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法律状态
2016-09-28
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N24/10 授权公告日:20120111 终止日期:20150811 申请日:20100811
专利权的终止
2012-01-11
授权
授权
2011-03-02
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N24/10 申请日:20100811
实质审查的生效
2011-01-05
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种阴离子自由基的测定方法，更具体的说是一种测定苦草叶片中超氧阴离子自由基的方法。
背景技术
活性氧(ROS)是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧自由基的总称，包括超氧阴离子(O2·-)、羟自由基(·OH)、氢过氧基(HO2-·)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)等。植物组织的光合作用、呼吸作用、氧化磷酸化、脂肪酸的-β-氧化以及许多氧化酶的代谢过程均可产生ROS。愈来愈多的研究证实，ROS是植物体代谢的正常部分，可作为信号分子诱导植物体对环境胁迫的应激响应，而特定条件(如污染物的胁迫)下能造成ROS的积累，进而导致膜脂质过氧化、蛋白分子的氧化修饰或降解，以及DNA分子的氧化损伤等。因此，研究自由基的产生、积累和代谢的变化，能够反映植物体在逆境条件下的氧化胁迫和应激响应水平，可为环境污染物的早期诊断提供预警信号。因此，准确测定植物组织ROS的产生和积累水平具有十分重要的理论意义和应用前景。
O2·-是各种ROS中产生最早的自由基，由氧分子接受一个电子而形成。虽然O2·-在生物体内的氧化能力和危害性不如·OH，但却是非常重要的一种自由基。它作为前驱物可以转化为各种自由基，比如O2·-可以发生歧化反应生成H2O2；而O2·-和H2O2可通过Fenton反应、Haber-Weiss反应、Winterbourn反应以及光解反应等过程转换成·OH。因此对植物组织中O2·-的定量检测尤其显得意义重大。但由于自由基的半衰期十分短暂，且在植物体内存在浓度极低，直接测定十分困难。目前研究学者常采用间接方法去检测植物体内产生的O2·-。比如通过分光光度法测定特定化合物与植物匀浆液中O2·-发生羟胺反应产生的中间产物，推算植物体内O2·-的产生速率，但必须注意影响间接方法的干扰因素很多。另外，植物组织的O2·-也能够直接捕获，比如通过氮蓝四唑(NBT)显色法实现O2·-在植物叶片上的直接显色，从而获得O2·-在叶片组织上分布信息，但是该法在准确 定量上存在明显不足，而且跟间接法一样，该法的干扰因素多，且能应用的植物种类很受限制。
目前，寻找一种快速、准确、高效、直接的自由基检测方法已成为研究自由基生物学作用的关键。电子顺磁共振(EPR)结合自旋捕获技术是当前研究自由基最直接、最有效的方法，近来已广泛应用于动物毒理、生物医学等领域的研究。此方法的基本原理是利用捕获剂与活泼自由基反应形成较稳定的自由基，即自旋加合物，然后再用EPR进行检测。目前比较常用的自旋捕捉剂有5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、亚硝基特丁烷(NtB)、α-苯基-N-叔丁基甲亚胺-N-氧化物(PBN)等。其中由于PBN相对较稳定，自旋加合物寿命长，在测定动物体内自由基含量方面应用较为广泛，但该捕获剂并不适用于多种植物特别是水生植物组织中自由基的检测，且不能稳定提供其与O2·-自旋加合物的特征谱线，限制了其推广。
在水生生态系统中，水生高等植物是保持水体稳定的关键生态群，且沉水植物完全水生的特点使得其对水体污染胁迫的反应最为直接。苦草(Vallisnerianatans(Lour.)Hara)是水鳖科苦草属的多年生无茎沉水草本植物，广泛分布于我国低海拔地区的河流和浅水湖泊等水域。目前已成为毒理学实验中经常采用的水生植物物种，相关研究较多集中于各种污染物对其产生氧化胁迫方面，但污染物胁迫诱导自由基产生的直接证据鲜见报道。尹颖等(2007)曾将冷冻干燥后的苦草叶片剪碎，用EPR直接检测叶片自由基含量，获得的EPR谱峰为一单峰，但是该方法未能使用特征捕获剂直接捕获活体自由基，测定的自由基难以准确定量，获得的谱峰也缺乏特异性，影响了其推广。因此，研发一种高效直接且特异性强的自由基捕获技术显得意义重大。
发明内容
1、要解决的技术问题
本发明主要是针对现有自由基测定方法的不足，提供了一种测定常见大型沉水植物苦草叶片中超氧阴离子自由基强度的方法，采用1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)作为自旋捕获剂，应用EPR技术测定苦草叶片中超氧阴离子自由基，可以实现快速、准确、直接的进行自由基检测，为污染物胁迫诱导植物叶片产生 自由基提供直接证据，该方法也可应用于实验室内外其它水生和陆生植物类群叶片中O2·-的定量研究。
2、技术方案
3、一种测定苦草叶片超氧阴离子自由基的方法，包括如下几个步骤：
第一步；采集充分暴露的苦草幼嫩叶片的尖端部位，清洗；
第二步：自由基的Tiron捕获；
第三步：EPR测定。
其中的第一步骤，叶片采集，清洗：迅速剪取经暴露的苦草幼嫩叶片的尖端部分，经纯水清洗，用滤纸快速吸干叶片表面残余水分。
第二步骤，自由基的Tiron捕获：迅速称取0.1～0.3g的植物叶片，置于瓷制研钵内，浇上液氮使其迅速冷却，用研杵快速敲碎叶片并研磨成粉末状，待残余液氮挥发干净后，立即按叶片重量g∶捕获剂溶液体积mL为1∶8～1∶10的比例加入Tiron捕获剂溶液(内含10～20mM邻苯二酚-3，5-二磺酸钠(Tiron，CAS 149-45-1，Sigma，美国)，50mM 2-环己胺基乙磺酸(CHES)和0.5％(v/v)吐温-20，pH 8.4～8.6)并充分匀浆。此匀浆液在10,000～12,000rpm，4℃，离心15～20min。取上清液注入3mm石英管中，迅速放入液氮中保持，以备EPR测定。在捕获前半个小时，在密闭操作箱中导入氮气以彻底去除氧气，以防止产生甲氧基对结果进行干扰。以上整个操作过程在氮气环境的密闭操作箱中进行。
第三步骤，EPR测定：EPR测定使用Bruker公司的EMX 10/12型电子顺磁共振仪。EPR操作参数：测试温度：室温；中心磁场：3476G；扫瞄宽度：50G；调制频率：100KHz；微波功率：20mW；调制幅度：1.0G；receiver gain：2×104；扫瞄次数：1次。获得的信号强度用于表征自由基含量。
4、有益效果
本发明采用EPR结合自旋捕获技术，公开了一种直接测定苦草叶片组织超氧阴离子自由基的方法，与以往的技术相比，本发明具有以下优点：
(1)快速、高效。本发明操作较为简单，容易掌握，并能在很短的时间内测得苦草叶片中的超氧阴离子自由基。
(2)直接、准确。根据EPR波谱图的超精细结构参数可确定所测定的自 由基是超氧阴离子自由基，而不像化学法和色谱法那样专一性不强。
(3)敏感且具有较好的剂量效应关系。研究结果多种污染物在低浓度下既能显著诱导超氧阴离子产生，其强度与暴露物在一定浓度范围内存在着较好的剂量-效应关系，显示自由基可以作为敏感的指示污染物胁迫的生物标志物。
(4)实用性较广。本发明对其它水生植物和陆生植物种属也同样适用，并可适用于根部组织。对于不同的污染物暴露都能直接测出超氧阴离子自由基，同时可应用于野外原位实验。
附图说明
图1为不同浓度微囊藻毒素MC-LR胁迫下苦草叶片超氧阴离子自由基的EPR波谱
图2为MC-LR暴露浓度和超氧阴离子自由基强度的关系。数值表示为平均值±标准误(n＝3)；＊和＊＊分别表示处理组相对于对照组有显著性(p＜0.05)和极显著性差异(p＜0.01)
图3为不同浓度铵态氮胁迫下苦草叶片超氧阴离子自由基的EPR波谱
图4为铵态氮暴露浓度和超氧阴离子自由基强度的关系。数值表示为平均值±标准误(n＝3)；＊表示处理组相对于对照组有显著性差异(p＜0.05)
图5为底泥中Cd2+浓度和苦草叶片超氧阴离子自由基强度的关系。数值表示为平均值±标准误(n＝3)；＊＊表示处理组相对于对照组有极显著性差异(p＜0.01)
图6为经SOD酶预处理苦草叶片后超氧阴离子自由基强度的变化。数值表示为平均值±标准误(n＝3)；＊表示处理组相对于对照组有显著性差异(p＜0.05)
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明的实施应用
实施例1 微囊藻毒素MC-LR胁迫下苦草叶片超氧阴离子自由基的测定
选择我国淡水环境常见沉水植物苦草(Vallisneria natans(Lour.)Hara)为受试生物。植株由商业苦草种子培育得到，培养液采用改进的Hoagland营养液(0.1×)，用曝气后的自来水配置。培养温度为25℃，光照强度为4000lux，光周期为12/12h。选取长势良好的高约10cm的植株幼苗移入含5cm石英砂的 玻璃缸，内含Hoagland稀释液，驯养数天后，添加不同浓度MC-LR，暴露浓度为0，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0μg L-1，每个浓度组3个平行，暴露14d，隔天换水并补加营养液和MC-LR。暴露完成后剪取苦草幼嫩叶片的尖端部分，经纯水清洗，用滤纸快速吸干叶片表面残余水分。迅速称取约0.2g的植物叶片，置于瓷制研钵内，浇上液氮使其迅速冷却，用研杵快速敲碎叶片并研磨成粉末状，加入2mL捕获剂溶液(内含10mM Tiron(Sigma，美国)，50mM 2-环己胺基乙磺酸(CHES)和0.5％(v/v)吐温-20，pH 8.6)并充分匀浆。此匀浆液在10,500rpm，4℃，离心20min。上清液用于EPR测定。以上整个操作过程在氮气环境的密闭操作箱中进行。
EPR测定使用Bruker公司的EMX 10/12型电子顺磁共振仪。EPR操作参数：测试温度：室温；中心磁场：3476G；扫瞄宽度：50G；调制频率：100KHz；微波功率：20mW；调制幅度：1.0G；receiver gain：2×104；扫瞄次数：1次。获得的信号强度用于表征自由基含量。
图1是不同浓度微囊藻毒素MC-LR胁迫14d后苦草叶片超氧阴离子自由基的信号图谱。说明苦草经MC-LR诱导可产生ROS，被Tiron捕获生成Tiron加合物，并且能被EPR光谱检测到。根据谱图的超精细结构常数和谱图的形状分析，证实本实验中捕获到的活性氧是O2·-。
从图2中可看出，MC-LR诱导苦草叶片O2·-强度随着暴露的浓度增加而增加，不过10μg L-1暴露浓度下信号强度略有下降。当暴露浓度为1.0μg L-1时，O2·-的信号强度是对照组的181％，与对照组相比具有极显著性差异(p＜0.01)，当暴露浓度是5.0-10.0μg L-1时，O2·-的信号强度是对照组的182％-173％，与对照组相比具有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。结合扫描和透射电镜观察，较高浓度(5.0-10.0μg L-1)MC-LR暴露对苦草叶肉细胞显微结构造成了明显的破坏，因此推测O2·-信号强度没有明显上升与细胞结构破坏有关。经线性回归分析表明，在没有造成叶片显著病理损伤的MC-LR暴露浓度下，其和诱导产生的自由基强度之间呈明显的线性剂量-效应关系：y＝1.21＊104x+3.12＊104，R2＝0.944，y代表O2·-自由基信号强度，x代表MC-LR暴露浓度。研究结果说明MC-LR暴露会造成O2·-在苦草叶片的累积从而有可能造成植株氧化损伤。
实施例2 铵态氮胁迫下苦草叶片超氧阴离子自由基的测定
选择沉水植物苦草(Vallisneria natans(Lour.)Hara)为受试生物。苦草植株的发芽和培养同实施例1，选取长势良好的高约10cm的植株幼苗移入含5cm石英砂的玻璃缸，内含无氮Hoagland稀释液，添加不同浓度氯化铵，使NH4+-N暴露浓度达到0，0.05，0.1，3.0mg L-1，每个浓度组3个平行，暴露14d，每天换水并补加氯化铵母液。暴露完成后剪取苦草幼嫩叶片的尖端部分，经纯水清洗，用滤纸快速吸干叶片表面残余水分。迅速称取约0.3g的植物叶片，置于瓷制研钵内，浇上液氮使其迅速冷却，用研杵快速敲碎叶片并研磨成粉末状，加入2.4mL Tiron捕获剂溶液(内含15mM Tiron(Sigma，美国)，50mM 2-环己胺基乙磺酸(CHES)和0.5％(v/v)吐温-20，pH 8.5)并充分匀浆。此匀浆液在12,000rpm，4℃，离心15min。上清液用于EPR测定。以上整个操作过程在氮气环境的密闭操作箱中进行。EPR测定使用Bruker公司的EMX 10/12型电子顺磁共振仪。EPR操作参数同实施例1。
图3是不同浓度铵态氮MC-LR胁迫14d后苦草叶片超氧阴离子自由基的信号图谱。说明苦草经铵态氮诱导可产生ROS，被Tiron捕获生成Tiron加合物，并且能被EPR光谱检测到。根据谱图的超精细结构常数和谱图的形状分析，证实本实验中捕获到的活性氧是O2·-。
从图4中可看出，0.05mg L-1铵态氮暴露下O2·-强度有所降低，这是因为N是植物必须的营养元素，低浓度N能维持植株正常的生长。之后苦草叶片O2·-强度随着暴露浓度开始增加，铵态氮当暴露浓度为3.0mg L-1时，O2·-的信号强度是对照组的152％，与对照组相比具有显著性差异(p＜0.05)。研究结果说明铵态氮一旦超过植株正常的生长所需要的浓度，会造成O2·-在苦草叶片的累积从而有可能造成植株氧化损伤。
实施例3 镉胁迫下苦草叶片超氧阴离子自由基的测定
选择沉水植物苦草(Vallisneria natans(Lour.)Hara)为受试生物。苦草植株的发芽和培养同实施例1，培养液采用改进的Hoagland营养液(0.1×)，用曝气后的自来水配置。培养温度为25℃，光照强度为4000lux，光周期为12/12h。选取长势良好的高约10cm的植株幼苗移入添加不同Cd2+浓度底泥的玻璃缸， 上覆水为平衡10d的曝气自来水(试验用底泥采自太湖某湖区，人为添加不同浓度氯化隔并老化60d)；每个浓度组3个平行，暴露14d。暴露完成后剪取苦草幼嫩叶片的尖端部分，经纯水清洗，用滤纸快速吸干叶片表面残余水分。迅速称取约0.1g的植物叶片，置于瓷制研钵内，浇上液氮使其迅速冷却，用研杵快速敲碎叶片并研磨成粉末状，加入1mL Tiron捕获剂溶液(内含20mM Tiron(Sigma，美国)，50mM 2-环己胺基乙磺酸(CHES)和0.5％(v/v)吐温-20，pH 8.4)并充分匀浆。此匀浆液在10,000rpm，4℃，离心20min。上清液用于EPR测定。以上整个操作过程在氮气环境的密闭操作箱中进行。EPR测定使用Bruker公司的EMX 10/12型电子顺磁共振仪。EPR操作参数同实施例1。
图5为底泥中Cd2+浓度和苦草叶片超氧阴离子自由基强度的关系。由图可知，底泥中添加1mg kg-1的重金属Cd胁迫即能极显著诱导苦草叶片中O2·-的产生，且胁迫浓度和诱导产生的自由基强度之间呈明显的线性剂量-效应关系：y＝2.87＊104x+4.58＊104，R2＝0.970。O2·-在苦草叶片的累积有可能会引起脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤等，从而对植株带来伤害。
实施例4 超氧化物歧化酶SOD对苦草叶片超氧阴离子自由基含量的影响
选择沉水植物苦草(Vallisneria natans(Lour.)Hara)为受试生物。苦草植株的发芽和培养同实施例1，选取长势良好的高约10cm的植株幼苗进行研究。剪取苦草新鲜叶片，立即浸入0，10，1000U mL-1的SOD酶溶液(含10mMMnCl2)，溶液置于自制可抽真空的玻璃容器内。抽真空(5分钟×3次)，促使溶液渗透进入叶片组织细胞，真空度以叶片表面出现明显微小气泡为宜。黑暗下静止15min后，取叶片尖端部分，经纯水清洗，用滤纸快速吸干叶片表面残余水分。迅速称取约0.2g的植物叶片，置于瓷制研钵内，浇上液氮使其迅速冷却，用研杵快速敲碎叶片并研磨成粉末状，加入2mL Tiron捕获剂溶液(内含12mMTiron(Sigma，美国)，50mM 2-环己胺基乙磺酸(CHES)和0.5％(v/v)吐温-20，pH 8.6)并充分匀浆。此匀浆液在10,500rpm，4℃，离心20min。上清液用于EPR测定。以上整个操作过程在氮气环境的密闭操作箱中进行。EPR测定使用Bruker公司的EMX 10/12型电子顺磁共振仪。EPR操作参数同实施例1。
图6表明经1000U mL-1SOD酶溶液处理后，叶片自由基含量显著下降，从另一角度证实了Tiron捕获剂捕获的自由基信号确实来源于超氧阴离子。由于短时间处理和抽真空使SOD进入叶肉细胞的效率有限，故处理后仍然能捕获到一定量的超氧阴离子自由基信号。
机译： 测定生理标本中至少一种分析物浓度的测试条，测定生理标本中至少一种分析物的浓度的方法，在此类试验片上获取大量反应区的方法以及一种测试样测定生理标本中的至少一种分析物的浓度
机译： 金属卟啉配合物的聚合膜，其制备方法以及使用该膜的超氧阴离子自由基的测定电极
机译： 超氧阴离子自由基的测定方法
