公开/公告号CN102121021A
专利类型发明专利
公开/公告日2011-07-13
原文格式PDF
申请/专利权人 南京师范大学;
申请/专利号CN201010598400.9
申请日2010-12-21
分类号C12N15/53(20060101);C12N15/10(20060101);C12N15/09(20060101);A61K39/00(20060101);A61P37/04(20060101);C12N9/02(20060101);
代理机构32207 南京知识律师事务所;
代理人卢亚丽
地址 210046 江苏省南京市亚东新城区文苑路1号
入库时间 2023-12-18 02:56:11
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-12-05
专利权的转移 IPC(主分类):C12N15/53 变更前: 变更后: 登记生效日:20121106 申请日:20101221
专利申请权、专利权的转移
2012-09-12
文件的公告送达 IPC(主分类):C12N15/53 收件人:苏复 文件名称:视为未提出通知书 申请日:20101221
文件的公告送达
2012-05-02
授权
授权
2011-08-24
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/53 申请日:20101221
实质审查的生效
2011-07-13
公开
公开
技术领域
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及绵羊IFN-γ 诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA及其克隆、表达技术。
背景技术
GILT（γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶）是1988年由Luster等人发现的。GILT是以可溶性糖蛋白前体的形式被甘露糖-6-磷酸受体传递到胞吞途径后，N-和C-端前肽被切割形成30KDa成熟形式。以Ⅱ型组织相容性抗原复合物（MHC classⅡ）为基础的抗原呈递需要将天然蛋白加工成短肽以适合MHC的结合和T细胞受体（TCR）的识别。抗原呈递细胞中进行的抗原抗原的变性、去折叠、二硫键还原及蛋白水解。在整个加工途径中，二硫键的还原是关键步骤。30kDa GILT具有催化二硫键还原的活性,因此能够促进天然蛋白抗原的去折叠和进一步的蛋白酶解。GILT在抗原呈递细胞组成型表达，在成纤维细胞、内皮细胞和角蛋白细胞等细胞中可被IFN-γ诱导表达。在专门的抗原呈递细胞如B细胞和巨噬细胞中， GILT在较低的pH条件下有较高的活性，并且被证明在抗原加工及免疫显性表位的显示中起着重要的作用。此外，GILT 在中和胞外的病原体和清除感染的细胞碎片方面也有作用。GILT 的缺失可能影响到对病毒、肿瘤、细菌、寄生虫抗原的免疫应答，并且可能影响自身免疫变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis）、糖尿病的发生发展。
目前国内对GILT 的研究较少，只获得了猪、文昌鱼、石斑鱼、大黄鱼、珍珠贝的GILT基因并对用real-time PCR技术对GILT的表达分布进行鉴定，通过LPS刺激检测GILT表达量的变化情况。
国外关于人、鼠GILT的研究进展：
（1）Patrick等人研究表明人的黑色素瘤细胞中GILT的表达依赖于STAT1而不依赖于CIITA。表达MHC classII的肿瘤细胞不总是与GILT的表达相偶联，这是因为IFN-γ刺激细胞表面受体使其胞内酪氨酸残基磷酸化，这些磷酸化的酪氨酸残基成为STAT1单体的停泊位点，从而被Jak1和2磷酸化。磷酸化的STAT1二聚化入核激活一系列靶基因的转录包括CIITA。而CIITA是MHC classII的总开关，它的缺失不影响GILT的表达。
（2）Maric等人的研究表明GILT的上调会降低T细胞的敏感性从而减少自身免疫。降低成熟T细胞的TCR的敏感性有助于控制自身免疫病的发生。GILT-/-的外周T细胞能够增加TCR的敏感性，因为降低了线粒体超氧化物歧化酶的表达导致活性氧的增加和ERK1/2的磷酸化。GILT-/- T细胞的敏感性增加导致了高血糖症。
（3）、2010年Reshma Singh和Peter Cresswell在Science上发表文章证明GILT对促进I型组织相容性抗原复合物的呈递抗原有作用，在GILT-/-小鼠中缺乏对病毒抗原的交叉递呈，影响了CD8+T细胞对病毒抗原的应答反应。
（4）、Su Yan等人研究表明GILT 对B细胞的耐受起重要作用，临床免疫耐受诱导方面有潜在价值。肽-IgG融合蛋白转导的脾脏B细胞能够有效的对APCs（抗原呈递细胞）耐受。但是机制如何并不清楚。他们发现来源于肽-IgG的class II表位以GILT依赖的方式被加工。这种体内耐受诱导系统对多种自身免疫病（实验性变态反应性脑脊髓炎、糖尿病、血友病）模型动物有效。
（5）、Reshma Singh等在nature的文章表明GILT 是李斯特氏菌感染的关键宿主因子。李斯特氏菌是革兰氏阳性、胞内、食源性病原菌能够在人和动物体内引起严重的疾病。感染过程中被巨噬细胞吞噬并在胞内逃离吞噬体并在胞浆中复制，然后以非裂解的机制从一个细胞到另一个细胞传播。穿透吞噬体膜是通过分泌溶血素（LLO）实现的。活化具有裂解活性的LLO的正是GILT。在细菌感染部位，巨噬细胞能够分泌GILT到胞外，GILT因能够活化那个部位的血溶素介导的组织破坏，可能包括因宿主防御招募过来的炎症细胞的裂解。
综上所述,国际上对GILT的研究是个热点，但对GILT上游的基因调控及下游信号通路与免疫调节机理研究比较充分，但应用研究还是一个空白，本课题基于国内外研究的现状以及羊的细菌感染疾病的思考提出，对羊GILT进行分子结构、功能及免疫调节机制方面进行研究，针对免疫力低下和炎症感染疾病的动物，开发相关的免疫增强剂和疫苗佐剂。
发明内容
本发明针对现有技术，提供一种从绵羊提取的IFN-γ 诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA，并提供绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA的克隆方法及重组应用。
本发明从绵羊中克隆到IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明的绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA的克隆方法如下：
（1）根据绵羊基因组IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶的序列设计引物：
正义寡核苷酸引物Sheep GILT1：5’- TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC -3’（ SEQ ID NO.3）
反义寡核苷酸引物Sheep GILT2：5’- CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG-3’ （ SEQ ID NO.4）
（2）从绵羊脾脏提取总RNA；
（3）通过RT-PCR方法，以上述引物Sheep GILT1及Sheep GILT2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。
上述绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA的克隆方法具体操作如下：
（1）根据绵羊基因组IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶全长CDS两端设计的正义寡核苷酸引物Sheep GILT1 （5’- TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC -3’）与反义寡核苷酸引物Sheep GILT2（5’- CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG -3’）。
（2）应用组织RNA提取试剂盒（天根生物公司），按照操作手册，提取出绵羊脾脏细胞的总RNA，
（3）应用RT-PCR方法，以上述Sheep GILT1及Sheep GILT2为特异性引物，扩增出全长cDNA序列，全长为735bp，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。第一步逆转录的反应条件为：以总RNA为模板，在25μl反应体系中，加入5×M-MLV反应缓冲液5μl、10mM dNTP混合物1.5μl、 RNase inhibitor （HRP1） 1μl、M-MLV(RNase H-)逆转录酶（Takara公司）1μl、Oligo（dT）18 primer 1μl、及RNA模板 3μl，补水至25μl，42℃保温1h。第二步进行用两个特异性引物进行30个PCR循环（94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min），最后于72℃延伸7 min。RT-PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约735bp的DNA条带，克隆入pMD19-T载体，挑取8个阳性克隆进行碱基序列测定。
将所得序列与GenBank数据库序列进行相似性搜索，发现与已知的人、小鼠、猪GILT序列相似率分别是60.15%、62.50%、73.58%，可以确定该序列是绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶(Sheep GILT)的全长cDNA，其开放阅读框如SEQ ID NO.1所示。
对该基因的进一步研究表明：该基因主要表达在绵羊免疫器官中，包括脾脏和血液。该基因的重组融合蛋白具有GILT的高活性功能；该基因编码的蛋白人IgG具有明显的还原功能；充分表明本发明克隆得到的基因就是绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶(Sheep GILT )的cDNA。
上述绵羊IFN-γ 诱导的溶酶体巯基还原酶(Sheep GILT)的cDNA的重组应用，通过现有基因工程方法，生产重组Sheep GILT，作为绵羊免疫增强剂。
所说的绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA通过现有基因工程方法，转入绵羊体内，增加其免疫力，在饲养中应用。
附图说明
图1是Sheep GILT 全长cDNA 碱基序列及推测编码氨基酸序列。
图2是Sheep GILT与牛、人、猪、鼠、爪蟾、斑马鱼GILT 全长氨基酸序列同源性比较图。其中灰色阴影代表保守的半胱氨酸；方框代表CXXC基序和CQHGX2ECX2NX4C特征序列。
图3是Sheep GILT mRNA 在各组织中的表达水平分析图。GAPDH作为内参。
图4是融合蛋白His-sGILT在BL21(DE3)中的诱导表达，纯化的SDS-PAGE鉴定及鼠抗His6-tag 的western-blotting鉴定结果，图中泳道1是未经IPTG诱导的全菌蛋白，泳道2是经IPTG诱导的全菌蛋白，泳道3是经超声破碎后的上清；泳道4是经过超声破碎后的沉淀，泳道5是纯化后的重组His-sGILT蛋白，泳道6是鼠抗His6-tag单抗的western-blotting鉴定结果。
图5 是体外展示羊GILT巯基还原酶活性。M:蛋白分子量marker；泳道1和2：纯化的sGILT；泳道3和4：变性的纯化人IgG；泳道5和6：sGILT和人IgG在pH4.5条件下孵育；泳道7和8：用DTT处理的人IgG作为阳性对照。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
实施例1：
绵羊（Ovis aries），人工饲养。
（1）引物设计：应用生物信息学技术在NCBI的EST库中电子克隆出IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶全长cDNA序列用来设计的正义寡核苷酸引物Sheep GILT1 （5’- TGTGATGGCCTCGTCGCCTCTC -3’ ，SEQ ID NO.3）与反义寡核苷酸引物Sheep GILT2（5’- CAGTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG -3’，SEQ ID NO.4）。
（2）提取总RNA：应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen 公司)按照其操作手册提取出约0.5克绵羊脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。
（3）应用RT-PCR方法，以上述sheep GILT1及sheep GILT2为特异性引物，扩增出Sheep GILT cDNA的全长为735bp，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。第一步逆转录的反应条件为：以总RNA为模板，在25μl反应体系中，加入5×M-MLV反应缓冲液5μl、10mM dNTP混合物1.5μl、 RNase inhibitor （HRP1） 1μl、M-MLV(RNase H-)逆转录酶（Takara公司）1μl、Oligo（dT）18 primer 1μl、及RNA模板 3μl，补水至25μl，42℃保温1h。第二步进行用两个特异性引物进行30个PCR循环（94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min），最后于72℃延伸7 min。RT-PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约735bp的DNA条带，克隆入pMD19-T载体，挑取8个阳性克隆进行碱基序列测定。
（6）同源检索：将所得序列向http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/提交克隆得到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库进行相似性搜索及同源性分析，如图3所示，发现与已知的牛 (AAI49407)，猪(ABX79390)，鼠 (NP_075552)，人 (AAH31020)，斑马鱼(AAH83267) 和爪蟾 (NP_001017196) GILT 氨基酸序列分别是93.03%，73.58%，62.50%, 60.15%， 42.80% 和41.86%，可以确定该序列是绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶 (sGILT) 的全长cDNA。并且其开放阅读框具有SEQ ID NO.1序列，碥码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：
Sheep GILT 基因在各组织的表达水平分析：
采用实施例1中的提取RNA的方法，分别提取了绵羊肝（liver）、肾(kidney)、肺（lung）、脾（spleen）、心（heat）、肠（intestine）和血液（PBMCs）的总RNA，运用定量RT-PCR法对Sheep GILT基因在各组织的表达水平进行了研究，结果如图3所示，Sheep GILT基因主要表达在绵羊免疫器官中，包括血液和脾脏表。试验中绵羊GAPDH作为内参，采用的引物为GF-P1 (5ˊ-GGGTCATCATCTCTGCACCT-3ˊ，SEQ ID NO.5)和GR-P2 (5ˊ-GGTCATAAGTCCCTCCACGA-3ˊ，SEQ ID NO.6)。RT-PCR体系如实施例1。
可溶性Sheep GILT重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达：
以实施例1得到的Sheep GILT全长 cDNA为模板，设计引物28-P1 (5ˊ-AAAGGATCCATGGCCTCGTCGCCTCTC-3ˊ，SEQ ID NO.7) 和 28-P2 (5ˊ-CCCAAGCTTTCACTTCAAGTGGACTTCCTTG-3ˊ，SEQ ID NO.8)扩增出Sheep GILT cDNA，引物分别引入酶切位点BamHⅠ和HindIII，亚克隆入pET-28a载体，构建成重组载体pET-28a-sGILT。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），胞浆内表达出目的蛋白His-sGILT。
重组目的蛋白的变复性
变性过程：
2M尿素：100mM Tris，100mM NaH2PO4，2M尿素。
4M尿素：100mM Tris，100mM NaH2PO4，4M尿素。
6M尿素：100mM Tris，100mM NaH2PO4，6M尿素。
8M尿素：100mM Tris，100mM NaH2PO4，8M尿素。
收菌后，放于-20度24小时。用PBS重旋后，超声破碎（超声4s，停顿8s，共150次），12000rpm、4度离心20min，弃上清，沉淀放于-20度或直接变性。
向沉淀用2M的尿素洗三遍，用4M的尿素洗两遍，用6M的尿素洗1遍或用6M的尿素溶解，最后用8M的尿素溶解，溶解后加入DTT至5mM。4度摇24-36小时。每次洗的时候加入TritonX-100的量为75微升/30ml蛋白液。
复性过程：
先用100mM Tris，100mM NaH2PO4，4M尿素，1mM GSH，0.2Mm GSSG，0.6mM Arg pH8.0透析24小时，再用100mM Tris，100mM NaH2PO4，2M尿素，1mM GSH，0.2Mm GSSG，0.6mM Arg pH8.0透析36小时。然后用75mM Tris，75mM NaH2PO4，1.5M尿素，0.6mM Arg，25g乳糖/L pH8.0透析过夜；再用50mM Tris，50mM NaH2PO4，1M尿素，0.6mM Arg，25g乳糖/L pH8.0透析过夜。然后用25mM Tris，25Mm NaH2PO4，0.5M尿素，pH8.0透析过夜，最后用20Mm Tris透析过夜，后冻干。每次换透析液时12000rpm，4度，离心20min后重新装入透析袋。
western 印迹分析：
Western-blot中所用一抗为鼠抗His6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG。其简要步骤是：将诱导的产物先行SGS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5％脱脂奶粉室温封闭1h，与一抗孵育1h，与HRP标记的二抗IgG孵育1h，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。结果如图4所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。
Sheep GILT对IgG的二硫键还原作用：
对sheep GILT 用25μM 的DTT在37℃活化10min，将绵羊GILT与人IgG在pH4.5 ，37℃条件下反应1小时，向反应样品中加入非还原性上样缓冲液，在SDS-PAGE胶中跑电泳结果如图5
实施例3：
将实施例1获得的绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA通过现有基因工程方法，生产重组Sheep GILT，作为绵羊类免疫增强剂。
实施例4：
将实施例1获得的绵羊IFN-γ 诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA通过现有基因工程方法，转入绵羊体内，增加其免疫力，在饲养中应用。
按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶基因并用于所述研究和生产。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 绵羊IFN-γ诱导的溶酶体巯基还原酶cDNA及其克隆方法和重组应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 735
<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 1
atggcctcgt cgcctctcct gctcctgctg ctgctgctgc tgccgccgga ggtccccgcc 60
gcaacgcggt ggccctcgct ggaagcgctc cccgaggggg cggccccctg ccaggtcggt 120
gagctgtgcc tgcaggcatc gccccagaag cctgatgttc ccctggtcac cgtgagcctc 180
tactatgagg cgctgtgccc cggctgccgg gaattcctga tccgagagct cttcccgacg 240
tggctgatgg tgtgggaaat cctcaacgtc accttggtgc cctatgggaa cgctcaggaa 300
agaaacgtca gcggcaagtg ggagttcacg tgccagcatg gtgagcggga gtgcatgctt 360
aacaaagtgg aggcctgcct gctggaccag ctggagcaga aaatggcctt cctgaccatt 420
gtctgcctag aggaaatgaa tgacatggag caaaacctga agccgtgcct gcagatctat 480
gcgccaaagg tgtccccgga ttccatcatg gagtgtgcta gggggaaccg cggcatgcag 540
ctcttgcact tcaacgctca gctcacggac gctctgcggc caccccacaa atacgtgccc 600
tgggtcgtcg tcaatgggga acacatggaa gacgaggaac atctcctaca ccttgtctgc 660
cggttgtacc agggccagaa gccagatgtc tgccaactca cagctgacct gtccaaggaa 720
gtccacttga agtga 735
<210> 2
<211> 244
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 2
Met Ala Ser Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro
1 5 10 15
Glu Val Pro Ala Ala Thr Arg Trp Pro Ser Leu Glu Ala Leu Pro Glu
20 25 30
Gly Ala Ala Pro Cys Gln Val Gly Glu Leu Cys Leu Gln Ala Ser Pro
35 40 45
Gln Lys Pro Asp Val Pro Leu Val Thr Val Ser Leu Tyr Tyr Glu Ala
50 55 60
Leu Cys Pro Gly Cys Arg Glu Phe Leu Ile Arg Glu Leu Phe Pro Thr
65 70 75 80
Trp Leu Met Val Trp Glu Ile Leu Asn Val Thr Leu Val Pro Tyr Gly
85 90 95
Asn Ala Gln Glu Arg Asn Val Ser Gly Lys Trp Glu Phe Thr Cys Gln
100 105 110
His Gly Glu Arg Glu Cys Met Leu Asn Lys Val Glu Ala Cys Leu Leu
115 120 125
Asp Gln Leu Glu Gln Lys Met Ala Phe Leu Thr Ile Val Cys Leu Glu
130 135 140
Glu Met Asn Asp Met Glu Gln Asn Leu Lys Pro Cys Leu Gln Ile Tyr
145 150 155 160
Ala Pro Lys Val Ser Pro Asp Ser Ile Met Glu Cys Ala Arg Gly Asn
165 170 175
Arg Gly Met Gln Leu Leu His Phe Asn Ala Gln Leu Thr Asp Ala Leu
180 185 190
Arg Pro Pro His Lys Tyr Val Pro Trp Val Val Val Asn Gly Glu His
195 200 205
Met Glu Asp Glu Glu His Leu Leu His Leu Val Cys Arg Leu Tyr Gln
210 215 220
Gly Gln Lys Pro Asp Val Cys Gln Leu Thr Ala Asp Leu Ser Lys Glu
225 230 235 240
Val His Leu Lys
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtgatggcc tcgtcgcctc tc 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagtcacttc aagtggactt ccttg 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gggtcatcat ctctgcacct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtcataagt ccctccacga 20
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaaggatcca tggcctcgtc gcctctc 27
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cccaagcttt cacttcaagt ggacttcctt g 31
机译： Polinucleotidio polinucleotidio重组载体，重组宿主细胞系统，重组表达，细胞转化的polipeptidio，HCV，Polipeptidio的制备，HCV的polipeptidio.Polipeptidio纯化的重组polipeptidio，与之合并的polipeptidio，单克隆抗体，制备纯化的多克隆抗体，颗粒polinucleotidio探针.Epetopo HCV试剂盒抗体，产生脂肽的方法，检测HCV免疫测定的HCV抗原的检测方法，检测针对HCV疫苗抗原的抗体的免疫测定，用于治疗HCV感染，细胞和HCV感染的细胞的方法。丙型肝炎病毒抗体的生产以及分离未确定传染源基因组cDNA的方法
机译： 重组糖蛋白，DNA分子，生物活性载体，cDNA的获得方法，GlcNAc 1、3-岩藻糖基转移酶的克隆方法，重组宿主细胞的获得方法，重组植物，重组植物和植物细胞的获得方法，昆虫和昆虫细胞的重组，肽核酸分子，获得GlcNAc 1，3-岩藻糖基转移酶表达受阻的植物或昆虫的方法，重组糖蛋白和人糖蛋白的获得方法，reco
机译： 从空肠吸虫唾液腺cdna文库获得kunitz蛋白酶抑制剂的方法：克隆寡核苷酸序列和重组蛋白氨基酸序列，重组蛋白;测定对活化因子x的抑制活性的方法，测定血浆中抗凝活性的方法，测定人和鼠肿瘤细胞系中凋亡活性的方法，测定黑素瘤肿瘤中抗转移活性的方法，体外方法和体内抗癌活性的测定，重组用于不同的稳态（凝血和免疫反应），抗增殖，抗凋亡和抗血管生成机制
