一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育

技术领域

一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育，属于生物工程中发酵技术领域。 

背景技术

γ-氨基丁酸又名4-氨基丁酸(4-Aminobutanoicacid，4-AB，简称GABA)和γ-氨酪酸，是在丁酸的γ位上有一个氨基，以非结合态的形式存在。它极易溶于水，不溶于醇、醚和苯，可以通过化学法或生物合成，也可从食品中直接摄取得到补充。广泛存在于自然界，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，由谷氨酸(Glutamic acid，Glu)经谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase，EC4.1.1.15，简称GAD或GDC)催化而来，以自由态形式广泛存在于原核生物和真核生物中。是哺乳动物中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、镇痛、解毒、促进乙醇代谢(醒酒)、改善更年期综合症等多种功效。 

作为一种化学物质来说，早在1883年GABA就被人工合成。1950年有人发现哺乳动物正常脑内的GABA的浓度很高，但生理意义不明。随后，有人从牛脑中提取出一种能抑制螯虾牵张感受器神经元产生冲动提取液，发现其具有抗乙酰胆碱及对脉鼠和家兔的回肠有收缩作用，并证明此提取液中起抑制作用的组分就是GABA。Segal SA等又证实GABA对哺乳动物的中枢神经具有普遍抑制作用，将用离子电泳分离得到的GABA注射于猫皮层十字沟周围的神经元，可引起神经元的超极化，其电位与刺激皮层表面突触所产生的抑制性电位相同，并发现用电刺激猫的小脑浦氏细胞时第四脑室灌流液中的GABA含量增加3倍，因而推测浦氏神经元释放的化学递质是GABA。但是，GABA的意义和作用被真正确认是在1975年的第二届国际GABA专题讨论会上。在那次会议上，GABA被正式确认为哺乳动物中枢的一种抑制性递质。 

由于GABA有很高的生理功能和广阔的应用前景，已受到世界学术和企业界越来越多的注意和研究。欧美和日本等少数发达国家有很多研究人员从事GABA的研制开发工作，并在其生理功效方面的研究处于领先水平。 

本发明筛选到高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的菌株，对该菌进行了鉴定，对其转化条件进行了初步研究，为微生物转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸工业化提供了基础。 

发明内容

本发明的目的在于提供：从自制酸菜中筛选到转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的菌株，经紫外诱变后筛选得到高产γ-氨基丁酸的菌株，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，将该菌命名为LP-GB 01-21。对转化产物γ-氨基丁酸进行了鉴定，为微生物转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的工业化提供了有益的指导。 

本发明的技术方案：一株转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的菌株，其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)GB 01-21，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 209102。 

目的菌株的鉴定：采用16S rDNA测序，与数据库对照后鉴定该菌为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。 

转化菌株的筛选：从自制酸菜取样，分离进行初步筛选，斜面保藏。把培养好的斜面种子活化后接种于种子培养基中，在30℃，静置培养1d，离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体。在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-80 0.01g。于30℃、160r/min振荡反应24h，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。将转化率高的留下进一步实验，复筛得到一株转化效果较好的菌株，命名为LP-GB01，并对其进行鉴定。通过进行形态观察、生理生化实验及分子生物学鉴定，确定了该菌的分子水平的生物学地位。以该菌作为出发菌株进一步经紫外诱变筛选得到一株高产γ-氨基丁酸的菌株，命名为LP-GB 01-21。 

所述菌株LP-GB 01-21的诱变选育方法，步骤为： 

(1)转化菌株的筛选：从自制酸菜取样，稀释至不同的浓度，分别吸取0.2mL不同浓度的菌悬液涂布于选择性平板培养基上，肉眼挑出生长并有透明圈的单菌落，转接于斜面培养基保藏，以此野生菌株LP-GB 01作为出发菌株； 

(2)出发菌株生长曲线与紫外致死率曲线的制定：诱变培养菌悬液置于15W的紫外灯下，距离照射菌悬液30cm，照射0、15s、30s、45s、60s、75s、90s，制定致死率曲线，选择致死率在70％-90％的时间诱变； 

(3)初筛：出发菌株经15W紫外灯下30cm处照射45s，菌悬液经过诱变处理后，稀释涂布于含代谢产物GABA的梯度平板上，30℃下培养1d。肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的菌落，于斜面保藏； 

(4)从平板中挑取单菌落活化后分别接入100mL种子培养基(500mL三角瓶)，30℃培养1d后离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体。在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸 2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-800.01g。于30℃、160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。 

所述培养基组成： 

(1)乳酸菌分离培养基：牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，吐温0.5g/L，番茄汁200g/L，溴甲酚绿0.1g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5。 

(2)菌种保藏活化培养基(MRS培养基)：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5。 

(3)种子培养基(TYG液体培养基)：蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸钠5g/L，pH 6.5。 

3、用权利要求1所述LP-GB 01-21菌株产γ-氨基丁酸的方法，其特征是GA 01-21在固体培养基以g/L计：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L，pH 6.5，培养18h，挑取单菌落接种于液体活化培养基以g/L计：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，pH 6.5，然后转入种子培养基以g/L计：蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸钠5g/L，pH 6.5，30℃培养1d后离心收集菌体，用灭菌水洗涤菌体。在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-80 0.01g。于30℃、160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。 

(6)氨基酸测定仪对产物进行定性与定量分析：利用氨基酸测定仪分别测定标准样品γ-氨基丁酸和转化液中各物质的出峰时间与峰面积，比较标准样品与转化液各自的出峰时间和峰面积，即可以对转化液中γ-氨基丁酸进行定性定量检测。 

本发明的有益效果：从自制酸菜中取样，分离进行初步筛选，斜面保藏，以野生菌株LP-GB 01作为出发菌株；经紫外诱变后筛选得到高产γ-氨基丁酸的菌株LP-GB 01-21，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，对该菌的生长条件进行了摸索，结果显示在温度30℃、pH 6.5、静置培养20h达到对数生长期。将生长期的菌体以12％(V/V)的接种量接入种子培养基，在30℃、pH 6.5、静置培养1d后，离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体，在100mL三角瓶中加入湿菌体0.5g，L-谷氨酸2.4g，0.2mol/L醋酸缓冲液(pH＝5.0)30mL，吐温-80 0.01g。于30℃，160r/min振荡反应24h，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量，为微生物转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸工业化提供了基础。 

产品纯度高，转化率高，转化周期短，一般只需24h左右即可转化完全。技术可移植性强，只要一般的发酵车间(如抗生素、维生素、氨基酸生产车间)即可进行生产，不需购置特殊设备和仪器，易于推广应用。 

附图说明

图1菌株(Lactobacillus plantarum)GB 01-21电镜图片； 

图2氨基酸测定仪测定LP-GB 01摇瓶转化液中底物与产物的含量图谱； 

图3氨基酸测定仪测定LP-GB 01-21摇瓶转化液中底物与产物的含量图谱； 

图4氨基酸测定仪测定LP-GB 015L发酵罐转化液中底物与产物的含量图谱； 

生物材料样品保藏 

一株转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸的菌株，其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)GB 01-21，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2009年5月7日，保藏编号为CCTCC M 209102。