鼠疫耶尔森菌检测用引物组、快速诊断试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及鼠疫耶尔森菌的生物学鉴定，具体涉及一种鼠疫耶尔森菌检测用引物组、快速诊断试剂盒和检测方法。

背景技术

耶尔森菌属(Yersinia)现归入肠杆菌科，原系动物感染性疾病的病原菌，人通过接触感染动物或污染食物而患病。目前耶尔森菌属大致分为鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森菌(Y.pseudotuberculosis)，小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)及中间耶尔森菌(Y.intermedia)，前3种对人类有较强致病性。其中，鼠疫耶尔森菌引起的是啮齿动物中的自然疫源性疾病，传染性强，病死率高，易酿成大流行。

目前对鼠疫耶尔森菌有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和血清学鉴定为主的国家标准(GB/T 18936-2003)，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法(GB/T 22287-2008)，其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。

以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。

等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性，LAMP主要是利用4种不同的特异性引物(引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP)识别靶基因的6个特定区段，在聚合酶和等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，扩增反应结束后，通常是采用染色剂对反应产物进行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都选用具有链置换特性的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶。对LAMP来说，4种特异性引物的设计是其关键所在。

LAMP因其自身的优点，现已被用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断，如：严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)的检测、分支杆菌属检测、腺病毒性结膜炎检测、真菌检测等，现尚未见有LAMP用于甲型肝炎病毒检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于环介导等温扩增技术检测鼠疫耶尔森菌的高特异性引物组。

本发明的另一个目的在于提供由上述引物组及其他LAMP反应成分组成的可快速、高效、特异性检测鼠疫耶尔森菌的快速诊断试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供上述快速诊断试剂盒的检测方法。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一、本发明的鼠疫耶尔森菌检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的鼠疫耶尔森菌基因序列，选取鼠疫耶尔森菌基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别鼠疫耶尔森菌的特异性引物组，通过PCR来鉴定鼠疫耶尔森菌基因，该引物组由如下四条引物组成：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

二、本发明的快速诊断试剂盒，是由上述引物组、Bst DNA聚合酶、样品预处理液、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中，其中：

所述反应液的配方为：含有1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L氯化钾、10～12.5mmol/L硫酸铵、8～10mmol/L硫酸镁、0.01～0.04mol/L TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L；

上述反应液配方的优选方案为：含有2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12.5mmol/L氯化钾、12.5mmol/L硫酸铵、10mmol/L硫酸镁、0.04mol/LTritonX-100、1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。

所述样品预处理配方为：含有10～20mmol/L pH8.0的Tris-HCl、1～2mmol/L EDTA和0.01～0.04mol/L Triton X-100。

上述样品预处理液的优选配方为：含有20mmol/L pH8.0的Tris-HCl、2mmol/L EDTA和0.04mol/L Triton X-100。

所述阳性对照为鼠疫耶尔森菌基因组DNA。

所述显色液可选择任何一种常用的荧光染料，优选SYBR Green I或EvaGreen。

所述稳定液可选择任何一种常用的稳定液，优选石蜡油。

本发明试剂盒中所用到的Bst DNA聚合酶、荧光染料以及各种溶剂均为市售。

三、本发明快速诊断试剂盒的生产工艺，包括如下步骤：

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液无菌分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

四、本发明快速诊断试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

1、样品处理

将待测样品按国际标准(GB/T4789.8-2003)增菌后，取增菌悬液于离心管中离心，去上清，沉淀中加入样品预处理液并混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心后，上清即为样品模板DNA；

2、环介导等温扩增技术反应过程

在反应管中加入反应液38～40体积％，Bst DNA聚合酶大片段0.9～1.8体积％，稳定液52～54.5体积％，样品模板DNA4.5～9体积％，恒温反应。所述体积百分比是指占反应总体系的体积百分比。

上述环介导等温扩增反应的反应条件可采用本领域人员操作环介导等温扩增反应时的常规反应条件，优选恒温反应温度为63～65℃，恒温反应时间为45～90min。

3、反应后处理

在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.引物设计是LAMP技术的关键所在，对于引物设计有许多的要求，如各个引物之间的距离、Tm值以及引物末端稳定性等，因此从200～300个碱基的靶序列中设计四条符合要求的引物存在很大的难度，而本发明根据靶基因序列设计了一种诺如病毒检测用引物组，能特异性识别靶序列上的六个独立区域，在Bst DNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大改善了诺如病毒检测的特异性；

2.采用本发明的引物组对鼠疫耶尔森菌进行检测，因为高特异性，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，从而能够进行鼠疫耶尔森菌的定型检测；

3.本发明的快速诊断试剂盒是利用环介导等温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森菌，检测灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；

4.本发明的快速诊断试剂盒是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成LAMP反应，不但反应条件温和，而且所需仪器简单，也不需要特殊试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；

5.本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；

6.本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；

7.本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；

8.目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天；而采用本发明的快速诊断试剂盒仅需2小时，而且其在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上也相当于或优于传统检测技术。

附图说明

图1为实施例3中特异度试验结果图；

其中，1～26为非鼠疫菌，27为鼠疫杆菌EV001，28为27种细菌DNA的混合；

图2为实施例3中灵敏度试验结果图；

其中，0为鼠疫杆菌细菌原液，1～12分别为10^-1～10^-12这12个浓度级；

图3为实施例3中灵敏度试验电泳结果图；

其中，M为marker，0为鼠疫杆菌细菌原液，1～12分别为10^-1～10^-12这12个浓度级。