法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-06-12
授权
授权
2011-01-05
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20100402
实质审查的生效
2010-11-24
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种预测病理性近视易感性的方法及试剂，更具体地说是通过测定单核苷酸多态性位点rs2073135(BAI3基因，G→A)、rs4697489(CCDC149基因，C→T)、rs248014(A→G)、rs1105191(T→C)、rs1943049(G→A)以及rs7035322(TNC基因，C→A)预测受试者对于病理性近视的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物技术领域。
背景技术
病理性近视(pathological myopia，PM)是指患者屈光度在-6.0D以上、通常眼轴长度大于26毫米，近视度数持续加深，且常伴发眼后极部的变形改变，包括巩膜变薄、脉络膜萎缩变薄及眼轴的增长，可伴有弱视、青光眼、白内障、玻璃体混浊、视网膜脱离等多种并发症的眼病，是严重影响视力健康乃至生存质量的一种重要疾病，也是致盲的主要原因之一。
随着现代社会的文明化进程，近视的发病率急剧上升，已经成为目前世界上发病率最高的一种眼病，WHO已把它列入亟待解决的可致盲性眼病之一。病理性近视在总体人群的发病率为1.7％-2.1％，占近视人群的27％～33％。PM存在种族差异，黄种人患病率高，白种人患病率较低。目前，我国的近视发病率为33％，是世界平均水平22％的1.5倍，近视总人数已近4亿，其中PM超过200万人。2006年调查显示我国学生近视发病率为50-60％，仅次于新加坡居世界第2位，学生近视人数居世界首位，视力下降直接影响孩子的升学、就业，并对其生理、心理造成不同程度的妨碍。
病理性近视严重影响人类生活质量，不幸的是到目前为止对于PM的治疗还非常有限。光学矫正如戴眼镜或接触镜矫正近视眼的屈光缺陷，虽然有助于暂时恢复正常或接近正常的视力，却不能有效地控制近视进展；针对PM黄斑病变所采用的玻璃体手术与激光治疗，以及通过手术控制眼轴延长延缓眼底病变出现的时间并减轻其病变程度，是临床上最常采用的干预方法，这些治疗手段能使术后视力提高或保持稳定，屈光度稳定或减少，眼轴增长趋于缓慢，对功能性改变有轻度改善作用，但这些治疗并不能对所有患者有效，且手术存在一定的风险性，手术并发症主要有术后视网膜脱离和涡静脉、睫状动脉损伤，其远期效果也还尚待考证。另外有报道通过药物控制眼轴增长和PM的病理改变，但仍处于实验阶段，还有待进一步研究。由于缺乏有效的PM预防手段及治疗药物和方法，因此，对PM进行研究，探讨其病理生理机制，以期从源头上对其进行防治显得意义深远。
病理性近视的发病主要受遗传因素和环境因素的影响，环境因素包括近距离作业、阅读习惯、惯用灯光、经常使用计算机、营养和疾病等，但环境因素作用程度报道不一。不同民族PM发病率不同，PM有明显家族聚集倾向。Gwiazda等研究发现父母近视子女患近视的危险性要比父母非近视子女大。Guggenheim等通过计算近视遗传度显示：PM同胞之间患病的危险度为20，而单纯性近视的危险度仅为1.5。表明PM的发病有非常明显的遗传因素作用。甚至有学者认为PM就是单纯的遗传性疾病。
随着国内外学者对近视的遗传学研究进一步深入，应用全基因组扫描和候选基因筛查、连锁分析等技术进行近视的基因定位和候选基因的克隆筛查工作，已发现了多个近视的遗传连锁位点，定位于xq28(MYP1，OMIM 310460)，18p11.31(MYP2，OMIM 160700)，12q21-23(MYP3，OMIM 603221)，7q36(MYP4，OMIM 608367)，17q21-q23(MYP5，OMIM 608474)，22q12(MYP6，OMIM 608908)，11p13(MYP7，OMIM 609256)，3q26(MYP8，OMIM 609257)，4q12(MYP9，OMIM 609258)，8p23(MYP10，OMIM 609259)，4q22-q27(MYP11，OMIM 609994)，2q37.1(MYP12，OMIM 609994)，xq23-25(MYP13，OMIM300613)，1p36(MYP14，OMIM 0320)，7p15.3，10q21.1，15q12-13。目前已肯定的PM基因位点有6个，包括MYP1、MYP2、MYP3、MYP4、MYP5和MYP11；已明确染色体定位，尚待基因位点命名的有7p15.3，10q21.1，15q12-13。通过对PM疾病基因的相关性验证，主要包括PAX6、TGIF、DSPG3、COL2A1、FBN1等大约16个PM候选基因进行了筛查。但是，迄今为止仍然没有找到明确的PM致病基因。而我国病理性近视基因位点与国外报道不同，存在遗传异质性，其遗传模式可能不是单一的单基因常染色体显性遗传。因此，目前更倾向于认为病理性近视可能是一个多基因疾病。
未来病理性近视治疗的发展趋势应该是寻求切实有效、疗效持久的治疗，以求更长久地保存患者有用的视功能。应在PM高危人群中进行早期的筛检，对其眼底病变尽早发现、正确诊断、及时治疗、预防病变发展。目前迫切需要找到一些更加有效的遗传标记物和检测方法，可以早期筛选发现PM高危人群，并实施早期检测和预防，减少其视力损害。
发明内容
本发明首先提供BAI3基因rs2073135变异、CCDC149基因rs4697489变异、rs248014变异、rs1105191变异、rs1943049变异或/和TNC基因rs7035322变异在制备用于病理性近视筛查试剂中的应用。
本发明通过检测待测样本的个体中是否存在BAI3基因rs2073135 G→A变异、CCDC149基因rs4697489 C→T变异、rs248014 A→G变异、rs1105191T→C变异、rs1943049 G→A变异或/和TNC基因rs7035322 C→A变异，而在早期筛查病理性近视的发生，进而为临床诊断和治疗提供参考。
发明人在研究中发现，在中国人中，只要上述六个位点之一发生变异，均不同程度地增加了病理性近视的患病风险，证明该六个位点变异与病理性近视直接相关。
因而，本发明所述筛查试剂包括检测BAI3基因rs2073135 G→A变异、CCDC149基因rs4697489 C→T变异、rs248014 A→G变异、rs1105191 T→C变异、rs1943049 G→A变异或/和TNC基因rs7035322 C→A变异的试剂；以及任选的用于扩增包含BAI3基因rs2073135、CCDC149基因rs4697489、rs248014、rs1105191、rs1943049或/和TNC基因rs7035322基因片断的试剂。
所述检测BAI3基因rs2073135 G→A变异、CCDC149基因rs4697489 C→T变异、rs248014 A→G变异、rs1105191 T→C变异、rs1943049 G→A变异或/和TNC基因rs7035322 C→A变异的试剂为测序用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂或者Snapshot试剂。
根据本发明的另一方面，还提供一种包含上述筛查试剂的用于检测病理性近视的试剂盒，包括任选的用于检测BAI3基因rs2073135变异、CCDC149基因rs4697489变异、rs248014变异、rs1105191变异、rs1943049变异或/和TNC基因rs7035322变异用于病理性近视筛查的相关试剂。
所述试剂盒包括检测BAI3基因rs2073135 G→A变异、CCDC149基因rs4697489 C→T变异、rs248014 A→G变异、rs1105191 T→C变异、rs1943049 G→A变异或/和TNC基因rs7035322 C→A变异的试剂；以及任选的用于扩增包含BAI3基因rs2073135、CCDC149基因rs4697489、rs248014、rs1105191、rs1943049或/和TNC基因rs7035322基因片断的试剂。
进一步的，所述检测BAI3基因rs2073135 G→A变异、CCDC149基因rs4697489 C→T变异、rs248014 A→G变异、rs1105191 T→C变异、rs1943049 G→A变异或/和TNC基因rs7035322 C→A变异的试剂为测序用试剂。
或者，上述试剂盒所述检测BAI3基因rs2073135 G→A变异、CCDC149基因rs4697489 C→T变异、rs248014 A→G变异、rs1105191 T→C变异、rs1943049 G→A变异或/和TNC基因rs7035322 C→A变异的试剂为限制性片段长度多态方法用试剂。
或者，上述试剂盒所述检测BAI3基因rs2073135 G→A变异、CCDC149基因rs4697489 C→T变异、rs248014 A→G变异、rs1105191 T→C变异、rs1943049 G→A变异或/和TNC基因rs7035322 C→A变异的试剂为Snapshot试剂。
通过上述试剂盒，可以预测病理性近视的患病风险。
在本发明中，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的rs2073135、rs4697489、rs248014、rs1105191、rs1943049以及rs7035322位点基因型，预测受试者对病理性近视的易感性：rs2073135位点的A等位基因增加病理性近视的患病风险1.463倍；rs4697489位点的T等位基因增加病理性近视的患病风险1.822倍；rs248014位点的A等位基因增加病理性近视的患病风险1.364倍；rs1105191位点的T等位基因增加病理性近视的患病风险1.745倍；rs1943049位点的A等位基因增加病理性近视的患病风险1.795倍；rs7035322位点的A等位基因增加病理性近视的患病风险1.420倍。
本发明提供了等位基因特异性的PCR引物对，具有引物对A-F所示的碱基序列，长度为18-20bp，而且可以特异性地扩增出序列1-6所示的扩增产物。
本发明还提供了等位基因特异性的Sanpshot引物，具有Snapshot引物A-F所示的碱基序列，长度为20-60bp，而且可以特异性地检测六个SNP位点的不同基因型。
本发明的试剂盒中含有本发明特异性扩增目的片段的PCR引物对和用于PCR扩增以及进行Sanpshot分型检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。
本发明的测定方法测定来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组DNA。
本发明首次阐明了上述多态性位点与病理性近视的相关性，提供了一种预测病理性近视易感性的方法，该方法可用于病理性近视的早期筛检、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
附图说明：
图1是Snapshot检测SNP rs2073135位点的基因分型图谱；
图2是Snapshot检测SNP rs4697489位点的基因分型图谱；
图3是Snapshot检测SNP rs248014位点的基因分型图谱；
图4是Snapshot检测SNP rs1105191位点的基因分型图谱；
图5是Snapshot检测SNP rs1943049位点的基因分型图谱；
图6是Snapshot检测SNP rs7035322位点的基因分型图谱；
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，以使公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制。
具体实施方式
用于下列实施例中表示试剂均为市售品，其英文缩写如下。
需要时，用高压锅(120℃，20分钟)灭菌
EDTA：乙二胺四乙酸二钠
SDS：十二烷基硫酸钠
TE：10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA(pH8.0)
dNTP：脱氧核苷三磷酸
实施例1样本收集和基因组DNA的提取
样本是由四川省医学科学院·四川省人民医院疾病基因研究四川省重点实验室承担的国家自然科学基金课题收集的病例。共计收集病理性近视患者289例，平均年龄35.7±9.7岁，其中男性占54.3％，对照543例(正常对照，入选标准为：40岁以上，长期从事近距离工作，屈光度＞-1.0D。)，平均年龄46.3±10.5岁，其中男性占55.6％。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。
根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4m1)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16μl和20μl，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至50ng/μl，置-20℃冰箱保存。
实施例2 包含rs2073135、rs4697489、rs248014、rs1105191、rs1943049以及rs7035322单核苷酸多态性DNA片段的PCR扩增和基因型分析
本发明采用Snapshot基因分型技术对rs2073135、rs4697489、rs248014、rs1105191、rs1943049以及rs7035322六个位点进行检测。采用以上所述的特异性PCR及Snapshot引物A-F分别按照上述相应的方法进行分型。
实验步骤如下：
1、PCR：95℃变性5分钟；95℃30秒、54℃退火30秒、72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟，4℃保温。
2、纯化1：PCR产物各取1-3μl(根据需混合的PCR个数而定，总量为9μl，加入混合液3μl(SAP 2μl，1∶10Exol酶1μl)。1∶10Exol酶的配制：1体积Exol酶，1体积SAP 10Xbuffer，8体积ddH2O。程序：37℃1h，75℃15min。
3、Snapshot 反应：Snapshot MULTIPLEX 1μl，purified PCR mix 1μl，Snapshot引物每个为0.2μl，DDH2O补足5μl。程序：96℃1分钟，96℃10秒，50℃5秒，60℃30秒，cycle to step 2 for 25 more times，12℃保温。
4、纯化2：每个反应加SAP 0.5-1.0μl，程序：37℃ 1小时，75℃ 15分钟，4℃保温。
5、1μl上述产物加9μl HD。程序：95℃，5分钟，迅速置于冰上，冷却后上机检测。
PCR引物对A(rs2073135)：
F：5’-AGCCTCATTTATTCATCTGT-3’
R：5’-GATTCTGGTGGTGAGTGAT-3’
PCR引物对B(rs4697489)：
F：5’-GGTTTGTAGCCCAGAAGTA-3’
R：5’-GTGTTCCCAACCATTAGTC-3’
PCR引物对C(rs248014)：
F：5’-TAAATGGGGAAATAGATG-3’
R：5’-ATAATGCTACAGAGATGAAC-3’
PCR引物对D(rs1105191)：
F：5’-TACTGGTGATCCCTGTGAC-3’
R：5’-TGTAAATCGGCTGTGACTC-3’
PCR引物对E(rs1943049)：
F：5’-GGCATCCTTGTCTTGTTC-3’
R：5’-GGGTTTTGTTCCAACTTCT-3’
PCR引物对F(rs7035322)：
F：5’-TGTTCCGTGATTCTTAGAC-3’
R：5’-GTATCTGGGTTCCTTTGAC-3’
所得到的扩增序列如下：
序列1(rs2073135)211bp：
AGCCTCATTTATTCATCTGTgggagacaaattctcctcacaaatttgctg
ttaagattagaggtaatgaatattaatgtttaacacatttttggtacata
tgaagagctcaataaacagctatttccacaaaagtttctatatcaccga
ctccactatcaccactatcatcccatcgtcatggccattaccATCACTCA
CCACCAGAATC
序列2(rs4697489)300bp：
GGTTTGTAGCCCAGAAGTAacaagccataccatgtagcctcgggatgcag
cggactataccatgtaggtttgtgtcagtacactctagtacagtcgcaca
atgatgaaattgcataacaaagcatttctcaggacatatccctgtcatta
agcaatgatgggtatagctaatagatggtaataagtagctgattatcat
tcactaatagtggctaactacagtacactaaacactttaaaagagacaca
aaactcccagaaaagaaagaaaagcagtttaGACTAATGGTTGGGAACAC
序列3(rs248014)334bp：
TAAATGGGGAAATAGATGttgggtatatttttaaaaagatgttcattata
tgaaataaggaagatttggaaaaagagaatggagaaaagtggttatgtag
aatttacttatgttttacctacatttgttgacaatttcttatttaatga
caaccccaagagataaatgcttatgttggataaagctgagaaaagggaaa
tgatctctaatatttacttcagagaaaatgtgcccacaggactaaattat
aatctaatctttcaagctttaggatgtttatattcataattatacactga
gaaaaatatgtatgGTTCATCTCTGTAGCATTAT
序列4(rs1105191)258bp：
TACTGGTGATCCCTGTGACcccagcccttgtgtacgatctgtcctggaaa
gtattatttaatttctgatgcaaatgtggcaatgcccttccatcagcaga
ggcaggcaaagctcccgagagtgaggaggagggatggtgttaccatggta
acgagatgaccagctgagtgtagatggagctaagcatctttctactgaag
aacaggagtagctatcttagcctctacttgtacctgagGAGTCACAGCC
GATTTACA
序列5(rs1943049)330bp：
GGCATCCTTGTCTTGTTCctaatcttagaggtccagtacttttaatggtg
acttggcaggtatgccaatgaattaaaaaagatttttgtggcagcctact
gaacactgccagagtaatgctatcactattaactttgtttgctgattct
ctaaagaagataaagtagttgacccaattatatcagcttctattttttct
cttaggtcttaggataaaataaccccttgaaaaatctttcctacccttct
ttctggcatgttatccttagaggagatgcgccaaggagaagctggttctg
ctcaggtggacAGAAGTTGGAACAAAACCC
序列6(rs7035322)217bp：
TGTTCCGTGATTCTTAGACaagaagcccattaacatgtactactatttgg
aaatctaatttgtaatttaatatattgaatttttgaagcatttcagtacc
attgctttgtgggtctcctcactcccaatccagcaagtgctgtgcacaa
acatttcaagactctgaggcattctaccgtcataatttggagcaagttGT
CAAAGGAACCCAGATAC
Snapshot引物A(rs2073135)：
5’-CTATTTCCACAAAAGTTTCT-3’
Snapshot引物B(rs4697489)：
5’-CAGGACATATCCCTGTCATTAAGCAATG-3’
Snapshot引物C(rs248014)：
5’-AAGAGAATGGAGAAAAGTGGTTATGTAGAATTTACT-3’
Snapshot引物D(rs1105191)：
5’-AGATGGAGCTAAGCATCTTTCTACTGAAGAACAGGAGTAGCTAT-3’
Snapshot引物E(rs1943049)：
5’-
AAAAAAGATTTTTGTGGCAGCCTACTGAACACTGCCAGAGTAATGCTAT
CAC-3’
Snapshot引物F(rs7035322)：
5’-
ATTGAATTTTTGAAGCATTTCAGTACCATTGCTTTGTGGGTCTCCTCACT
CCCAATCCAG-3’
图1～图6为Snapshot检测rs2073135、rs4697489、rs248014、rs1105191、rs1943049以及rs7035322的基因型图。
实施例3SNP位点与病理性近视的相关性
统计方法：利用SPSS13.0软件进行分析，检验Hardy-Weinberg平衡检测，数量变量采用t检验，质量变量采用卡方检验。双侧P＜0.05认为统计学的差异显著。
结果：
1)病例和对照的基本临床资料
注：**，P＜0.01。
2)SNP位点多态性与病理性近视密切相关
rs2073135：
在未考虑病理性近视传统危险因子的情况下，A等位基因可使病理性近视的危险性显著增加(OR＝1.463，95％CI＝1.192-1.797)，即病理性近视患病风险增加1.463倍；其中纯合子携带者(AA)会使患病风险增加1.607倍，杂合子(AG)增加患病风险1.241倍。见图1。
rs4697489：
在未考虑病理性近视传统危险因子的情况下，T等位基因可使病理性近视的危险性显著增加(OR＝1.822，95％CI＝1.474-2.252)，即病理性近视患病风险增加1.822倍；其中纯合子携带者(TT)会使患病风险增加3.307倍，杂合子(CT)增加患病风险1.139倍。见图2。
rs248014：
在未考虑病理性近视传统危险因子的情况下，A等位基因可使病理性近视的危险性显著增加(OR＝1.364，95％CI＝1.074-1.732)，即病理性近视患病风险增加1.364倍；其中纯合子携带者(AA)会使患病风险增加1.452倍，而杂合子(AG)不会增加患病风险。见图3。
rs1105191：
在未考虑病理性近视传统危险因子的情况下，T等位基因可使病理性近视的危险性显著增加(OR＝1.745，95％CI＝1.415-2.152)，即病理性近视患病风险增加1.745倍；其中纯合子携带者(TT)会使患病风险增加1.877倍，而杂合子(CT)不会增加患病风险。见图4。
rs1943049：
在未考虑病理性近视传统危险因子的情况下，A等位基因可使病理性近视的危险性显著增加(OR＝1.795，95％CI＝1.446-2.228)，即病理性近视患病风险增加1.795倍；其中纯合子携带者(AA)会使患病风险增加2.258倍，杂合子(AG)增加患病风险1.425倍。见图5。
rs7035322：
在未考虑病理性近视传统危险因子的情况下，A等位基因可使病理性近视的危险性显著增加(OR＝1.420，95％CI＝1.156-1.744)，即病理性近视患病风险增加1.420倍；其中纯合子携带者(AA)会使患病风险增加1.714倍，而杂合子(AC)不会增加患病风险。见图6。
实施例4检测试剂盒
本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：
PCR扩增试剂(50人份)：
Sanpshot分型检测试剂(50人份)
标准DNA样品：
使用方法：
1)DNA提取
取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。
2)通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段
PCR扩增(20μl体系)：
反应条件：
PCR产物检测：
用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。
3)Sanpshot分型检测
第一步：PCR产物纯化(12μl体系)：
反应条件：
1、37℃酶切 1小时
2、75℃灭活 15分钟
3、4℃保存
第二步：单碱基引物延伸反应(5μl)：
反应条件：
第三步：纯化反应物：
反应体系：0.7μl血清碱性磷酸酶/孔
反应条件：37℃1小时，75℃15分钟，4℃保存。
第四步：ABI遗传分析仪读取结果：
反应体系：纯化产物1μl+HD 9μl
反应条件：95℃5分钟，迅速冰浴冷却
ABI PRISM 3100DNA Sequencer上机读取基因型结果。
本试剂盒用于：1、病理性近视患者的早期诊断和分型参考；2、病理性近视易感人群的基因检测和风险评估。
1)本发明的检测方法可用于分析rs2073135、rs4697489、rs248014、rs1105191、rs1943049以及rs7035322六个SNP位点的多态性，应用在对病理性近视的辅助性诊断和对个体是否有多大的病理性近视患病风险进行评估，以利于开展病理性近视的早期干预和治疗。
2)利用本发明阐述的病理性近视易感基因/位点的多态性，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节这些基因表达的活性分子，促进新药开发。
3)本发明建立的检测SNP位点多态性的核酸序列和病理性近视相关基因/位点，可高灵敏度、特异性地应用于病理性近视基因诊断用的试剂盒。
如上所述，得出结论，rs2073135、rs4697489、rs248014、rs1105191、rs1943049以及rs7035322六个SNP位点的多态性与病理性近视具显著相关性。因此，根据本发明，测定其多态性可用于进行基因诊断。
本发明公开了病理性近视相关的新的易感基因/位点，并提供了这些位点在制备用于病理性近视筛查试剂中的应用以及包含这些试剂的试剂盒，本发明试剂盒灵敏度高，只需要少量DNA样品就足以测定所述位点的变异，达到早期筛查的目的。
PM检测试剂盒.ST25.txt
SEQUENCE LISTING
<110>四川省医学科学院(四川省人民医院)
<120>一种检测病理性近视的筛查试剂盒
<130>CD537-10P108122
<150>200910058834.7
<151>2009-04-03
<160>24
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>PCR引物对A(rs2073135)F
<400>1
agcctcattt attcatctgt 20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>PCR引物对A(rs2073135)R
<400>2
gattctggtg gtgagtgat 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>PCR引物对B(rs4697489)F
<400>3
ggtttgtagc ccagaagta 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>PCR引物对B(rs4697489)R
<400>4
gtgttcccaa ccattagtc 19
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>PCR引物对C(rs248014)F
<400>5
tactggtgat ccctgtgac 19
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>PCR引物对C(rs248014)R
<400>6
ataatgctac agagatgaac 20
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>PCR引物对D(rs1105191)F
<400>7
tactggtgat ccctgtgac 19
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>PCR引物对D(rs1105191)R
<400>8
tgtaaatcgg ctgtgactc 19
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>PCR引物对E(rs1943049)F
<400>9
ggcatccttg tcttgttc 18
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>PCR引物对E(rs1943049)R
<400>10
gggttttgtt ccaacttct 19
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>PCR引物对F(rs7035322)F
<400>11
tgttccgtga ttcttagac 19
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>PCR引物对F(rs7035322)R
<400>12
gtatctgggt tcctttgac 19
<210>13
<211>211
<212>DNA
<213>扩增的序列1(变异)
<400>13
agcctcattt attcatctgt gggagacaaa ttctcctcac aaatttgctg ttaagattag 60
aggtaatgaa tattaatgtt taacacattt ttggtacata tgaagagctc aataaacagc 120
tatttccaca aaagtttcta atatcaccga ctccactatc accactatca tcccatcgtc 180
atggccatta ccatcactca ccaccagaat c 211
<210>14
<211>300
<212>DNA
<213>扩增的序列2(变异)
<400>14
ggtttgtagc ccagaagtaa caagccatac catgtagcct cgggatgcag cggactatac 60
catgtaggtt tgtgtcagta cactctagta cagtcgcaca atgatgaaat tgcataacaa 120
agcatttctc aggacatatc cctgtcatta agcaatgtat gggtatagct aatagatggt 180
aataagtagc tgattatcat tcactaatag tggctaacta cagtacacta aacactttaa 240
aagagacaca aaactcccag aaaagaaaga aaagcagttt agactaatgg ttgggaacac 300
<210>15
<211>334
<212>DNA
<213>扩增的序列3(变异)
<400>15
taaatgggga aatagatgtt gggtatattt ttaaaaagat gttcattata tgaaataagg 60
aagatttgga aaaagagaat ggagaaaagt ggttatgtag aatttactgt atgttttacc 120
tacatttgtt gacaatttct tatttaatga caaccccaag agataaatgc ttatgttgga 180
taaagctgag aaaagggaaa tgatctctaa tatttacttc agagaaaatg tgcccacagg 240
actaaattat aatctaatct ttcaagcttt aggatgttta tattcataat tatacactga 300
gaaaaatatg tatggttcat ctctgtagca ttat 334
<210>16
<211>258
<212>DNA
<213>扩增的序列4(变异)
<400>16
tactggtgat ccctgtgacc ccagcccttg tgtacgatct gtcctggaaa gtattattta 60
atttctgatg caaatgtggc aatgcccttc catcagcaga ggcaggcaaa gctcccgaga 120
gtgaggagga gggatggtgt taccatggta acgagatgac cagctgagtg tagatggagc 180
taagcatctttctactgaag aacaggagta gctatcctta gcctctactt gtacctgagg 240
agtcacagcc gatttaca 258
<210>17
<211>330
<212>DNA
<213>扩增的序列5(变异)
<400>17
ggcatccttg tcttgttcct aatcttagag gtccagtact tttaatggtg acttggcagg 60
tatgccaatg aattaaaaaa gatttttgtg gcagcctact gaacactgcc agagtaatgc 120
tatcacatat taactttgtt tgctgattct ctaaagaaga taaagtagtt gacccaatta 180
tatcagcttc tattttttct cttaggtctt aggataaaat aaccccttga aaaatctttc 240
ctacccttct ttctggcatg ttatccttag aggagatgcg ccaaggagaa gctggttctg 300
ctcaggtgga cagaagttgg aacaaaaccc 330
<210>18
<211>217
<212>DNA
<213>扩增的序列6(变异)
<400>18
tgttccgtga ttcttagaca agaagcccat taacatgtac tactatttgg aaatctaatt 60
tgtaatttaa tatattgaat ttttgaagca tttcagtacc attgctttgt gggtctcctc 120
actcccaatc cagacaagtg ctgtgcacaa acatttcaag actctgaggc attctaccgt 180
cataatttgg agcaagttgt caaaggaacc cagatac 217
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>Snapshot引物A(rs2073135)
<400>19
ctatttccac aaaagtttct 20
<210>20
<211>28
<212>DNA
<213>Snapshot引物B(rs4697489)
<400>20
caggacatat ccctgtcatt aagcaatg 28
<210>21
<211>36
<212>DNA
<213>Snapshot引物C(rs248014)
<400>21
aagagaatgg agaaaagtgg ttatgtagaa tttact 36
<210>22
<211>44
<212>DNA
<213>Snapshot引物D(rs1105191)
<400>22
agatggagct aagcatcttt ctactgaaga acaggagtag ctat 44
<210>23
<211>52
<212>DNA
<213>Snapshot引物E(rs1943049)
<400>23
aaaaaagatt tttgtggcag cctactgaac actgccagag taatgctatc ac 52
<210>24
<211>60
<212>DNA
<213>Snapshot引物F(rs7035322)
<400>24
attgaattt tgaagcattt cagtaccatt gctttgtggg tctcctcact cccaatccag 60
机译： 用于筛选和检测人血清和血浆中结核分枝杆菌抗原的免疫学检测试剂盒，用于筛查和检测TB IGG + IM ELISA试剂盒及其制造方法
机译： “一种通过酶免疫分析试剂盒进行的HIV 1，HIV 2抗体筛查和HIV 1 P24抗原的早期检测”
机译： 多肽，表达盒，表达载体，宿主细胞，用于HCV和/或诊断肝炎C的免疫学筛查的试剂盒，成分，使用至少一种多肽的方法以及生产多肽的方法，用于进行免疫细菌和筛查的多肽
