血样稀释用试剂及用其测定平均红细胞容积的方法

具体实施方式：

本实施方式的血样稀释用试剂含有水、羟基值为52～60的聚氧乙烯烷基醚和渗透压调整剂，渗透压为150～400mOsm/kg。

在本实施方式中，所谓羟基值是作为醚化物中所含羟基数的大小指标的数值。更具体而言，是将1g醚化物中所含游离的羟基乙酰化所用的乙酸中和所需的氢氧化钾的毫克数。

本实施方式的血样稀释用试剂含有羟基值为52～60的聚氧乙烯烷基醚。最好含有羟基值为53～58的聚氧乙烯烷基醚。这样可以使MCV值随测定温度变化的转折点温度在20℃以下。

在此，聚氧乙烯烷基醚的羟基值将随氧乙烯链的平均值增长而缩小。相反，随氧乙烯链的平均值缩短而增大。比如，氧乙烯链的平均值为20的、聚氧乙烯(20)油基醚的羟基值约为50。氧乙烯链的平均值为19的、聚氧乙烯(19)油基醚的羟基值约为55。氧乙烯链的平均值为18的、聚氧乙烯(18)油基醚的羟基值约为57。氧乙烯链的平均值为16的、聚氧乙烯(16)油基醚的羟基值约为60。

聚氧乙烯烷基醚的羟基值也可以通过混合氧乙烯链平均值不同的几种聚氧乙烯烷基醚来调整。比如，以1∶3混合聚氧乙烯(20)烷基醚和聚氧乙烯(16)烷基醚，可以将羟基值调整到约54。即，本实施方式的血样稀释用试剂也可以包含氧乙烯链平均值彼此不同的至少二种聚氧乙烯烷基醚。

血样稀释用试剂中所含聚氧乙烯烷基醚的羟基值可以用众所周知的方法测定。比如在吡啶中使血样稀释用试剂中所含聚氧乙烯烷基醚与乙酸酐反应，生成乙酸。生成的乙酸以酚酞为指示剂，用氢氧化钾滴定，即可以测定羟基值。测定羟基值的自动羟基值测定装置也在市场上有售。也可以使用此装置测定血样稀释用试剂中所含聚氧乙烯烷基醚的羟基值。在此，本实施方式使用的聚氧乙烯烷基醚的氧乙烯链平均值最好为16以上。

血样稀释用试剂中所含聚氧乙烯烷基醚的浓度为0.0005～0.5重量％，以0.001～0.1重量％为佳，最好为0.005～0.05重量％。

在本实施方式中，血样稀释用试剂的渗透压为150～400mOsm/kg，最好调整为230～350mOsm/kg。通过将血样稀释用试剂的渗透压调整到此范围可以抑制血样随时间推移MCV值发生变化。作为将血样稀释用试剂的渗透压调整到上述渗透压的渗透压调整剂，比如有氯化钠、氯化钾等。

在本实施方式中，血样稀释用试剂可以含有缓冲剂。作为缓冲剂有磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、tris缓冲剂及咪唑缓冲剂。特别以硼酸盐缓冲剂为宜。

在本实施方式中，血样稀释用试剂的pH值调整为6～8.5。作为将血样稀释用试剂的pH值调整到上述pH值的pH值调整剂，比如有盐酸和氢氧化钠等。

在本实施方式中，血样稀释用试剂可以含有防氧化剂。作为防氧化剂如有乙二胺四乙酸(EDTA)和单烃基酚(Butylmethylphenol)等，最好是EDTA。

在本实施方式中，血样稀释用试剂可以含有防腐剂。作为防腐剂有2-巯基吡啶-1-氧化钠和β-苯乙醇等。特别以2-巯基吡啶-1-氧化钠为佳。

图1为用本发明的血样稀释用试剂测定MCV的自动血液分析仪1的简要结构正面图。本实施方式的自动血液分析仪1如图1所示，由测定单元2和数据处理单元3构成。测定单元2和数据处理单元3通过数据线3a连接，可互相进行数据通信。数据处理单元3由输入设备36、显示器37和数据处理器38构成。在自动血液分析仪1，由测定单元2对血样中所含成份进行规定的测定。由数据处理单元3对测定单元2测得的测定数据进行分析处理。测定单元2和数据处理单元3可以通过数据线3a直接连接。还可以通过通信网络连接。作为通信网络有使用电话线路的专用电路、无线网、局域网或互联网等。

图2为自动血液分析仪1的简要结构框图。如图2所示，测定单元2包括稀释液容器4、加热器5、供样器6、DC检测器7、废液室8、流路9、温度传感器10、温度传感器11、控制器12和通信接口13。

在此，血样稀释用试剂(以下有时简单地称为稀释液)装在稀释液容器4中。供样器6包含混合室6a、样阀6b、吸移管6c、注射器6d和电机6e等。

如图2所示，稀释液容器4、样阀6b、吸移管6c、注射器6d、混合室6a、DC检测器7及废液室8由流路9连接。液体在流路9的流动由受电机6e驱动的注射器6d的动作和样阀6b所控制。具体而言，

(1)血样由吸移管6c从采血管中被吸移到样阀。

(2)经样阀6b定量的血样由稀释液稀释到500倍，运至混合室6a。

(3)混合室6a中的稀释试样运送到DC检测器7。

(4)流过DC检测器7的稀释试样被排到废液室8。

在此，测定单元2在连接稀释液容器4和样阀6b的流路9上有一加热器5。稀释液由此加热器5加温，使稀释试样在DC检测器7的温度在20℃以上。测定单元2的加热器5配置在连接稀释液容器4和样阀6b的流路9上，但不限于此。只要配置加热器5使稀释试样在DC检测器7的温度为20℃以上即可。比如，加热器5也可以配置在流路9的其他位置。加热器5还可以配置在直接对稀释液容器4和混合室6a加温的位置。

温度传感器11是用于测定稀释试样在DC检测器7的温度的传感器。温度传感器11最好配置在靠近DC检测器7的位置，以便更准确地测定稀释试样在DC检测器7的温度。在此，本实施方式测定单元2的温度传感器11配置在测定从DC检测器7流过后的稀释试样温度的位置上。温度传感器11也可以配置在测定稀释试样进入DC检测器7前的温度的位置上。温度传感器11还可以配置在测定稀释试样在后述DC检测器7流动室71中的温度的位置。

温度传感器10是测定自动血液分析仪1周围温度的传感器。因此，温度传感器10最好配置在不易受加热器5和电机6e等产生的热量影响的地方。在此，测定单元2的温度传感器10配置在测定单元2内。温度传感器10也可以配置在测定单元2外。

DC检测器7有流动室71，稀释试样从混合室6a运送到此流动室71。图3为DC检测器7流动室71的简要结构图。流动室71有用于向流动室供样的样嘴72、有微孔的孔73、回收通过孔73的稀释试样的回收管74、负电极77和正电极78。在流动室71，样嘴72配置在孔73前面，中心相对。稀释试样一从样嘴72挤出，便在前鞘液75的包裹下流过孔73的中央。稀释试样流过孔73后，在后鞘液76的包裹下送入回收管74。在此，负电极77和正电极78之间流动着直流电。随着稀释试样所含血细胞通过孔73产生的电阻变化，直流电的脉冲信号发生改变。即，DC检测器7能够将稀释试样所含血细胞作为脉冲信号的变化来检测。根据此DC检测器7获得的脉冲信号，数据处理装置通过鞘流DC检测法和红细胞脉冲峰值检测法计算出红细胞数(RBC)和红细胞压积值(HCT)。更具体而言，RBC根据脉冲信号的脉冲数算出，HCT根据脉冲信号脉冲高度算出。

通信接口13比如可以是RS-232C接口、USB接口和Ethernet(注册商标)接口。通信接口13可与数据处理单元3之间进行数据传输。通信接口13与控制器12之间通过电路连接，可以与控制器12进行数据传输。

控制器12由CPU、ROM、RAM等构成。控制器12通过电路14与测定单元2的各部分连接，控制其动作和进行数据传输。比如，控制器12通过对供样器6的电机6e进行控制，来控制液体在流路9中的流动。控制器12从温度传感器11、温度传感器10和DC检测器7等接收数据，传送至通信接口13。控制器12还将通信接口13从数据处理单元3收到的信息传送到测定单元2的各部分。

数据处理单元3如图2所示，由具备键盘和鼠标等的输入设备36、显示器37和数据处理器38的计算机构成。数据处理器38由CPU31、ROM32、RAM33、硬盘34和通信接口35构成。数据处理单元3的硬盘34装有应用程序。此应用程序包括操作系统和分析处理从测定单元2接收的测定数据的程序。

在此，在本实施方式中，数据处理单元3的CPU31通过运行该应用程序，分析处理测定数据，计算红细胞数(RBC)、红细胞压积(HCT)和平均红细胞容积(MCV)。

通信接口35比如可以是RS-232C接口、USB接口和Ethernet(注册商标)接口。通信接口35可与测定单元2之间进行数据传输。

图4为图1和图2所示自动血液分析仪1进行试样分析处理的流程图。下面参照图4就自动血液分析仪1进行的试样分析处理进行说明。

首先，启动自动血液分析仪1，进行应用程序等的初始化设定。然后，在步骤S1，数据处理单元3的CPU31判断是否收到用户的开始测定的指示。在收到开始测定的指示之前，此判断反复进行。当有测定开始指示时，在步骤S2，数据处理单元3向测定单元2发送测定开始指示信号。

在步骤S21，测定单元2的控制器12判断是否收到测定开始指示信号，并反复进行此判断，直至收到测定开始指示信号。测定单元2收到测定开始指示信号后，在步骤S22，吸移管6c从采血管吸移血样。

在步骤S23，供样器6制备稀释试样。具体而言，将从稀释液容器4量取(比如2.0ml)的稀释液和吸移管6c从采血管吸移的一定量血样(比如4μL)供应到混合室6a，进行搅拌。稀释液在从稀释液容器4向混合室6a流动的流路9中由加热器5进行加温。以此制备一定量(比如2.0ml)已加热的稀释试样。在步骤S24，混合室6a的部分(比如1ml)稀释试样与鞘液(稀释液)一起运往DC检测器7。于是，稀释试样中所含血细胞从DC检测器7的流动室71中的孔73通过。测定表示血细胞通过孔73所产生的负电极77和正电极78之间的直流电电阻变化的脉冲信号。

在步骤S25，由温度传感器11测定通过DC检测器7的稀释试样的温度(测定温度)。设定加热器5，使用于制备稀释试样的稀释液加热到测定温度为23℃以上。

在步骤S26，各检测器件测定的包括脉冲信号和测定温度在内的测定数据从测定单元2传送到数据处理单元3。

数据处理单元3在步骤S3判断是否收到测定单元2传送的测定数据。此判断一直进行到收到测定数据为止。收到测定数据后，在步骤S4，CPU31根据在步骤S24测定的脉冲信号计算红细胞数(RBC)和红细胞压积值(HCT)。

在步骤S5，CPU31根据红细胞数(RBC)和红细胞压积值(HCT)，用下列式(1)算出平均红细胞容积(MCV)。

MCV＝(HCT/RBC)×1000…(1)

在以上式(1)中，MCV为平均红细胞容积(fL)，HCT为红细胞压积值(％)，RBC为红细胞数(×104/μL)。

在步骤S6，CPU31根据平均红细胞容积(MCV)和测定温度，用以下式(2)算出MCV的校正值。

校正MCV＝MCV×(1+0.048×(23-测定温度))…(2)

用上述式(2)求出的校正MCV为由测定温度引起的误差小的MCV。

在步骤S7，如上算出的红细胞数(RBC)、红细胞压积值(HCT)、平均红细胞容积(MCV)及经校正的MCV等计算结果输出到显示器37。

在步骤S8，判断用户有无下达关机指示。如无关机指示，则返回步骤S1。如有关机指示，则数据处理单元3停止在自动血液分析仪1的试样分析处理作业。测定单元2在步骤S26将测定数据传送至数据处理单元3后，在步骤S27判断用户有无下达关机指示。如无关机指示，则返回步骤S21。如有关机指示，则停止测定单元2在自动血液分析仪1的试样分析处理作业。

在本实施方式中，用温度传感器11测定的稀释液温度(测定温度)算出MCV的校正值。本发明不限于此，也可以用温度传感器10测定的自动血液分析仪1周围的温度(环境温度)算出MCV的校正值。还可以用测定温度和环境温度二者来计算MCV的校正值。

下面举例详细说明本发明，但本发明不限于此。

实施例

<实施例1>

(血样稀释用试剂的制备)

在作为血样稀释用试剂的希森美康公司制的1L CELLPACK中添加2.20g氯化钠。再在添加了氯化钠的CELLPACK中，加羟基值不同的聚氧乙烯油基醚，使浓度达到0.015重量％，制备试剂A～E。

用于制备试剂A～E的聚氧乙烯油基醚的羟基值如下：

试剂A：羟基值49.0的聚氧乙烯油基醚

试剂B：羟基值51.0的聚氧乙烯油基醚

试剂C：羟基值53.6的聚氧乙烯油基醚

试剂D：羟基值54.8的聚氧乙烯油基醚

试剂E：羟基值57.1的聚氧乙烯油基醚

(MCV测定)

分别用试剂A～E将3个正常新鲜血样本稀释到500倍，制备测定试样。用制备的测定试样，使用自动血液分析仪XE-2100(希森美康公司制)改变测定温度测定MCV。自动血液分析仪XE-2100没有控制测定试样温度的加热器。因此，通过改变仪器周围的温度(环境温度)调整测定温度。求3个正常新鲜血样本的MCV测定值的平均值作为测定值。以试剂A～E各试剂为血样稀释用试剂时测定温度与MCV测定值的关系如图5所示。

从图5可以看出，当以试剂A和试剂B为血样稀释用试剂时，转折点温度高于20℃。与此相反，当以试剂C、试剂D和试剂E为血样稀释用试剂时，转折点温度在20℃以下。

由此得知，使用含有羟基值至少在53.6以上的聚氧乙烯油基醚的血样稀释用试剂时，只要测定温度为20℃以上，不进行复杂的校正也可以用自动血液分析仪测定血样的MCV。

<实施例2>

(血样稀释用试剂的制备)

在作为血样稀释用试剂的希森美康公司制CELLPACK(II)中添加以1∶3比例混合聚氧乙烯(20)油基醚和聚氧乙烯(16)油基醚生成的混合物，使浓度达到0.015重量％，制备羟基值54的血样稀释用试剂。

(MCV测定及其测定值的校正)

分别用羟基值54的血样稀释用试剂将3个正常新鲜血样本稀释到500倍，制备测定试样。用制备的测定试样，使用自动血液分析仪XE-2100(希森美康公司制)以环境温度测定MCV的测定结果在图6用黑方块(■)表示。

使用自动血液分析仪XE-2100C(希森美康公司制)将测定温度控制在为23℃以上测定MCV，其结果用图6的黑圆(●)表示。自动血液分析仪XE-2100C是在自动血液分析仪XE-2100上配备了对血样稀释用试剂进行加热的加热器的仪器。更具体地说，自动血液分析仪XE-2100C与图2所示自动血液分析仪1一样，在连接装血样稀释用试剂的稀释液容器和样阀的流路中配置有加热器。

通过用上述加热器对血样稀释用试剂进行加热，使测定试样的测定温度控制在为23℃以上，并以测定温度用上述式(2)校正MCV的测定结果，其校正MCV用图6的白圆(○)表示。

求出3个正常新鲜血样本的MCV测定值的平均值，以此平均值为测定值。

图6表明，用羟基值54的血样稀释用试剂，将测定温度控制在23℃以上，可以使MCV的测定值单向增加。因此，仅用式(2)所示简单的一次式即可准确地校正MCV的测定值。

前述的详细说明及附图是通过文字解释和图示来进行的，其目的不在于限定权利要求的保护范围。本说明书中的具体实施方式的各个变种对于普通技术人员来说显而易见，并处于权利要求及其等同技术的保护范围内。