲养(商品化干块料，自由饮水)。实验动物按照随机数字表法分成三组：Sham组(n＝9)，CLP组(n＝9)及CLP+CORM-2+肝素组(n＝9)。CLP组小鼠异氟烷吸入麻醉下，行盲肠结扎和穿孔术，伤后腹腔内注射生理盐水1.5ml抗休克；CLP+CORM-2+肝素组小鼠CLP后尾静脉注射CORM-2(8mg/kg)，并同时腹腔注射肝素100U/kg体重。所有动物伤后24小时用异氟烷过度吸入致死后收集标本。
(2)检测指标
脓毒症小鼠肝、肺组织的组织因子(TF)表达：
TF的测定试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。
动物CLP后24小时用异氟烷过度吸入致死后采集血标本。采血后立即断髓处死剖腹取出肝、肺组织，冷冻保存。组织标本于液氮中研磨，随后置于300 1缓冲液E[10mMHEPES(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙磺酸pH7.9)，10mmol/LKCl，1.5mM MgCl2，1％NP-40，0.5mM DTT(dithiothreitol，二硫苏糖醇)，0.5mM PMSF(phenylmethyl sulfonylfluoride，苯甲基磺酰氟化物)，10g/ml aprotinin(抑酞酶)，10g/mlleupeptin(亮肽素)，5％甘油]中冰浴匀浆，将匀浆液移至EP管中，4℃下3,000g离心10min，吸取上清，-80℃保存。
TF含量采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测，各项目严格按照说明书操作，在变色龙自动酶标仪(西班牙DIAGNOSTICGRIFOLS公司)上比色测定。
蛋白印迹(Western blotting)：每组取等量蛋白(10g)进行电泳，再将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质电泳转移到硝酸纤维(SG)膜上依次加入相应一抗(大鼠抗小鼠TF抗体，稀释度为1∶1000)、二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠IgG，稀释度1∶2500)及化学发光剂(Enhanced Chemiluminescence试剂盒，ECL)，暗室中曝光于x光片，胶片经全自动洗片机处理，蛋白带用图象分析系统分析，见图1。
统计学处理：数据用均数±标准差表示，均数的比较采用t检验。P＜0.05为有统计学差异。差异显著性检验采用SAS6.02统计软件。
结果如下：
CORM-2+超微剂量肝素对CLP后小鼠血浆、肝、肺组织的组织因子(TF)表达的影响见表5：
表5
*与对照组比较，P＜0.05；△与CLP组比较，P＜0.05
表5显示，CLP 24h后血浆、肝、肺组织TF蛋白表达(0.898±0.055，1.341±0.054，1.044±0.02)较正常组(0.408±0.042，0.714±0.045，0.609±0.013)明显增高(P＜0.05)，应用CORM-2+超微剂量肝素后脏器的TF蛋白表达(0.536±0.019，0.854±0.076，0.741±0.012)与CLP组相比明显下降，差异有显著意义(P＜0.05)。
机译： 肝素结合蛋白在制备治疗脓毒症的药物制剂中的用途
机译： 肝素结合蛋白在治疗脓毒症中的用途，制备过程和包含其的药物组合物
机译： 肝素结合蛋白在治疗脓毒症中的用途，制备过程和包含其的药物组合物
