大宝山伯克霍尔德菌及其应用

具体实施方式

以下通过具体实施例来详细说明本发明。

实施例1：本发明大宝山伯克霍尔德菌的分离

从广东大宝山重金属污染区采集0-30cm土样，取10g土壤放入装有90mL无菌水的三角瓶中(带玻珠)，在180rpm转速下振荡30分钟，静置10分钟后取上层液稀释10倍后取0.1mL均匀涂布在MGY琼脂培养基板上，翻转平板置于28℃培养箱中培养2天，即可获得本发明所述的大宝山伯克霍尔德菌(Burkholderia dabaoshanensis GIMN1.004)。所述大宝山伯克霍尔德菌(Burkholderia dabaoshanensis GIMN1.004)已于2009年5月10日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：武汉大学)，保藏编号为No.M209109

MGY琼脂培养基：

KCl 0.01％；MgSO₄·7H₂O 0.025％；(NH₄)₂SO₄ 0.2％；K₂HPO₄ 0.025％；葡萄糖0.1％；酵母膏0.01％；琼脂2.0％；ddH₂O 1000ml；pH4.0；

本发明的大宝山伯克霍尔德菌(Burkholderiadabaoshanensis GIMN1.004)具有下述性质：

1.形态特征

大宝山伯克霍尔德菌在MGY琼脂培养基平板上能产生紫色颗粒；在加有重金属的MGY培养基中的菌落先呈淡粉色后逐渐转为乳白色，菌落圆形，表面皱缩。在NA培养基中菌落呈蓝灰色；菌株GIMN1.004革兰氏染色为阴性，菌体杆状；通过投射电镜，菌体内可观察到颗粒状物质。如图1所示。

2.生理生化特征

通过Biolog试验，本发明的大宝山伯克霍尔德氏菌能利用一下碳源：

Adonitol Amygdalin Arbutin D-Cellobiose a-Cydodextrin B-Cyclodextrin i-ErythritolD-Fructose L-Fucose D-Galacturonic Acid Gertibiose Glucose-1-PhosphateGlucose-6-Phosphate a-D-Lactose Lactulose Maltose Maltotriose D-MetezitoseD-Melibiose 3-Methyl-D-Glucose B-Methyl-D-Galactoside B-Methyl-D-GlucosideL-Rhamnose Stachyose Sucrose Turanose Formic Acid a-Hydroxybutyric Acid ItaconicAcid a-Ketobutyric Acid a-Ketovaleric Acid D，L-Lactic Acid L-Lactic Acid D-LacticAcid Methyl Ester D-Malic Acid Propionic Acid Pyruvic Acid Methyl Ester D-SaccharicAcid Succinamic Acid Succinic Acid Succinic Acid Mono-Methyl Ester Urocanic AcidL-Alaninamide L-Alanyl-L Threonine L-Asparagine L-Glutamic Acid Glycyl-L-AsparticAcid Glycyl-L-Glutamine Glycyl-L-Proline 2/-Deoxy Adenosine  Thymidine  UridineUridine-5/-Monophosphate m-Inositol a-Methyl-D-Galactoside a-Methyl-D-GlucosideD-Raffinose Salicin Acetic Acid Fumaric Acid L-Alanyl-L-Glutamine L-MethionineN-Acetyl-D-Glucosamine N-Acetyl-B-D-Mannosamine D-Gluconic Acid D-GlucosaminicAcid Pyruvic Acid L-Alanyl-L-Histidine Inosine a-D-Lactose Palatinose L-AlanineL-Serine。

3.其他性质

甲基萘醌的主要类型为MK-8，细胞壁脂肪酸种类和含量如表1。

表1  细胞壁脂肪酸种类和含量

实施例2：本发明大宝山伯克霍尔德氏菌16SrDNA的序列测定

1、PCR模板DNA的快速制备

将细菌划线接种在NA培养基的平板上，30℃培养过夜。取单一菌落悬浮于10μl无菌蒸馏水中，于沸水中加热5min，离心，取上清作为PCR模板DNA.

2、16SrRNA基因PCR扩增

PCR引物由上海英骏公司合成。

PrimerA：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

PrimerB：5’-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3’

PCR反应体系(总体积50μl)：10倍缓冲液5μl，dNTP(2mmol/l)4μl，PrimerA(10pmol/l)1μl，PrimerB(10pmol/l)1μl，Taq酶(2U/l)0.4μl，DNA模板1μl，灭菌ddH₂O 37.4μl。

PCR扩增条件：94℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min。

3、序列测定

PCR产物纯化后，送上海英骏公司用3730全自动测序仪测序，测试结果见附图2。其16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示(登录号：FJ210816.1)，

测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与本发明的菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的16SrDNA序列，构建系统发育树。

大宝山伯克霍尔德菌的基因序列与Burkholderia soli sp.nov.(KACC11589)的同源性为99.0％，但是两株菌在菌落形态以及生理生化方面都有较大差异。从系统发育树可以看出，大宝山伯克霍尔德菌与KACC11589和Burkholderia sp.A6.2两株菌关系密切，聚成一类构成一个分支，但又独立两株菌。通过DNA-DNA杂交显示，大宝山伯克霍尔德菌与亲缘关系最近的模式菌株KACC11589的DNA-DNA杂交结果为25.0％。

本发明的大宝山伯克霍尔德菌与其同源性最高的Burkholderia soli sp.nov.(KACC11589)菌株微生物学特性的比较见表2。

表2  大宝山伯克霍尔德菌与其同源性最高的Burkholderia soli菌株微生物学特性比较

注：+：阳性；-：阴性；ND：表示没有测定

综合16SrDNA序列分析和DNA-DNA杂交结果(1987年国际系统细菌学委员会ICSB规定，DNA同源性小于70％或杂交分子的热解链温度差小于或等于2℃为细菌种的界线，Wayneet al，1987)，本发明的伯克霍尔德氏菌是一种新的细菌，命名为大宝山伯克霍尔德菌(Burkholderia Dabaoshanensis GIMN1.004)。

实施例3：本发明所述大宝山伯克霍尔德氏菌耐重金属能力测定

通过测定微生物对重金属的最大耐受浓度(Maximal tolerant concentration，MTC)，来确定细菌对某种金属离子的极限耐受浓度。

挑取本发明的大宝山伯克霍尔德氏菌菌株的单菌落，接种至装有50mL液体NA培养基的三角瓶中，在28℃的摇床上培养(180转速)至对数生长期，然后将培养好的菌液用接种针划线接种到一系列包含不同浓度的镉离子的NA固体平板上，翻转平板置于28℃培养箱中培养4d后观察菌落的生长。

如果在某个浓度只能细微地观察到有菌落的生长，并且在略微高于这个浓度的平板上观察不到菌落的生长，这一浓度便是本发明大宝山伯克霍尔德氏菌菌株对这种金属的最大耐受浓度MTC。

测试结果表明，本发明大宝山伯克霍尔德氏菌菌株耐受镉的能力达到22mmol/L即2640mg/L。

序列表

<110>广东省微生物研究所

<120>大宝山伯克霍尔德菌及其应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1437

<212>DNA

<213>Burkholderia dabaoshanensis

<400>1

acacatgcaa gtcgaacggc agcacggggg caaccctggt ggcgagtggc    50

gaacgggtga gtaatacatc ggaacgtgtc ctggagtggg ggatagcccg    100

gcgaaagccg gattaatacc gcatacgctc tacggaggaa agcgggggat    150

cttcggacct cgcgctcaag gggcggccga tggcggatta gctagttggt    200

agggtaaagg cctaccaagg cgacgatccg tagctggtct gagaggacga    250

ccagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca    300

gtggggaatt ttggacaatg ggggcaaccc tgatccagca atgccgcgtg    350

tgtgaagaag gccttcgggt tgtaaagcac ttttgtccgg aaagaaatcc    400

tttgggctaa tacctcggag ggatgacggt accggaagaa taagcaccgg    450

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgcg agcgttaatc    500

ggaattactg ggcgtaaagc gtgcgcaggc ggttcgctaa gaccgatgtg    550

aaatccccgg gcttaacctg ggaactgcat tggtgactgg cgagctagag    600

tgtggcagag gggggtagaa ttccacgtgt agcagtgaaa tgcgtagaga    650

tgtggaggaa taccgatggc gaaggcagcc ccctgggcta acactgacgc    700

tcatgcacga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc    750

acgccctaaa cgatgtcaac tagttgttgg ggattcattt ccttagtaac    800

gtagctaacg cgtgaagttg accgcctggg gagtacggtc gcaagattaa    850

aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggat gatgtggatt    900

aattcgatgc aacgcgaaaa accttaccta cccttgacat ggacggaatc    950

cctgctgaga ggtgagagtg ctcgaaagag aaccgtcgca caggtgctgc    1000

atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg    1050

agcgcaaccc ttgtctctag ttgctacgaa agggcactct agagagactg    1100

ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc ctcatggccc    1150

ttatgggtag ggcttcacac gtcatacaat ggtcggaaca gagggttgcc    1200

aacccgcgag ggggagctaa tcccagaaaa ccgatcgtag tccggattgc    1250

actctgcaac tcgagtgcat gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca    1300

gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca    1350

ccatgggagt gggttttacc agaagtggct agtctaaccg caaggaggac    1400

ggtcaccacg gtaggattca tgactggggt gaagtcg                  1437