公开/公告号CN101701945A
专利类型发明专利
公开/公告日2010-05-05
原文格式PDF
申请/专利号CN200910194053.0
申请日2009-11-20
分类号G01N30/02(20060101);G01N30/06(20060101);G01N30/36(20060101);
代理机构44104 广州知友专利商标代理有限公司;
代理人宣国华
地址 510610 广东省广州市天河区东莞庄一横路133号
入库时间 2023-12-17 23:44:22
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-12-05
授权
授权
2010-06-23
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/02 申请日:20091120
实质审查的生效
2010-05-05
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种利用HPLC测定黑大豆种质种皮花色苷构成谱及含量的方法，属于液相色谱分析技术领域。
背景技术
花色苷是广泛存在于自然界多种植物的种皮、果皮中的一类水溶性色素，具有显著的抗氧化、抗肿瘤、改善视力等多种生物活性。医学研究表明花色苷的摄入量与心脑血管病、癌症等许多慢性疾病的发病率和死亡率呈显著的负相关关系。目前花色苷已成为开发化妆品和多种保健食品的重要的功能成分。因此，寻找花色苷含量高的植物来源，用于指导和改善人民的膳食结构以及作为分离制备花色苷的原料，对于改善人民的健康水平、提高农产品的附加值具有重要作用。黑大豆是我国的一种传统的药食两用食品，具有多种营养保健功能，其种皮中花色苷含量高于许多公认的高花色苷含量的葡萄皮、欧洲越橘等。目前的研究发现黑大豆种皮中富含的花色苷类物质是其发挥多种生理活性的重要物质基础。不同的黑大豆品种其种皮花色苷的组成和含量有很大差别，而花色苷的种类不同，其生物活性也不相同。因而，建立一种准确高效的不同品种黑大豆种皮花色苷构成谱的测定方法，对于促进黑大豆的开发利用有重要作用。
基于花色苷类化合物在505-530nm之间有特征吸收峰，目前花色苷总含量的测定方法多采用紫外-可见光谱法，但由于该方法存在测定结果与实际结果偏差较大且只能测定总含量，无法了解具体花色苷的构成种类及各单体的含量等缺点，只适合大范围的初步筛选；用HPLC方法测定花色苷可以克服上述缺点，但是目前常用检测方法需要一个复杂的花色苷的提取纯化过程，前处理工作繁琐，大大增加了测定的工作量。同时多步分离纯化过程不可避免会损失部分目标物质，在没有足够高的样品处理量的前提下，一些含量很低的花色苷组分很难被检出。因此，有必要建立一种准确快速的黑大豆种皮花色苷的测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用HPLC测定黑大豆种质种皮花色苷构成谱及含量的方法，该方法具有稳定性和精密度高，重现性好等特点，能客观真实地反映其花色苷的组成及含量。
为达到以上目的，本发明提供的利用HPLC测定黑大豆种质种皮花色苷构成谱及含量的方法，包括以下步骤：
(1)制备黑大豆供试品溶液；
(2)确定色谱条件：色谱柱：XBridge C18柱(4.6×250mm，5.0μm，预柱4.6×20mm)，流动相：10％(V/V)甲酸的水溶液A和乙腈∶甲醇∶水∶甲酸＝25∶25∶40∶10(V/V)的混合溶液B，流速：1ml/min，柱温：25℃，检测波长：520nm，进样量：20μL，记录时间：20min，洗脱方式：梯度洗脱；
(3)按(2)的色谱条件，取黑大豆供试品溶液和标准品溶液注入高效液相色谱，通过对照各花色苷与标准品溶液的保留时间和加标定性的方法获得各花色苷的构成谱；
(4)按(2)的色谱条件，取黑大豆供试品溶液注入高效液相色谱，用标准曲线法计算出黑大豆种质种皮中各花色苷单体的含量。
在上述步骤中：
步骤(1)中黑大豆供试品溶液的制备过程为：取黑豆皮，粉碎过筛，用酸化甲醇溶液在35～45℃水浴中浸提2h水浴中浸提1.5～3h，离心，分离上清液进行微孔滤膜过滤，即得黑大豆供试品溶液。
所述黑豆皮与酸化甲醇的重量体积比为1∶15～25。
所述酸化甲醇溶液中甲醇的体积浓度为50％～65％，所述酸化甲醇溶液的pH值为2.0～3.0。
所述微孔滤膜的孔径为0.22～0.45μm。
步骤(2)中所述的梯度洗脱为：0→8min→11min→20min，B液以体积比计为16％→20％→38％→46％。
步骤(3)的标准品溶液中含有飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矮牵牛-3-葡萄糖苷、芍药定-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷。
本发明的有益效果是：
(1)本发明测定方法具有准确性、灵敏度高及重现性好等特点；
(2)本发明测定方法既避免了以往用pH示差法通过分光光度计测定花色苷含量只能测定总含量的缺点，又避免了通过多步分离纯化以鉴定各花色苷组分程序的繁琐以及多次处理造成的微量组分的丢失；
(3)本发明测定方法样品的前处理简单，利用在低pH条件下，505-530nm波长范围内很少出现花色苷以外的其它杂峰的特点，检测到黑大豆种皮中的各个花色苷组分及含量。
附图说明
图1是五种花色苷混合标准品与一黑大豆品种种皮花色苷的HPLC对照图，其中峰序号为：1、飞燕草素-3-葡萄糖苷Dp 3-glu，2、矢车菊素-3-葡萄糖苷Cy3-glu，3、矮牵牛-3-葡萄糖苷Pt 3-glu，4、芍药定-3-葡萄糖苷Pn 3-glu，5、锦葵素-3-葡萄糖苷Mv 3-glu，下同；
图2是标准加入法确定黑大豆种皮中的锦葵素-3-葡萄糖苷的色谱图，其中A为样品未加入标准品锦葵素-3-葡萄糖苷的色谱图，B为样品中加入标准品锦葵素-3-葡萄糖苷后的色谱图。
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
第一部分利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方法
1仪器、试材及药品
1.1仪器：Agilent 1200LC高效液相色谱仪，Agilent 12O0LC高效液相色谱仪，真空脱气装置，自动进样装置，Agilent VWD检测器，Agilent Chemstation工作站；
1.2试材及药品：不同品种的黑大豆10份，乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，超纯水，其余试剂均为分析纯；飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矮牵牛-3-葡萄糖苷、芍药定-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷花色苷对照品购自挪威Polyphenols Laboratories AS公司。
2方法与结果
HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备手工剥取黑豆皮，用粉碎机粉碎后，过60目筛，精密称取黑豆皮粉末0.500g，用10ml酸化甲醇溶液，用1mol/L HCl调pH至2.5，40℃水浴浸提2h，3000rpm离心10min，分离上清并用0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品上样液；
(2)色谱条件与系统适用性实验色谱柱：XBridge C18柱(4.6×250mm，5.0μm，预柱4.6×20mm)，流动相：10％(V/V)甲酸的水溶液A和乙腈∶甲醇∶水∶甲酸＝25∶25∶40∶10(V/V)的混合溶液B，流速：1ml/min，柱温：25℃，检测波长：520nm，进样量：20μL，记录时间：20min，洗脱方式：梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0-8min 16％-20％B，8-11min20-38％B，11-20min 38-46％B(按体积百分比计)，具体见下表1：
表1梯度洗脱程序
(3)各花色苷构成谱的确定五种花色苷利用相对保留时间和添加标准物质法定性，对照混标溶液和样品供试液在相同的色谱条件下的色谱图和相对保留时间；在样品中加入各种标准物质，比较相同色谱条件下不加标样品及加标样品的色谱图；
经上述方法确定的五种花色苷的保留时间依次为：飞燕草素-3-葡萄糖苷6.6min、矢车菊素-3-葡萄糖苷8.2min、矮牵牛-3-葡萄糖苷9.6min、芍药定-3-葡萄糖苷14.5min、锦葵素-3-葡萄糖苷15.0min。
(4)样品中各花色苷含量的确定取对照品溶液，用甲醇稀释得梯度标准溶液，进样，以峰面积对浓度绘制标准曲线，取供试品溶液，进样检测后，根据标准曲线，对所得数据和图谱进行处理，得到供试品中各花色苷的含量。
对照品溶液的制备过程为：取飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矮牵牛-3-葡萄糖苷、芍药定-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷各1mg，加甲醇溶解，制备成浓度为1mg/ml的对照品贮存溶液。
上述HPLC方法测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的结果如下：
标准曲线和相关系数如下：精确称取飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矮牵牛-3-葡萄糖苷、芍药定-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷5个标样各1mg，用甲醇溶解成各标样浓度均为1mg/mL的混合标样储存液，再用甲醇溶液稀释成1、10、50、100、200、500μg/ml系列梯度标准溶液，密封避光保存于-20℃备用。将混合标样溶液按浓度由低到高设置自动进样，每个浓度重复进样3次，以各单体花色苷的平均峰面积A对浓度C绘制标准曲线，并计算相关系数(见下表2)。
表2 4种花色苷标样标准曲线的回归分析
取10个黑大豆品种，自动进样，每个样品进样三次，根据峰面积用标准曲线法计算各花色苷单体含量，结果见下表3。
表3 10个黑大豆品种种皮花色苷含量(mg/g豆皮)
注：-为在该色谱条件下未检测到。
第二部分该方法的稳定性、重复性和精密度测试
2.1方法稳定性试验
花色苷是一类对光、温度、pH均比较敏感的色素，光照、高温和较高的pH条件下会很快分解，因此本发明对实验的稳定性进行了分析。
取市售黑大豆，手工剥取黑豆皮，粉碎机粉碎后过60目筛。精密称取黑豆皮粉末0.500g，用10ml酸化甲醇溶液(1mol/LHCl调pH至2.5)40℃水浴浸提2h，3000rpm离心10min，分离上清并用0.22μm微孔滤膜过滤，得供试品上样液。将该样品供试液分别在样品制备完成后第0、2、4、8、12、24h进行HPLC分析测定，考察主要色谱峰的相对峰面积的一致性，并计算各自的RSD。5种花色苷色谱峰的相对峰面积RSD为2.6％～4.8％，表明样品在24小时内稳定。
2.2方法重复性试验
称取2.1中所述黑大豆种皮粉末0.500g，共5份，按2.1所述方法对样品进行处理，分别进样，考察5个花色苷色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，并计算各自的RSD。结果表明，各色谱峰的相对保留时间RSD为0.06％～0.15％，相对峰面积RSD为1.4％～2.8％，说明该方法有很好的重复性。
2.3色谱系统的精密度试验
精确称取黑大豆种皮粉末0.500g，共5份，按2.1所述方法对样品进行处理，连续进样5次，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，并计算各自的RSD。各色谱峰的相对保留时间RSD为0.01％～0.02％，相对峰面积RSD为0.9％～2％，表明色谱系统精密度良好。
机译： 包含从黑大豆种皮中提取的花色苷的控制糖尿病的药物组合物
机译： 基于体积的土壤水分含量测定装置，利用土壤水分含量测定方法，利用土壤水分含量测定方法检验土壤水分含量的方法
机译： 一种利用离子迁移谱法测定氮中氢和甲烷浓度的方法。
