一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

下面所涉及的不同基因型的甜高粱均表明来源了，公众可以从申请人的实验免费得到。

实施例1甜高粱幼穗组织培养再生体系的建立

1.1用于甜高粱组织培养的幼穗材料选择与准备

本发明取旗叶期长约2～5cm的幼穗，用70％酒精进行表面消毒3min，无菌水冲洗多次；在超净台中用刀切成大小均一的薄片接种于诱导培养基[MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT(玉米素)2.0mg/L+PVP(聚乙烯吡咯烷酮)10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂，pH 5.8]置于20～21℃暗培养3～4周，使之开始脱分化，形成愈伤组织；之后选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养[诱导培养基+KT(激动素)0.2mg/L]，每7～10天继代一次。挑选生长状态良好的愈伤组织接于分化培养基[MS基础培养基+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH 5.8]上26-28℃光培养2～3周，之后将愈伤组织再生出的苗移入生根培养基[1/2MS基础培养基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂，pH 5.8]中，当长出根时(苗高3～5cm，根长2～3cm)，洗去培养基，转移到装有消毒蛭石的小培养钵中练苗培养7-15d，然后移栽温室或大田。

1.2.选择合适的发育时期的幼穗诱导愈伤组织

不同发育时期的幼穗(以幼穗长度为准)接种于幼穗培养基上，其愈伤诱导能力存在差别。幼穗长度小于1.0cm时诱导愈伤率很低，仅为16.7％；幼穗长度为1.0～2.0cm时期的诱愈率有所提高，可达到43.8％；当幼穗长度在2.0～3.0cm时，诱愈率达到最高，为61.7％。当幼穗长度大于5.0cm后，随着其发育时期的延长，幼穗长度的增加，愈伤组织的诱导率逐渐下降(表1)。本实验结果表明，甜高粱幼穗长度即幼穗在不同发育时期对愈伤组织的诱导具有较大的影响，因此，在以甜高粱幼穗为外植体材料建立组织培养再生体系或遗传转化时，应注意选择适宜的发育时期的幼穗。

表1幼穗长度对愈伤组织诱导的影响

1.3.不同基因型对幼穗愈伤组织诱导的影响

选取7种不同甜高粱基因型幼穗材料，在接种的866块外植体中共有617块外植体能诱导出愈伤组织，平均诱愈率为71.25％，褐化死亡率为28.75％。但不同基因型间诱愈率差异很大，其中以“BABUSH”诱愈率最高，可达84.23％，其次是“MN-3025”，诱愈率为79.26％；“品甜三号”诱愈率很低，仅为31.11％(表2)。说明基因型是影响甜高粱幼穗组织培养的一个重要因素，因此在实际操作中应注意选择基因型。

表2不同基因型对甜高粱幼穗愈伤组织诱导的影响

注：/--表示未诱导出愈伤组织

1.4.不同基因型幼穗愈伤组织的再生能力比较

如表3所示，不同基因型愈伤组织的分化再生能力表现出明显的差异。供试的7种不同幼穗基因型中，幼穗愈伤组织分化率明显不同。在接种的368块幼穗愈伤组织中，共有228块愈伤组织能够分化再生出苗，平均分化率为61.96％，褐化死亡率为38.04％。其中“BABUSH”的分化率最高，可达94.44％，其褐化死亡率最低，为5.56％，而“品甜三号”的分化率最低，仅有26.67％，褐化死亡率则高达73.33％。此结果说明各基因型间愈伤组织分化率差异很明显，基因型也是影响其再生能力极其重要因素之一。

表3不同基因型对愈伤组织分化率的影响

注：a：代表能分化出苗的愈伤组织块；b：代表分化出苗的愈伤组织占转接到分化培养基上的愈伤组织总数的百分率。

结论：本发明通过比较发现不同甜高粱幼穗长度对愈伤组织的诱导率具有显著的影响(p＝0.000＜0.001)，因此，在以甜高粱幼穗为外植体材料建立组织培养再生体系或遗传转化时，选择2-3cm的发育时期的幼穗较为合适。研究发现不同基因型幼穗材料的诱导愈伤能力及分化再生能力表现出明显的差异：平均诱愈率为71.25％，平均分化率为61.96％。经过比较从中筛选出两个具有高频再生能力的甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”，可用于进一步的遗传转化研究。

本发明通过对植物激素配比、培养基成分、不同基因型等因素对甜高粱组织培养的影响比较发现，培养基中添加玉米素2.0mg/L对于幼穗愈伤组织的诱导具有重要的作用，可以大幅度提高诱愈率；同时在培养基中适量添加8-10mg/L PVP和10mg/L抗坏血酸，可以有效地减轻褐化现象，促进诱愈率的提高。本发明建立了甜高粱幼穗愈伤组织培养再生体系：其中愈伤组织诱导培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+水解酪蛋白500mg/L+PVP10mg/L+抗坏血酸10mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂，pH 5.8；继代培养基为：诱导培养基+KT 0.2mg/L；分化培养基为：MS+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂8，pH 5.8；生根培养基为：1/2MS+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8。

实施例2以甜高染幼穗诱导愈伤组织为外植体的基因枪法遗传转化

2.1基因枪法所用培养基：

愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂，pH 5.8；

愈伤组织继代培养基：MS+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂，pH5.8；

高渗培养基：继代培养基+0.4M甘露醇；

筛选培养基：继代培养基+适宜的筛选剂(根据具体情况而定)；

愈伤组织分化培养基：MS+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8；

生根培养基：1/2MS+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8。

2.2转化方法：

选取适宜发育时期的幼穗材料(2-3cm)，切成大小均一(约3mm)的薄片，接种于诱导培养基上诱导愈伤。转化前4hr，挑选由幼穗诱导产生的生长状态良好的愈伤组织块转移到含0.4M甘露醇的高渗培养基上，每培养皿30～40块愈伤，放置在培养皿中央直径约2.5cm范围内。用质粒DNA(含有目的基因的植物表达载体)包裹直径1.0μm金粉，金弹的包裹方法如下：取25μl直径1μm的金粉悬浮液(50mg/ml)放入1.5mL eppendorf管中，加入2.5μl质粒DNA溶液(1μg/μl)。混匀后再分别加入25μl 2.5mol/L CaCl₂溶液和10μl 0.1mol/L亚精胺溶液，冰上静置10min，短暂离心3sec(1000rpm)，弃去上清液，加入50μl无水乙醇，充分悬浮后即可上样。采用PDS-1000/He基因枪(Bio-Rad公司生产)，按照基因枪说明书所述程序对受体材料进行轰击，轰击参数为：Gap distance：20mm；微弹载体飞行距离：10mm；微弹飞行距离：7cm；可裂膜压力：1100psi；真空度：25inches Hg。每皿材料轰击1-2次，金弹用量为12.5μl/次。

转化愈伤组织的筛选和植株的再生：将轰击后的幼穗愈伤组织继续在高渗培养基上26℃暗培养过夜，然后转移到诱导培养基上，恢复培养一周；将愈伤转移到筛选培养基上，筛选两周，弃去褐化死亡的愈伤，选择色泽正常、生长状态良好的愈伤即为抗性愈伤；将抗性愈伤移至无筛选压的分化培养基上，在光周期16h光照/8h黑暗、28℃条件下培养，每两周继代一次；将发生绿芽的愈伤组织切分，以利于主芽的生长；当小植株长到2～3cm高时，转移进玻璃瓶中(含MS生根培养基)继续生根培养；待小苗3～4叶期且根系较发达时，洗去琼脂移入小花盆中，移入温室培养；二周后移入大花盆，直至开花结实。

2.3甜高粱转cry1Ah基因再生植株的获得

挑选生长状态良好的幼穗愈伤组织用于基因枪转化，所用植物表达载体pMUHEGM(申请人实验室保存，公众可以从申请人处免费得到)如附图1所示。经基因枪轰击后的愈伤组织，经过2周0.8mM草甘膦异丙胺盐的筛选，大部分愈伤组织逐渐变褐，结构疏松，停止生长继而死亡；但在少数愈伤组织表面，开始出现凸起的生长区域，呈乳黄色，结构较致密，即为抗性愈伤组织。筛选之后所获得的抗性愈伤经再生、生根、壮苗后，蛭石过渡培养移栽温室。待转化再生植株抽穗后，套袋，自交授粉，自然结实，收获T0代种子(附图2，a-h)。

2.3.1甜高粱转化植株的分子鉴定

2.3.1.1T0代甜高粱转化植株的PCR检测

利用基因枪法将载体pMUHEGM转化甜高粱幼穗愈伤组织，经0.8mM草甘膦异丙胺盐筛选，共得到T0代转化植株83株。为检测外源基因是否整合入甜高粱基因组中，对获得的83株转化植株提取总DNA，进行了PCR分析，所用引物：cry1Ah：上游引物为：GCCCAAGCTGC CAACCTCCAC TTGTCTTTGC

下游引物为：GGTGCTCTTA TGATGCTGAC ACTGCTACTA GAGCC2mG2-epsps：上游引物为：CCGTGACC GTTACACCAC CTAACTTCCC

下游引物为：TTGAATGCAG CGAGAACCGC TAGAGTCGGG

PCR检测扩增条件如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火40sec，72℃延伸50sec，扩增循环数：30～35；最后72℃延伸10min。附图3分别为部分转基因植株cry1Ah基因和2mG2-epsps基因的PCR分析结果。结果有16株转化植株同时扩增出两个目的基因片段大小的条带：cry1Ah为865bp，2mG2-epsps为909bp。在未转化对照植株总DNA中未能扩增出相应DNA片段，说明外源基因已整合入转基因甜高粱基因组中。

2.3.1.2T0代甜高粱转化植株的RT-PCR检测

选取部分PCR阳性植株及非转基因对照植株，分别提取叶片总RNA反转录后用RT-PCR方法检测cry1Ah基因的转录情况。结果显示，对照植株没有扩增到目标条带，转基因植株均可扩增到大小为865bp的目标片段，表明cry1Ah基因导入到甜高粱基因组中可以正常转录(附图4)。

2.4甜高粱转化植株的生物活性检测

待甜高粱转化苗生长到6～8片叶即心叶中期时，将玉米螟初孵幼虫接于心叶中，每株接玉米螟初孵幼虫40～60头，以非转化植株作为阴性对照，接虫1～2周后调查食叶级别。结果显示，人工接虫后，转基因植株单株间对玉米螟的抗虫性表现有一定差异：非转基因植株或是不抗虫转基因植株被玉米螟咬食严重，叶片虫孔大且虫孔数目多，已影响到植株的正常生长。在T0代转化植株中共筛选到3株表现出较好的抗虫性，没有或只有少量、很小的玉米螟危害的虫孔，其余植株表现为感虫或是高感(附图2，i和j)，分析原因可能是cry1Ah基因在甜高粱中的蛋白表达量低导致的。抗性植株占转cry1Ah基因植株总数的3.61％。

2.5甜高粱转化植株的除草剂抗性检测

待甜高粱转化幼苗生长至4～6叶期，用0.2％草甘膦药剂(农达RoundUP)进行叶片涂抹实验：在离叶尖5cm处划线作为标记，用棉签蘸取适宜浓度的除草剂药液均匀地涂抹在划线部位，一周后统计甜高粱叶片受害情况。结果草甘膦施用8天后，对照和非转基因甜高粱苗叶片涂抹处出现叶片失绿、萎蔫、褐化等药害症状，随时间推移，药害程度不断加深，少部分植株表现出畸形及生长停滞的现象，另有一部分转化植株叶片未对表现出明显的受害症状，表现出对草甘膦有较好的抗性(见附图2，k)。喷洒草甘膦第14天观察统计，共筛选到14株草甘膦抗性转化幼苗，占总幼苗数的16.87％。