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法律状态信息
法律状态
2014-04-16
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07D225/06 授权公告日:20120215 终止日期:20130304 申请日:20100304
专利权的终止
2012-02-15
授权
授权
2010-09-22
实质审查的生效 IPC(主分类):C07D225/06 申请日:20100304
实质审查的生效
2010-08-04
公开
公开
技术领域：
本发明涉及一种格尔德霉素生物合成类似物的鉴别及其制备方法。
背景技术：
吸水链霉菌17997(Streptomyces hygrocopicus 17997)是中国医学科学院医药生物技术研究所从我国土壤中分离到的格尔德霉素(geldanamycin，Gdm)产生菌。Gdm具有抗原虫、抗肿瘤、抗病毒以及免疫抑制等多种生物学活性[Sasaki K et al.J Antibiot(Tokyo)，1979，32(8)：849-51]；[陶佩珍等，中国抗生素杂志，1997，22：368-372]。
Gdm的特异性作用靶点是人热休克蛋白90(heat shock protein90，Hsp90)，Hsp90是许多信号蛋白的伴侣分子。Gdm通过对Hsp90的抑制，可以间接影响人体细胞内信号蛋白的功能，因此有望成为一种颇具潜力的抗肿瘤和抗病毒药物。但是，Gdm具有毒性大、水溶性小、光稳定性差等缺点。毒性大会限制其使用剂量，水溶性小会减少其生物利用度，光稳定性差会对其制造加工和保存带来不利影响；这些缺陷将会限制其开发成为有效药物。所以，寻找一种毒性低、水溶性好、光稳定性高的衍生物，已成为其研究的主要目标之一。目前，已有两个在Gdm的C17位进行取代的衍生物17-AAG和17-DMAG，正在美国进行II期和I期临床试验[Goetz MP et al.J Clin Oncol，2005，23(6)：1078-1087]；[Glaze ER et al.Cancer Chemother Pharmacol，2005，56(6)：637-647]。
链霉菌次级代谢产物由于具有复杂的生物合成机制，导致其通常具有复杂的化学结构，难以化学全合成或其成本高。与此同时，链霉菌次级代谢产物生物合成途径中的某些步骤对底物的特异性有限，或生物合成途径本身具有分支或交叉，造成微生物次级代谢产物常为一组结构类似的化合物；这种形成抗生素多组分的现象，在链霉菌次级代谢产物中比较普遍。例如，十四元大环内酯类抗生素红霉素具有A、B、C、D、E和F六个结构类似物(组分)，其中A是主要组分，抗菌活性较高而毒性又较小。对于多组分抗生素，不同组分之间往往呈现不同大小的生物活性和毒性，或者不同组分具有不同的生物学活性。因此，对抗生素的生物合成类似物(不同组分)进行研究，不仅可以对抗生素的生物合成机制有深入的了解，而且对新抗生素的研制与开发具有重要的实际意义。
Gdm属于苯(醌型)安莎类抗生素。在微生物次级代谢产物中，属于苯安莎类抗生素的还有大贝菌素(macbecin)、除莠霉素(herbimyicn)和安丝菌素(ansamitocin)等，它们与Gdm具有类似的化学结构。大贝菌素、除莠霉素和安丝菌素均已发现具有多个生物合成类似物，特别是安丝菌素的生物合成类似物数量较多。在Gdm产生菌中，已经报道了4，5-双氢格尔德霉素和氢醌型格尔德霉素等Gdm生物合成类似物[Lee D et al.Chembiochem，2006，7(2)：246-248.]。
李永海等通过阻断吸水链霉菌17997中的Gdm生物合成基因-氨甲酰基转移酶基因(gdmN)，从gdmN基因阻断变株中获得了一种新的Gdm生物合成衍生物4，5-双氢-7-O-脱氨甲酰基-7-羟基-19-O-甘氨酰格尔德霉素
(4，5-dihydro-7-O-descarbamoyl-7-hydroxy-19-O-glycylgeldanamycin，简称Gdm-CT-1-1)；此外，吸水链霉菌17997中的Gdm生物合成基因-聚酮合酶基因阻断变株(GDM-pks-)还可将Gdm-CT-1-1转化为7-O-脱氨甲酰基-7-羟基-19-O-甘氨酰格尔德霉
(7-O-descarbamoyl-7-hydroxy-19-O-glycylgeldanamycin，简称Gdm-CT-1-2)[Yonghai Li et al.J Antibiot(Tokyo)，2008，61(6)：347-355)]。
迄今为止，尚未见有国内外从Gdm产生菌中发现并得到19-O-甘氨酰格尔德霉素(Gdm-CT-1-3)的相关报道。
本发明的目的是，从吸水链霉菌17997中分离鉴定一种新的格尔德霉素生物合成衍生物。
发明内容：
本发明提供一种从Gdm产生菌吸水链霉菌17997中获得Gdm生物合成新类似物19-O-甘氨酰格尔德霉素(19-O-glycylgeldanamycin，简称Gdm-CT-1-3)，化学结构如式(1)所示。
研究表明，Gdm-CT-1-3具有特定的抗病毒等生物学活性。更重要的是，Gdm-CT-1-3的水溶性和光稳定性比Gdm均有明显的提高。
本发明还提供了Gdm-CT-1-3的制备方法，具体包括：
1、吸水链霉菌17997的发酵及Gdm-CT-1-3的检测
将新鲜的吸水链霉菌17997平板或斜面培养物，挖块接种于液体发酵培养基(淀粉2％，棉子饼粉0.5％，葡萄糖0.5％，玉米浆1.0％，酵母粉0.5％，CaCO3 0.2％)中，经28℃振荡培养4-5d，取发酵液少量，离心，上清液用乙酸乙酯提取后浓缩，进行硅胶板TLC(展层剂为乙酸乙酯-二氯甲烷-正己烷-甲醇，9∶6∶6∶1-2.5)，用2.0mol/L NaOH喷涂硅胶板显色，显示Rf为0.1的棕色条带为Gdm-CT-1-3。
2、Gdm-CT-1-3的提取制备
吸水链霉菌17997的发酵培养物上清液，用等体积乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液，经旋转蒸发浓缩获得粗品，利用硅胶柱和石油醚-乙酸乙酯混和液进行洗脱，分部收集，以TLC或HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得Gdm-CT-1-3纯品。
3、Gdm-CT-1-3的结构鉴定
用高分辨质谱确定Gdm-CT-1-3的分子量和分子式，经1H-和13C-NMR分析，并通过化学结构解析，确定Gdm-CT-1-3的结构为19-O-甘氨酰格尔德霉素。
Gdm-CT-1-3的水溶性和光稳定性检测结果表明，Gdm-CT-1-3的水溶性比Gdm提高了约1000多倍，光稳定性比Gdm有显著提高。
本发明还提供了Gdm-CT-1-3的生物学活性实验研究，结果表明，Gdm-CT-1-3具有特定的抗病毒作用。
发明效果：
本发明从Gdm产生菌吸水链霉菌17997的发酵培养物中发现了一种新的Gdm生物合成类似物，经分离纯化、结构解析，确证其为在Gdm的C19位进行O-甘氨酰修饰的新化合物19-O-甘氨酰格尔德霉素(Gdm-CT-1-3)。Gdm-CT-1-3具有特定的抗病毒等活性；Gdm-CT-1-3的水溶性和光稳定性相对于Gdm均有很明显的提高；Gdm-CT-1-3有望用于研制抗病毒药物或其先导化合物。
附图说明
图1Gdm-CT-1-3的1H-NMR图谱
图2Gdm-CT-1-3的13C-NMR图谱
图3Gdm的光稳定性
图4Gdm-CT-1-3的光稳定性
实施方案：
以下所列实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>吸水链霉菌17997的发酵培养
取新鲜的吸水链霉菌17997斜面(培养基组成为：yeast extract0.4％，malt extract 1.0％，葡萄糖0.4％，琼脂粉1.5％)，挖块接种于液体种子培养基(葡萄糖0.5％，酵母提取物0.4％，玉米浆0.5％，棉子饼粉0.25％，KH2PO4 0.05％，MgSO4 0.05％，CaCO3 0.3％)中，28℃振荡(100-300r/min)，培养24-48h；5％-20％转种量接种于液体发酵培养基(淀粉2％，棉子饼粉0.5％，葡萄糖0.5％，玉米浆1.0％，酵母粉0.5％，CaCO3 0.2％)，28℃继续振荡培养，至80-120h，将所获发酵培养液离心，弃菌体，留上清液用于检测和分离提取Gdm-CT-1-3。
<实施例2>吸水链霉菌17997发酵培养物中Gdm-CT-1-3的检测
实施例1中所得上清液，用等体积乙酸乙酯提取后，溶于一定体积乙酸乙酯中，点样于TLC硅胶板上，在乙酸乙酯∶二氯甲烷∶正己烷∶甲醇(9∶6∶6∶2.5)溶媒系统中展层；用少量NaOH(2.0mol/L)溶液喷涂，在硅胶板上可观察到一条Rf值为0.1的棕色条带，为Gdm-CT-1-3。
<实施例3>Gdm-CT-1-3的分离纯化与制备
实施例1中所得发酵上清液，用等体积乙酸乙酯提取，旋转蒸发浓缩后上硅胶柱，以石油醚∶乙酸乙酯(二者的体积比为10∶0至10∶90)进行梯度洗脱，分部收集洗脱液，经TLC硅胶板检测后，合并含有Gdm-CT-1-3的部分，旋转蒸发浓缩后，经Sephadex LH-20柱层析分离，洗脱溶剂为甲醇，分部收集洗脱液，经TLC硅胶板检测后，合并含有Gdm-CT-1-3的部分，旋转蒸发浓缩后，进行反相HPLC(ODS-C18柱，150mm×20mm，流动相为甲醇∶水(14∶11)，流速为2-5ml/min，收集合并含有Gdm-CT-1-3的洗脱液，旋转蒸发浓缩，得Gdm-CT-1-3纯品。
<实施例4>Gdm-CT-1-3结构的确定
Gdm-CT-1-3纯品经高分辨质谱分析，确定其分子量为656.27953(含Na+)，分子式为C31H43O10N3(不含Na+)。1H-和13C-NMR数据见表1，NMR图谱见图1和图2。结合Gdm-CT-1-3的DEPT、HMQC和HMBC谱图，其化学结构解析为19-O-甘氨酰格尔德霉素(式1)。
<实施例5>Gdm-CT-1-3的水溶性和光稳定性测定
水溶性测定：分别将过量的Gdm-CT-1-3和Gdm溶于纯水中，在室温(25℃)、闭光条件下搅拌12h，高速离心后，用HPLC方法测定上清液中Gdm-CT-1-3和Gdm的含量，计算出其溶解度。结果表明：Gdm-CT-1-3的溶解度为1.165mg/ml，而Gdm的溶解度小于1μg/ml。结果表明，Gdm-CT-1-3比Gdm的水溶性高1000多倍。
光稳定性测定：将适量Gdm-CT-1-3溶于甲醇∶水(1∶1，体积比)中，浓度为100μg/ml，体积0.8ml。将适量Gdm溶于甲醇∶水(1∶3，体积比)中，浓度为72μg/ml，体积0.8ml。将二者分别置于相同的玻璃瓶中接受光照(光照强度为40001x)，在不同时间(如20、40、60、80、100min)取样，用HPLC测定样品中Gdm-CT-1-3和Gdm的含量。以0min检测的含量作为100％，分别计算光照不同时间后的含量，结果表明，在光照强度为40001x、光照时间为100min时，Gdm降解约1/3(图3)，而Gdm-CT-1-3没有降解(图4)。
<实施例6>Gdm-CT-1-3的抗病毒活性测定
将一定量的宿主细胞(例如2×104个Vero细胞)0.1ml，接种到96孔微量塑料培养板，37℃、5％CO2培养1-2天，生长成单层细胞。弃生长液，用10-100TCID50病毒(单纯疱疹病毒I型)悬液感染宿主细胞(0.1ml)，37℃吸附1-2小时，弃病毒液，再加入含有不同浓度(0.01-100μg/ml)Gdm-CT-1-3的维持液，每个浓度加2-3孔，37℃继续培养。每日在倒置显微镜下检查并记录细胞病变，对不同浓度Gdm-CT-1-3的抗病毒活性进行测定。结果显示：采用HSV-IVR733感染Vero细胞株测定，Gdm-CT-1-3的抗病毒活性IC50＝0.051μg/ml；Gdm的抗病毒活性IC50＝0.082μg/ml，两者基本相当。
表1Gdm-CT-1-3(溶于CD3OD)的NMR数据
机译： 五痛肽：脑啡肽类似物-包含酪氨酰-甘氨酰-甘氨酰-苯丙氨酰-D-赖氨酸
机译： 甘氨酰脯氨酰谷氨酸的类似物
机译： 甘氨酰脯氨酰谷氨酸类似物
