用于在化学成分确定的培养基中培养细胞的合成表面

相关申请

本申请要求2008年1月30日提交的，名为“Synthetic Surfaces forCulturing Undifferentiated Stem Cells in Chemically Defined Media(用于在化学成分确定的培养基中培养未分化干细胞的合成表面)”的美国临时申请序列号61/062,890和2008年1月30日提交的，名为“Stem Cell Article andScreening(干细胞制品和筛选)”的美国临时申请序列号61/062,937的优先权。

领域

本发明涉及细胞培养制品，更具体地说涉及用于在化学成分确定的培养基中支持未分化干细胞培养的制品。

背景

多能干细胞，如人类胚胎干细胞(hESC)具有分化为三种胚层中的任一种的能力，从而在人体中形成任何成人细胞类型。这种独特的性能为开发大量严重的细胞退化疾病，如糖尿病、脊髓损伤、心脏病等的新治疗方法提供了可能性。然而，开发这种hESC治疗有障碍。此类障碍包括在细胞和组织培养中获得并维持足够量的未分化hESC和控制其分化以产生特定细胞类型。干细胞培养，如hESC细胞培养通常用细胞库或细胞储备物的少量细胞接种，然后在未分化的状态下扩增直至给定的治疗用途需要分化。为达到这点，目前在有含动物衍生的成分(如滋养层、胎牛血清或MATRIGEL^TM)的表面或培养基存在下培养hESC或其分化细胞群。向培养环境添加这些动物衍生的东西使得细胞接触可能有害的病毒或其它传染性物质，这些有害的病毒或其它传染性物质会转移到患者或损害hESC的常规培养和维持。此外，此类生物产品易产生批次差异、免疫反应和存储寿命有限。

虽然目前已在动物衍生的表面上用化学成分确定的培养基，例如MATRIGEL^TM和蛋白质，例如血清蛋白或胞外基质蛋白培养未分化干细胞，但尚未鉴定到利用化学成分确定的培养基和合成的非蛋白质表面的完全不含动物产品的体系来长期培养未分化细胞。

简述

本发明描述了可用于在化学成分确定的培养基中培养包括干细胞和未分化干细胞的真核细胞的合成表面。在合成基材上培养时，未分化的干细胞可维持未分化5、7、10代或更多代。

在各种实施方式中，细胞培养制品包括具有表面的基材。将可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层设置在基材表面上。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层可由包含含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体、交联(二-官能或更高-官能)(甲基)丙烯酸酯单体和能与含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体及交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体的组合物形成。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层水中的平衡水含量为约5％-约70％。肽偶联于可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层(conjugate)。该肽含有RGD氨基酸序列。细胞培养制品可负载未分化干细胞，例如人胚胎干细胞在化学成分确定培养基中的培养和维持。

在各种实施方式中，制备细胞培养制品的方法包括将单体沉积在细胞培养制品的基材表面上。沉积在表面上的单体包括含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体、交联(甲基)丙烯酸酯单体和能与含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体和交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体。该方法还包括在基材表面上聚合单体以形成水中平衡水含量为约5％-约70％的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。该方法还包括将可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层与肽结合，所述肽可以是含RGD的多肽。

与现有的用于培养干细胞，特别是未分化干细胞的表面相比，本文的一个或多个实施方式提供一种或多种优点。例如，合成表面减少与具有得自或衍生自动物来源的组分的表面相关的潜在污染问题。与含生物学组分的表面相比，此类表面还可改善储存寿命。能在化学成分确定的培养基中培养未分化干细胞进一步减少了潜在的污染问题。此外，合成表面或化学成分确定的培养基的工作性能在批次之间的差异可能较低，从而改善培养结果和预计的重现性。结合附图阅读时，从以下详述不难理解这些和其它优点。

附图简述

图1A-1B是涂布合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的制品的侧视图。

图2A-2C是具有孔的细胞培养制品的截面的示意图。未涂布的表面(2A)；涂布表面(2B)；涂布的表面和侧壁(2C)。

图3A是偶联于多孔板中1微米厚的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的多肽的荧光强度图像。

图3B是偶联于多孔板中0.1微米厚的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的多肽的荧光强度图像。

图3C显示了涂布在1微米或0.1微米厚表面上的多肽浓度与荧光强度关系图。

图4显示了对由QuantiPro BCA试验获得的数据的多肽浓度与570nm吸光度关系图。

图5是多肽浓度与根据层粘连蛋白归一化的570nm吸光度的关系图，显示了为测定HT-1080与各种基材粘附而设计的试验的结果。

图6显示了在具有特定偶联多肽的可溶胀(甲基)丙烯酸酯基材上，用化学成分确定的培养基培养的未分化hESC的相对数量(根据AttoPhos荧光强度)。

图7A-7C是在MATRIGEL^TM基材(A)、含偶联肽(SEQ ID NO：4)(如图6中鉴定的)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯(B)、或单独可溶胀(甲基)丙烯酸酯(C)上，用化学成分确定的培养基培养的未分化人胚胎干细胞的集落图像。

图8显示了在偶联有各种浓度肽(SEQ ID NO：4)(如图6中鉴定的)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯上，用化学成分确定的培养基培养的未分化人胚胎干细胞的相对数量(根据AttoPhos荧光强度)。

图9显示了在可溶胀(甲基)丙烯酸酯基材的各种实施方式上，用化学成分确定的培养基培养的未分化人胚胎干细胞的相对数量(根据AttoPhos荧光强度)。

图10A和10B是可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂偶联于肽Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)之后的各实施方式中，在化学成分确定的培养条件下未分化H7hES细胞相对数量(根据AttoPhos荧光强度)的柱状图。

图11是在偶联于各实施方式的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的10-、100-和1000-浓度的1-FN(SEQ ID NO：12)、s-FN(SEQ ID NO：11)和Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)上培养的未分化H7hES细胞相对数量(根据AttoPhos荧光强度)的柱状图。

图12是显示HT-1080与偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的二硫键结合的环状多肽的相对附着(通过OD 570nm)的柱状图。

图13是显示HT-1080与偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的酰胺键结合的环状多肽的相对附着(通过OD 570nm)的柱状图。

图14是显示在偶联有酰胺键结合的环状多肽的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上培养的未分化H7hES细胞相对数量(通AttoPhos荧光强度)的柱状图。

图15是显示在偶联有二硫键结合的环状多肽的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上培养的未分化H7hES细胞相对数量(通AttoPhos荧光强度)的柱状图。

图16显示在MATRIGEL^TM(MG)表面、偶联有确定的含RGD肽(SEQ IDNO：4)(BSP)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层、和偶联有确定的含RGD肽与连接基团(BSP-PE04)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上，在化学成分确定的、不含动物产物的培养基条件下培养的未分化H7hESC的倍增时间。

图17A-17C比较了接种后第7天，人间充质干细胞(hMSC)在SAP-BSP肽-丙烯酸酯上与标准TCT塑料细胞培养器皿上的存活/增殖。

图18是比较在包括成分确定的培养基在内的不同培养基条件下，培养7天后TCT和SAP-BSP上hMSC细胞数量的柱状图。

图19比较了用本发明细胞培养表面的一种实施方式与MATRIGEL^TM涂层培养时，H7hESC在10代中的倍增时间。

图20显示了在MATRIGEL^TM对照或SAP-BSP表面培养10代的H7hESC的hESC-特异性标记的流式细胞术分析结果。

图21A是显示在SAP-BSP肽偶联的丙烯酸酯表面上分化的心肌细胞的辅肌动蛋白和Nkx2.5+染色的荧光图像。图21B显示α辅肌动蛋白的流式细胞术数据，图21C显示在本发明细胞培养表面的实施方式上自H7hESC分化的Nkx2.5心肌细胞的流式细胞术数据。

图22是比较有血清存在和没有血清存在的条件下，HT-108-细胞在TCT、SAP-BSP表面上的HT1080细胞增殖数据(通过490nm吸光度)的柱状图。

图23比较在有血清存在和没有血清存在的条件下，HT-1080细胞在TCT和(甲基)丙烯酸酯涂层和BSP偶联的涂层上的形态的图像。

图24是比较SA-P、胶原I和处理的Topas^TM上存活细胞估计数量(LDH活性的吸光度)的柱状图。

图1-2所绘附图不一定按比例。图1-2中所用的类似数字指类似的组分。然而，应该知道在给定附图中用某数字指代某组分并非限制另一附图中用相同数字标记的组分。此外，利用不同数字指代诸组分并非表示不同编号的组分不能相同或相似。

详述

以下详述参考构成其一部分的附图，显示的附图说明了装置、系统和方法的数个具体实施方式。要理解，也考虑了其它实施方式，可作出其它实施方式而不偏离本发明的范围或构思。因此，以下详述并非限制性的。

除非另有规定，本文使用的所有科学和技术术语具有本领域常规使用的含义。本文提供的定义有助于理解本文经常使用的某些术语，并不意味着限制本发明的范围。

除非文中另有明确表述，本说明书和随附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。除非文中另有明确表述，本说明书和随附权利要求书中使用的术语“或”通常按其包括“和/或”的意义使用。

就某种方法而言，本文所用的“提供”某制品表示制备、购买、制造、供应或以其它方式获得该制品从而该制品可用于该方法中。

肽序列在本文中以其单字母或三字母密码指代。这些密码可互换使用。

本文所用的“单体”表示能与另一单体聚合的化合物(无论该“单体”是与另一单体相同还是不同的化合物)，该化合物的分子量低于约1000道尔顿。在许多情况中，单体的分子量低于约400道尔顿。

本文所用的“合成涂层”或“合成聚合物层”表示设置在细胞培养基材上的聚合物材料层。聚合涂层不包括动物衍生的材料或成分。例如，合成涂层不具有从动物来源分离的蛋白质。在各实施方式中，本文所述的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层(SA)层提供合成涂层。在各实施方式中，合适的粘着多肽或多肽的组合可偶联于合成涂层，形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯-肽偶联层(SAP层)。

本文所用的“肽”和“多肽”表示可化学合成或可重组衍生，但不是作为完整蛋白自动物来源分离的氨基酸序列。为本发明的目的，肽和多肽不是完整的蛋白。肽和多肽可包含作为蛋白质的片段的氨基酸序列。例如，肽和多肽包含的序列可以是已知的细胞粘附序列，例如RGD。在一些实施方式中，本发明肽长3-30个氨基酸。在一些实施方式中，本发明肽是15聚体、12聚体、10聚体等。在各实施方式中，肽可包含接头序列，例如KGG(LysGlyGly)或KYG(LysTyrGly)，该接头序列提供Lys残基从而为肽偶联提供官能团。肽可以乙酰化(例如，Ac-LysGlyGly)或酰胺化(例如，SerLysSer-NH₂)以保护它们免于被，例如外肽酶切断。应该知道，公开某序列时，要考虑这些改进形式。在额外的实施方式中，肽可以偶联于间隔部分，例如PEO。PEO可以是，例如PEO₄或PEO₁₂或任何长度的间隔基团。

本文所用的“(甲基)丙烯酸酯单体”表示具有至少一个烯键式不饱和部分(丙烯酸酯部分或甲基丙烯酸酯部分)的化合物。本文所用的“聚(甲基)丙烯酸酯”表示由包括至少一种(甲基)丙烯酸酯单体在内的一种或多种单体形成的聚合物。

术语“水凝胶”已用于描述细胞培养表面。“水凝胶”定义各异，包括吸水量大于或等于其干重的30％或最高10,000％的凝胶或明胶。接触水时，水凝胶溶胀但不溶解。术语“水凝胶”是极为宽泛的术语，描述了具有宽泛的水溶胀和吸水特征的各种材料。

本文所用的“可溶胀的(甲基)丙烯酸酯”或“SA”表示用至少一种烯键式不饱和单体(丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯单体)制备的合成聚合物层，该单体至少具有一定交联程度，还具有吸水或水溶胀特征。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯可以是合成的。即，它们不含有衍生自动物或动物提取物的成分。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯可偶联于多肽或蛋白质(“可溶胀的(甲基)丙烯酸酯-多肽”、“SA-多肽”或“SAP”)。多肽或肽是蛋白质的片段，可以合成它们，从而将它们制成合成的、非动物来源的材料。可在动物来源的材料分离蛋白质。该SA和SAP材料可以指层、涂层、表面、材料或本领域已知指代适合细胞培养的表面的任何其它术语。可进一步鉴定具体的肽序列。例如，SAP表面可偶联于含RGD的多肽，可标识为SAP-RGD。或者，SAP表面可偶联于特定含RGD的肽，例如KGGNGEPRGDTYRAY(SEQ ID NO：4)，掺入小鼠骨头唾液(Bonesialo)蛋白(BSP)的RGD粘附表位，可偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯聚合物(SAP)从而形成SAP-BSP涂层。在本发明的实施方式中，术语“可溶胀的(甲基)丙烯酸酯”代表了吸水、在水中溶胀但不在水中溶解的各种交联的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯材料。可通过式1所示的平衡水含量(EWC)描述和检测该吸水特征：

式1：EWC(％)＝(W_凝胶-W_干)/(W_凝胶*100)

本文所用的“具有”、“包括”、“包含”等以其开放含义使用，通常表示“包括，但不限于”。应该知道，“基本上由...构成”、“由...构成”等归类在“包含”等内。因此，从包含亲水性单体、交联单体和含羧基单体的单体混合物形成的SA表面可以从基本上由，或由亲水性单体、交联单体和含羧基单体构成的混合物形成。

本发明描述了具有合成表面以供培养未分化干细胞的制品。所述表面可支持未分化干细胞在化学成分确定的培养基中增殖和维持。

1.细胞培养制品

参看图1A，示出了用于培养细胞的制品100的侧视图。该制品100包括具有表面15的基底材料基材10。将可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层20设置在基材或基底材料10的表面15上。尽管未示出，但要理解，将可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层20设置在基材或基底材料10的一部分上。基材或基底材料10可以是适于培养细胞的任何材料，包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物，它们的任意组合，或者一种材料在另一种材料上的涂层。此类基材或基底材料10包括玻璃材料，如钠钙玻璃、耐火玻璃、高硼硅酸耐热玻璃、石英玻璃；硅；塑料或聚合物，包括树枝状聚合物如聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-合-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环状烯烃聚合物、氟碳聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺；共聚物如乙酸乙烯酯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸酐共聚物、乙烯-丙烯酸共聚物或者它们的衍生物等。

本文所用的“环状烯烃共聚物”表示由多于一种单体形成的聚合物，其中至少一种单体是环状烯烃单体，至少一种其它单体不是环状烯烃单体。在许多实施方式中，用乙烯和降冰片烯(norbonene)单体形成环状烯烃共聚物。环状烯烃共聚物树脂可以商品名自波戴克塑料公司(Boedeker Plastics，Inc)商业购得。

适于细胞培养的制品100的例子包括单孔和多孔板，如6、12、96、384和1536孔板、罐、培养皿、烧瓶、多层烧瓶、烧杯、平板、滚瓶、载玻片(如有室和多室培养载玻片)、试管、盖玻片、袋、膜、中空纤维、珠和微载体、杯、旋转瓶、灌注室、生物反应器、和发酵罐。

可溶胀(甲基)丙烯酸酯(SA)涂层20提供在其上偶联一种或多种多肽70的表面25。当然，所述一种或多种多肽70还可在表面25之下的位置偶联于SA层20。本文所用“偶联于”表示共价结合。多肽70与SA层20的共价结合可通过连接基团发生。多肽70可以是环状或线形的，或可含有环状部分和线形部分。

出于本发明的目的，“肽”和“多肽”可互换使用。可将任何合适的SA涂层20施加于基材10的表面15上或在其上形成。在各种实施方式中，SA涂层包含一种或多种亲水性(甲基)丙烯酸酯单体、一种或多种二-官能或更高-官能(甲基)丙烯酸酯单体(“交联的”(甲基)丙烯酸酯单体)和一种或多种含羧基单体的反应产物，或基本上由所述反应产物构成或由它们构成。可利用任何合适的亲水性(甲基)丙烯酸酯单体。合适的亲水性(甲基)丙烯酸酯单体的例子包括甲基丙烯酸2-羟乙酯、二(乙二醇)乙基醚甲基丙烯酸酯、乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯等。在各种实施方式中，可利用除(甲基)丙烯酸酯以外的亲水性单体以形成SA涂层。除亲水性(甲基)丙烯酸酯单体外，可包含这些其它亲水性单体，或用这些其他亲水性单体替代。此类其它亲水性单体应能与用于形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层20的混合物中的(甲基)丙烯酸酯单体聚合。可用于形成SA涂层的其它亲水性单体的例子包括1-乙烯基-2-吡咯烷酮、丙烯酰胺、3-磺基丙基二甲基-3-甲基丙烯酰胺基丙基-铵等。无论使用(甲基)丙烯酸酯单体还是其它单体，在各种实施方式中，亲水性单体在水中具有一定溶解度，即在100克水中溶解1克或更多的单体。任何合适的二-官能或更高-官能(甲基)丙烯酸酯单体，例如二甲基丙烯酸四(甘醇)酯或二丙烯酸四(甘醇)酯可用作交联单体。可利用具有羧基官能团的任何合适(甲基)丙烯酸酯单体，从而能在单体通过聚合结合到SA涂层20后用于与多肽70偶联。羧基官能团能采用NHS/EDC化学方法偶联肽或多肽。合适的含羧基的(甲基)丙烯酸酯的例子包括丙烯酸2-羧乙酯和丙烯酸。

在各种实施方式中，从分别包含以下(以体积百分比计)的单体形成SA层20：亲水性(甲基)丙烯酸酯单体(约60-90)、含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体(约10-40)和交联(甲基)丙烯酸酯单体(约1-10)。应该知道可通过选择单体形成SA层的方式来控制SA层的平衡水含量(EWC)。例如，高度亲水性和较高百分比的亲水性单体应产生EWC较高的更可溶胀的SA层。然而，通过提高交联单体的百分比或增加其官能度会降低SA层的溶胀能力并降低EWC从而减弱该作用。

在各种实施方式中，选择用于形成SA层的具体单体和它们各自的重量或体积百分比使得到的SA层的EWC在约5％-约70％范围。部分由于本文所述各种实施方式的SA中使用含羧基的单体，EWC可以是pH依赖性的。例如，在磷酸缓冲液(pH 7.4)中，特定SA的EWC可能高于在蒸馏的去离子水(pH约5)中的。在各种实施方式中，某SA层在蒸馏去离子水中的EWC是本发明SA的在水中的EWC(水中)，在5％-70％、5％-60％、5％-50％、5-40％、5％-35％、10％-70％、10％-50％、10-40％、5％-35％、10％-35％或15％-35％范围。在进一步的实施方式中，可溶胀(甲基)丙烯酸酯与肽偶联后(SAP)，各实施方式的本发明SAP在水中的EWC可以是，例如10-40％(数据未显示)。

在细胞培养中，制备的表面长期接触水性环境。显著吸水的表面、高度水凝胶样的表面在接触水性环境时可能易于从基材脱层。当这些材料长期接触水性环境，例如细胞培养5天或更多天时，可能尤其如此。因此，SA和SAP层的EWC检测值最好较低，因而不会吸收太多的水以降低脱层可能性。例如，EWC低于40％的SA表面可能尤其适合支持包括人胚胎干细胞在内的细胞培养。

应该知道，多肽70与SA层20的偶联可影响SA层的可溶胀性和平衡水含量(EWC)，通常是增加EWC。偶联于SA层的多肽量可以不同，可根据SA层的厚度改变。因此按照标准方法制备的SA-多肽层的EWC可以不同。出于重现性的目的，优选先检测SA层的EWC再偶联于多肽。注意到这一现象，在一些实施方式中，SA与多肽偶联后(SA-多肽)，各种实施方式的SA-多肽层在水中的EWC可以是约10-40％。

在各种实施方式中，SA层20包括从包含甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸2-羧基乙酯和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯的混合物形成的聚合(甲基)丙烯酸酯单体。在许多实施方式中，用于形成SA层20的甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸2-羧基乙酯和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯的比例(以体积计)分别是约80/20/3(v/v/v)。在一些实施方式中，分别利用以下单体的液体试样(以体积计)配制SA：甲基丙烯酸羟乙酯(约60-90)、丙烯酸2-羧乙酯(约10-40)和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯(约1-10)。在许多实施方式中，SA层20基本上由聚合的甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸2-羧乙酯和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯单体构成。在各种实施方式中，SA层20基本上不含多肽交联剂。

在许多实施方式中，利用以下单体(以液体单体的体积或固体单体的重量计)配制SA：单体X(80)、丙烯酸2-羧乙酯(20)和二甲基丙烯酸四(甘醇)酯(3)。单体X是：甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸2-羟乙酯、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、或3-磺基丙基二甲基-3-甲基丙烯酰胺基丙基-铵。

任何合适的多肽70可偶联于SA层20。多肽70优选包含能偶联于SA层20的氨基酸；例如，通过含羧基(甲基)丙烯酸酯单体形成的游离羧基。例如，为偶联于SA层20，多肽70中可包含具有能进行亲核加成的官能团的任何天然或仿生氨基酸，例如通过形成酰胺键。赖氨酸、高赖氨酸(homolysine)、鸟氨酸和二氨基丁酸是具有合适特性以供偶联于SA层20的羧基的氨基酸的例子。此外，可利用多肽的N-末端α胺偶联于羧基，如果N-末端胺未加帽的话。在各种实施方式中，偶联于SA层20的多肽70的氨基酸位于多肽70的羧基末端位置或氨基末端位置。

在许多实施方式中，多肽70或其一部分具有细胞粘附活性，即，当多肽70偶联于SA层时，该肽使得细胞粘附于含有SA-P层的表面。例如，多肽70可包含胶原、角蛋白、明胶、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白等的氨基序列或其细胞粘附部分。在各种实施方式中，多肽70包括Yaa_lXaa_nArgGlyAspXaa_mYaa_l所示氨基酸序列(SEQ ID NO：1)(RGD)，其中Xaa和Yaa代表合成或天然的任何氨基酸，n和m可以是包括0的任何整数。本文所述的SA层提供可与任何合适的粘附多肽或多肽组合偶联的合成表面，从而提供组分未知的生物学基材或血清的备选方案。在目前的细胞培养实践中，已知一些细胞类型需要在培养表面上存在生物学多肽或肽的组合以便细胞粘附于该表面并持续培养。例如，有血清存在下，HepG2/C3A肝细胞粘附于塑料培养器皿。还知道血清可提供能粘附于塑料培养器皿的多肽，从而提供可粘附某些细胞的表面。然而，生物学来源的基材和血清含有未知的组分。对于导致细胞粘附的血清或生物来源基材的特定组分或组分(肽)组合已知的细胞，可合成那些已知的肽并施加于本文所述SA层以使细胞在不具有或几乎不具有来源或组成未知组分的合成表面上培养。

在一些实施方式中，肽70包括Yaa_lXaa_nArgGlyAspXaa_mYaa_l所示氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其中n是0-4的整数，m是0-5的整数，1是0或1，条件是肽70包含至少一个Yaa，各Xaa独立为任何天然或仿生氨基酸，Yaa是任何天然或仿生氨基酸，其中Xaa或Yaa具有能与SA表面的游离羧基进行亲核加成的官能团；例如通过形成酰胺键。在各种实施方式中，Xaa或Yaa可以是赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、二氨基丙酸或二氨基丁酸。

在一些实施方式中，多肽70包含ZaaXaa_nArgGlyAspXaa_mBaa所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中n是0-4的整数，m是0-5的整数，各Xaa独立为任何天然或仿生氨基酸，Zaa和Baa各自独立为任何天然或仿生氨基酸，在它们各自侧链的原子之间形成共价键，从而形成环状多肽或其一部分。在各种实施方式中，Zaa和Baa通过二硫键相连。例如，Zaa或Baa可以是半胱氨酸、高半胱氨酸或青霉胺。在一些实施方式中，Zaa和Baa通过酰胺键相连。例如，Zaa和Baa之一是侧链具有游离氨基的氨基酸，例如赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸或二氨基丁酸，Zaa和Baa中另一个是侧链具有游离羧基的氨基酸，例如天冬氨酸、谷氨酸或高谷氨酸(homoglutamic acid)。在一些实施方式中，SEQ ID NO：2所示多肽70可以进一步限定为包含Yaa₁Xaa_mZaaXaa_nArgGlyAspXaa_mBaa Xaa_mYaa_l所示氨基酸序列(SEQ IDNO：3)，其中n是0-4的整数，m是0-5的整数，l是0或1，条件是该多肽包含至少一个Yaa或Xaa，Yaa和Xaa各自独立为任何天然或仿生氨基酸，Zaa和Baa各自独立为任何天然或仿生氨基酸，在它们各自侧链的原子之间形成共价键，从而形成多肽的环状部分，Yaa或Xaa是任何天然或仿生氨基酸，其具有能与SA表面的游离羧基进行亲核加成的官能团；例如通过形成酰胺键。虽然不想受理论的束缚，但据信与相应的线形多肽相比，含RGD序列的多肽的环化可有助于在水性环境中维持构象结构以保留生物学功能，特别是当该多肽由较少的，例如少于10个氨基酸构成时。

在一些实施方式中，多肽70包含LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTry(SEQ ID NO：4)所示氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽70基本上由AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ ID NO：5)所示氨基酸序列构成。在一些实施方式中，多肽70基本上由LysGlyGlyLys⁴AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrAsp¹⁷(SEQ ID NO：6)所示氨基酸序列构成，其中Lys⁴和Asp¹⁷一起形成酰胺键以使多肽的一部分环化。在一些实施方式中，多肽70基本上由LysGlyGlyLys⁴GluProArgGlyAsp ThrTryArgAsp¹³(SEQ ID NO：7)所示氨基酸序列构成，其中Lys⁴和Asp¹³一起形成酰胺键以使多肽的一部分环化。在一些实施方式中，多肽70基本上由LysGlyGlyCys⁴AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrCys¹⁷(SEQ IDNO：8)所示氨基酸序列构成，其中Cys⁴和Cys¹⁷一起形成二硫键以使多肽的一部分环化。在一些实施方式中，多肽70基本上由LysGlyGlyCys⁴GluProArgGlyAspThrTryArgCys¹³(SEQ ID NO：9)所示氨基酸序列构成，其中Cys⁴和Cys¹³一起形成二硫键以使多肽的一部分环化。在各种实施方式中，多肽70基本上由XaaGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ IDNO：10)所示氨基酸序列构成，其中Xaa是任何氨基酸。在许多实施方式中，SEQ ID NO：10的Xaa是赖氨酸。在一些实施方式中，多肽70基本上由GlyArgGlyAspSerProLys(SEQ ID NO：11)所示氨基酸序列构成。

在一些实施方式中，多肽70基本上由LysGlyGlyAlaValThrGlyArgGlyAspSerProAlaSerSer(SEQ ID NO：12)所示氨基酸序列构成。

对于本文讨论的任何多肽序列，应该知道保守性氨基酸可取代特别鉴定的氨基酸。本文所用的“保守性氨基酸”指功能上类似于第二种氨基酸的氨基酸。此类氨基酸可按照熟知的技术在多肽中彼此取代而对该多肽的结构或功能干扰很小。以下5组各自含有彼此是保守性取代的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(I)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。

可利用连接基团或间隔基团80，例如重复的聚(乙二醇)连接基团或任何其它合适的连接基团增大多肽70与可溶胀(甲基)丙烯酸酯层20的表面25的距离。连接基团80可以是任何合适的长度。例如，如果连接基团是重复的聚(乙二醇)连接基团，该连接基团可含有2-10个重复的乙二醇单元。在一些实施方式中，所述连接基团是具有约4个重复乙二醇单元的重复聚(乙二醇)连接基团。多肽70的全部、一些通过连接基团80偶联于SA层20，或者都没有通过连接基团80偶联于合成聚合物层20。提供偶联基团的SA层链还可用作偶联肽的间隔基团。其它可能的连接基团是多肽接头，例如聚(甘氨酸)或聚(β-丙氨酸)。

多肽70可以任何密度，优选以适合于负载未分化干细胞或其它细胞类型培养的密度，偶联于SA层20。多肽70偶联于SA层20的密度可以是约1pmol/mm²-约50pmol/mm²的SA涂层20的表面25，可通过SAP层20均匀涂布表面15的实施方式中涂布的基底材料基材10的表面15的面积估算。例如，多肽的密度可以大于5pmol/mm²、大于6pmol/mm²、大于7pmol/mm²、大于8pmol/mm²、大于9pmol/mm²、大于10pmol/mm²、大于12pmol/mm²、大于15pmol/mm²或大于20pmol/mm²的SA涂层20的表面25。应该知道，多肽70的存在量可根据SA层20的组成、SA层20的厚度和多肽70本身的性质而变化。如以下实施例所述，多肽70的密度较高可更好地支持化学成分确定的培养基中未分化干细胞的粘附和增殖。

(甲基)丙烯酸酯单体可如本领域已知的合成得到或从商业零售商获得，例如聚合科学公司(Polysciences，Inc.)、西格玛阿尔得里奇公司(Sigma Aldrich，Inc.)和斯托默公司(Sartomer，Inc.)。连接基团80可如本领域已知的合成得到或从商业零售商获得，例如从量子生物设计公司(Quanta BioDesign，Ltd)购得的独立聚乙二醇(dPEG)连接基团。

如图1B所示，可将中间层30设置在基底材料10的表面15和SA涂层20之间。中间层30可设置为改善涂层20与基材10的结合，促进单体铺展，使得表面10的未涂布的诸部分排斥细胞(cytophobic)从而促进细胞在涂布区域生长，提供与单体或溶剂相容的基材(其中所述单体或溶剂与基底材料10不相容)，从而提供结构特征(如果需要的话，例如通过图案印刷等)。例如，如果基材10是玻璃基材，优选用环氧涂层或硅烷涂层处理玻璃基材的表面。对于各种聚合物基底材料10，优选提供聚酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯、聚乙烯或聚(甲基)丙烯酸酯的中间层30。尽管未示出，但要理解，可将SA涂层20置于中间层30的一部分上。还要理解，可将中间层30置于基底材料10的一部分上。

在各种实施方式中，通过物理或化学方法处理基底材料10的表面15以赋予表面15所需特性或特征。例如，如下所述，可电晕处理或等离子体处理表面15。真空或大气压等离子体的例子包括射频RF和微波等离子体(原发的和次生的)、介电势垒放电和分子或混合气体中产生的电晕放电，所述气体包括空气、氧气、氮气、氩气、二氧化碳、一氧化二氮或水蒸气。

SA涂层20，无论处于中间层30或基底材料10上，优选均匀涂布其下的基材。“均匀涂布”表示在给定区域，如培养皿的孔的表面中，层20以约5nm或更大的厚度完全涂布该区域。虽然表面上均匀涂布表面的厚度可以不同，但均匀涂布的表面中没有区域暴露出其下层(中间层30或基底材料10)。与均匀表面的细胞反应相比，非均匀表面的细胞反应更易变。

SA涂层20可具有任何所需厚度。在各种实施方式中，涂层20的平均厚度小于约10微米。例如，平均厚度可以小于约5微米，小于约2微米，小于约1微米，小于约0.5微米、约50nm-约300nm或小于约0.1微米。

形成SA层20的聚合物材料可有任何合适的交联度。低交联度可导致SA层部分或完全溶解和聚合反应效率较低。在各种实施方式中，SA层20的交联密度为约0.9％-约9％。

在许多实施方式中，制品100是具有适于细胞培养表面的细胞培养器皿，例如6、12、96、384和1536孔板、罐、培养皿、烧瓶、多层烧瓶、烧杯、平板、滚瓶、载玻片(如有室和多室培养载玻片)、试管、盖玻片、袋、膜、中空纤维、珠和微载体、杯、旋转瓶、灌注室、生物反应器、和发酵罐。在许多实施方式中，这些细胞培养表面包含在细胞培养孔中。现在参看图2，由基材或基底材料10形成的制品100可包括一个或多个孔50。孔50包括侧壁55和表面15。参看图2B-2C，可将SA涂层20设置在表面15或侧壁55(或者，如以上看图1所述，一个或多个中间层30可置于表面15或侧壁55或与SA涂层20之间)或其一部分上。如图2C所示，可用SA层20涂布侧壁55。

在各种实施方式中，制品100包括均匀涂布的层20，其具有面积大于约5mm²的表面25。表面25当然可以具有任何合适的尺寸。当表面15的面积太小时，不易观察到可靠的细胞反应，因为一些细胞如人胚胎干细胞作为细胞集落或簇(例如，具有约0.5mm的直径)接种，并且需要足够的表面以确保足量的集落粘附以产生定量的细胞反应。在许多实施方式中，制品100具有孔50，该孔具有均匀涂布的表面15，其中表面15的面积大于约0.1cm²，大于约0.3cm²，大于约0.9cm²，或者大于约1cm²。

2.合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的涂布

可通过任何已知的或将来开发的方法将合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯(SA)层设置在细胞培养制品表面。合成SA层优选提供在典型的细胞培养条件下不会发生脱层的均匀层。即，SA层结合于基材或基底材料。合成SA表面可通过共价或非共价相互作用连接于基底材料基材。可将合成SA表面与基材缔合的非共价相互作用的例子包括化学吸附、氢键、表面互相渗透、离子键、范德华力、疏水性相互作用、偶极子-偶极子相互作用、机械联锁和它们的组合。

在各种实施方式中，按照共同待批申请序列号_______________的揭示内容涂布基底材料基材表面，该申请在本文同一日期提交，Zhou等为发明人，名为“CELL CULTURE ARTICLE AND SCREENING(细胞培养制品和筛选)”，该申请出于所有目的通过引用全文纳入本文，其纳入程度以不与本发明冲突为限。

在许多实施方式中，单体沉积在细胞培养制品的表面上并原位聚合。在此类实施方式中，本文将基底材料称为“基材”，在其上沉积合成的可溶胀(甲基)丙烯酸酯材料。虽然可在液相或本体相中进行聚合，但在本发明的一些实施方式中，在本体相中聚合、原位聚合产生的细胞培养表面是网络化聚合表面。该网络化聚合表面不是相互渗透的聚合网络。在各实施方式中，在细胞培养相关时期，在细胞培养的水性环境中，原位聚合提供的网络化聚合表面结合于基材，不脱层并能存留。在各实施方式中，单体低于1000道尔顿。

由于单体是粘性的，优选先用合适的溶剂稀释单体以降低粘度，然后再分散到表面上。降低粘度能使得要形成的合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯材料层更薄且更均匀。本领域技术人员不难选择合适的溶剂。溶剂优选与形成细胞培养制品的材料和单体相容。优选对待培养的细胞无毒性且不干扰聚合反应的溶剂。此外，优选可以基本上完全除去或除去至无毒或不再干扰聚合程度的溶剂。在此类情况中，希望溶剂无需在严苛条件，例如中空或极端加热下即可方便除去。挥发性溶剂是此类不难除去的溶剂的例子。

在各种条件可适合于本文所述涂布制品的一些溶剂包括乙醇、异丙醇、乙酰乙酸酯(acetyl acetate)、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)。如在本文同一日期提交的，名为“CELL CULTURE ARTICLE ANDSCREENING(细胞培养制品和筛选)”的共同待批申请序列号_____________所述，当需要先除去溶剂再聚合时，挥发性溶剂，例如丙酮、甲醇、乙酸乙酯、丁酮、乙腈、异丙醇和2-丁醇及乙醇可能是特别适合的溶剂。

单体可用任何合适量的溶剂稀释单体以达到所需的粘度和单体浓度。根据本文的指导，所用的单体组合物通常含有约0.1％-约99％的单体。例如，可用乙醇或其它溶剂稀释单体以提供具有约0.1％-约50％单体、约.01体积％-约10体积％单体、约0.1体积％-约5体积％单体、或约0.1体积％-约1体积％单体的组合物。可用溶剂稀释单体，使可溶胀(甲基)丙烯酸酯层达到所需厚度。如上所述，如果沉积的单体太厚，可产生不均匀的表面，涂层可能在接触水性介质后发生脱层。

在各种实施方式中，将合成的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层设置在中间层的表面上，该中间层通过共价或非共价相互作用，直接或者通过一个或多个附加的中间层(未示出)与基底材料缔合。在此类实施方式中，本文将中间层称为“基材”，其上设置有合成的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。

在各种实施方式中，处理基底材料的表面。可对表面进行处理以改善合成的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层与基底材料表面的结合，以促进单体在基底材料表面上的铺展等。当然可因为与中间层类似的目的处理基底材料。在各种实施方式中，等离子体处理表面。此类处理获得的高表面能可促进单体铺展和均匀涂布。

除了形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的单体，形成所述层的组合物可包含一种或多种其它化合物，如表面活性剂、湿润剂、光引发剂、热引发剂、催化剂、活化剂和交联剂。

可使用任何合适的聚合引发剂。本领域技术人员能够容易地选择适用于单体的合适引发剂，例如自由基引发剂或阳离子引发剂。在各种实施方式中，使用UV光以产生自由基单体来引发链聚合。

可使用任何合适的聚合引发剂。聚合引发剂的例子包括有机过氧化物、偶氮化合物、醌、亚硝基化合物、酰基卤、腙、巯基化合物、吡喃鎓(pyrylium)化合物、咪唑、氯三嗪、苯偶姻、苯偶姻烷基醚、二酮、苯基酮或其混合物。合适的市售紫外活化和可见光活化的光引发剂的例子例如IRGACURE 651、IRGACURE 184、IRGACURE 369、IRGACURE 819、DAROCUR 4265和DAROCUR 1173，可商品化购自纽约州塔利顿希巴特殊化学品公司(CibaSpecialty Chemicals)，以及LUCIRIN TPO和LUCIRIN TPO-L，商品化购自巴斯夫公司(BASF，北卡罗来纳州夏洛特)。

在合适的引发剂体系中也可包含光敏剂。代表性的光敏剂具有羰基或叔氨基或其混合物。具有羰基的光敏剂包括二苯甲酮、苯乙酮、苯偶酰、苯甲醛、邻氯苯甲醛、呫吨酮、噻吨酮、9，10-蒽醌和其它芳族酮。具有叔胺的光敏剂包括甲基二乙醇胺、乙基二乙醇胺、三乙醇胺、苯基甲基乙醇胺和二甲基氨基乙基苯甲酸酯。可商品化购得的光敏剂包括购自比德尔索尔公司(Biddle SawyerCorp.)的QUANTICURE ITX、QUANTICURE QTX、QUANTICURE PTX、QUANTICURE EPD。

光敏剂或光引发剂体系的用量通常可在约0.01-10重量％范围不等。

阳离子引发剂的例子包括鎓阳离子的盐，如芳基锍盐，以及有机金属盐如离子芳烃体系。

在先用溶剂稀释单体然后再沉积在基材表面上的各种实施方式中，先除去溶剂然后再进行聚合。可通过任何合适的机制或方法除去溶剂。通常可在聚合之前除去约90％或更多、约95％或更多或约99％或更多的溶剂。如在本文同一日期提交的，Zhou等为发明人，名为“CELL CULTURE ARTICLEAND SCREENING(细胞培养制品和筛选)”的共同待批申请序列号___________所述，发现在固化之前除去基本上所有溶剂应能更好地控制固化动力学和单体的转化量。当单体的转化率提高时，降低废物产生和细胞毒性。

将单体聚合以形成合成的可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面。无论在本体相(基本上不含溶剂)还是在溶剂相中聚合，通过合适的引发机制聚合单体。许多此类机制是本领域熟知的。例如，可升高温度以活化热引发剂，可通过接触合适波长的光来活化光引发剂，等等。按照许多实施方式，利用紫外光固化单体或单体混合物。优选在惰性气体保护下进行固化，例如氮气保护以防氧抑制。联用合适的紫外光与气体保护可提高聚合物转化率，确保涂层完整性并降低细胞毒性。

可用溶剂洗涤固化的合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层一次或多次以除去杂质，例如未反应的单体或低分子量聚合物。在各种实施方式中，用乙醇或乙醇-水溶液洗涤该层，例如70％乙醇、高于90％乙醇、高于95％乙醇或高于99％乙醇。用70％乙醇溶剂洗涤不仅用于除去可能具有细胞毒性的杂质，还可用于在培育细胞之前对表面灭菌。

根据本文揭示的内容制备的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层形成单一的聚合基质层。虽然此类层可包括结构和特性的局部变异，但这些变异可能是随机的，这与他人所述相互渗透网络相反。如上所述，在许多实施方式中，本文所述的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层是在接触细胞培养制品的基材之时自单体原位聚合。

可通过任何合适的技术将多肽偶联于聚合的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。可通过氨基端基的氨基酸、羧基端基的氨基酸或内部氨基酸将多肽偶联于聚合的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层20。一种合适技术包括本领域通常知晓的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学方法。EDC和NHS或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)可与可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层的羧基反应，从而产生胺反应活性NHS酯。EDC与可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层的羧基反应从而产生易水解的胺-反应活性邻-酰基异脲(O-acylisourea)中间体。胺-反应活性邻-酰基异脲中间体因加入NHS或磺基-NHS将其转化为胺反应活性NHS或磺基-NHS酯而得到稳定，从而能进行两步过程。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层活化后，然后可加入多肽，多肽的氨基末端胺可与胺反应活性酯反应以形成稳定的酰胺键，因而将多肽偶联于可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层。当采用EDC/NHS化学方法将多肽偶联于可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层时，N-末端氨基酸优选含胺的氨基酸，例如赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸。当然，可利用任何可接受的亲核试剂，例如羟胺、肼、羟基等。

EDC/NHS化学方法导致多肽70与可溶胀(甲基)丙烯酸酯层20零长度交联。可将含末端胺的连接基团或间隔基团，例如聚(乙二醇)连接基团(例如，量子生物设计公司)加入肽70的N-末端氨基酸。当将连接基团加入N-末端氨基酸，该连接基团优选N-PG-酰氨基-PEG_X-酸，其中PG是保护基团，例如Fmoc基团、BOC基团、CBZ基团或适合肽合成的任何其它基团，X是2、4、6、8、12、24或可用的任何其它不连续PEG。

在各种实施方式中，将1微米-2500微米多肽液体组合物，例如溶液、悬液等与活化的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层接触以偶联该多肽。例如，多肽浓度可以是约100μM-约2000μM、约500μM-约1500μM、或约1000μM。应该知道可改变多肽组合物的体积和浓度以实现偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的多肽的所需密度。

多肽可以环化或包括环状部分。可采用形成环状多肽的任何合适方法。例如参考以下实施例4，通过环化合适氨基酸侧链上的游离氨基官能团与合适氨基酸侧链的游离羧基可产生酰胺键。仍参考以下实施例4，可在肽序列中侧链合适氨基酸的游离巯基之间产生二硫键。可采用任何合适的技术形成环状多肽(或其诸部分)。例如，可采用例如WO1989005150所述方法形成环状多肽。可利用在多肽的羧基端基和氨基端基之间具有酰胺键的头-对尾环状多肽。二硫键的一种替代方式是利用两个硒代半胱氨酸的二硒键(diselenide bond)或混合的硒化物/硫化物键，例如Koide等，1993，Chem.Pharm.Bull.41(3)：502-6；Koide等，1993，Chem.Pharm.Bull.41(9)：1596-1600；或Besse和Moroder，1997，Journal of Peptide Science，第3卷，442-453所述。

3.在含有偶联多肽的合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上温育细胞

如上所述具有偶联多肽的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的细胞培养制品可用细胞接种。细胞可以是任何细胞类型。例如，细胞可以是结缔组织细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、骨骼或肌肉细胞、心肌细胞、肠细胞、肾细胞或其它器官的细胞、干细胞、胰岛细胞、血管细胞、淋巴细胞、癌细胞、原代细胞、细胞系等。所述细胞可以是哺乳动物细胞，优选人细胞，但也可以是非哺乳动物细胞，例如细菌、酵母菌或植物细胞。

在许多实施方式中，细胞是干细胞，本领域通常理解的干细胞指具有连续分裂能力(自我更新)并能分化成各种专门细胞的细胞。在一些实施方式中，干细胞是可自对象的器官或组织分离的多能、全能或多潜能干细胞。此类细胞能产生完全分化或成熟的细胞类型。干细胞可以是骨髓衍生的干细胞(自体或其它的)、神经元干细胞或胚胎干细胞。干细胞可以是干蛋白阳性的。干细胞可以是造血干细胞。干细胞可以是衍生自上皮和脂肪组织、脐带血、肝脏、脑或其它器官的多谱系细胞。在各种实施方式中，干细胞的多能干细胞，例如分离自哺乳动物的多能胚胎干细胞。合适的哺乳动物可包括啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，灵长类动物，包括人和非人灵长类动物。在各种实施方式中，可溶胀(甲基)丙烯酸酯-多肽层支持胚胎干细胞未分化培养5代或更多代、7代或更多代或10代或更多代。干细胞达到约75％汇合后，通常将它们传代至新平面。细胞达到75％汇合的时间取决于培养基、接种密度和本领域已知的其它因素。现已发现如以下实施例所述培养的干细胞达到约75％汇合在约3天-约7天，通常是约5天。

由于人胚胎干细胞(hESC)能以未分化状态连续培养生长，可从已建立的细胞系获得本发明所用的hESC。已建立的人胚胎干细胞系的例子包括但不限于：H1、H7、H9、H13或H14(得自威斯康星大学建立的WiCell)(Thompson(1998)Science 282：1145)；hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03(BG公司(BresaGen，Inc.)，雅典，佐治亚州)；HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(EC国际公司(ES Cell International，Inc.)，新加坡)；HSF-1、HSF-6(加利福尼亚大学旧金山分校)；I 3、I 3.2、I 3.3、I 4、I 6、I 6.2、J 3、J 3.2(以色列工学院(Technion-Israel Institute of Technology)衍生的，海法，以色列)；UCSF-1和UCSF-2(Genbacev等.，Fertil.Steril.83(5)：1517-29，2005)；细胞系HUES 1-17(Cowan等.，NEJM 350(13)：1353-56，2004)；和细胞系ACT-14(Klimanskaya等.，Lancet，365(9471)：1636-41，2005)。还可从原代胚胎组织直接获得本发明所用的胚胎干细胞。通常使用其它情况下要弃去的胚泡阶段的体外冷冻受精卵来进行。

其它合适的多能干细胞包括诱发的灵长类多能干(iPS)细胞。iPS细胞指得自青少年或成年哺乳动物如人的细胞，其是遗传修饰的，例如通过用一种或多种合适的载体转染，从而它们经重新编程获得多能干细胞如hES细胞的表型。由这些重新编程细胞获得的表型特点包括分离自胚泡的形态类似干细胞，以及表面抗原表达、基因表达和端粒酶活性类似的胚泡衍生的胚胎干细胞。iPS细胞通常具有从各原生胚层：外胚层、内胚层和中胚层分化成至少一种细胞类型的能力，因此适于分化成各种细胞类型。iPS细胞如hESC在注入免疫缺陷小鼠如SCID小鼠中时也形成畸胎瘤(Takahashi等，(2007)Cell 131(5)：861；Yu等，(2007)Science 318：5858)。

接种细胞之前，可收集细胞并悬浮在合适的介质，例如生长培养基中，细胞一旦接种在表面上即在其中培养。例如，可将细胞在含血清培养基、条件化培养基或化学成分确定的培养基中悬浮并培养。本文所用的“化学成分确定的培养基”表示不含组成未知的组分的细胞培养基。在各实施方式中，化学成分确定的细胞培养基可不含组成未知的蛋白质、水解物或肽。在一些实施方式中，条件化培养基含有组成已知的多肽或蛋白质，例如重组生长激素。由于化学成分确定的培养基的所有组分具有已知的化学结构，培养条件和由此的细胞反应的可变性降低，从而增加了再现性。另外，减少了污染的可能性。此外，至少部分因为上述原因而更易于放大。化学成分确定的细胞培养基可购自英杰公司(Invitrogen Corporation，1600法拉第大街，PO Box 6482，卡尔斯巴德，加州92008)的StemPro，其一种完全确定的，不含血清的培养基(SFM)，特别为胚胎干细胞的生长和扩增而配制；隆萨公司(Lonza)的XVivo-10和干细胞技术公司(StemCell Technologies，Inc.)的用于人胚胎干细胞的mTeSR^TM1维持培养基。

可将一种或多种生长或其它因子加入培育细胞与偶联于多肽的合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层(SAP)的培养基中。这些因子可有助于细胞增殖、粘着、自我更新、分化等等。可加入或包含在培养基中的因子的例子包括肌肉形态发生因子(MMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素、神经生长因子(NGF)、促红细胞生成素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、重组人活化素(activin)A(ACT)，例如重组人活化素A，造血生长因子、视黄酸(RA)、干扰素、成纤维细胞生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、肽生长因子、肝素聚合生长因子(HBGF)、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子、胰岛素-样生长因子(IGF)I和II、转化生长因子，例如转化生长因子-β1(TGFβ1)和集落刺激因子。

可采用任何合适的浓度接种细胞。通常，以约10,000-500,000个细胞/平方厘米基材接种细胞。例如，可以约50,000-150,000个细胞/平方厘米基材接种细胞。然而，不难采用更高和更低的浓度。培育时间和条件，如温度、CO₂和O₂水平、生长培养基等将取决于所培养细胞的性质并且不难改进。可根据所需的细胞反应来改变细胞在表面上培育的时间量。

可为任何合适的目的使用培养的细胞，包括：(i)在化学成分确定的培养基中获得在合成表面上培养的足够量的未分化干细胞用于研究或开发治疗应用；(ii)研究培养的细胞；(iii)开发治疗应用；(iv)治疗目的；(v)研究基因表达，例如通过产生cDNA文库；和(vi)研究药物和毒性筛选。

如以下实施例中详述的，现已发现干细胞，例如胚胎干细胞的未分化阶段可在具有SA-P基材的制品上维持5、7或10代或更多代。在各种实施方式中，每次传代后，50％或更多、60％或更多、70％或更多或80％或更多的细胞维持未分化。测定细胞是否分化的一种合适方法是测定OCT4标记是否存在，例如以下实施例中详述的。在各种实施方式中，在SA-P表面培养5、7或10代或更多代的未分化干细胞保留分化能力。

下文提供了描述上述制品和方法的各种实施方式的非限制性例子。

实施例

实施例1：涂布制品

由紫外可聚合的单体制备可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层表面，该涂层表面包含亲水性单体、含羧基单体和交联单体。表1显示所用的可溶胀(甲基)丙烯酸酯单体的组合。如表1所示，制剂SA1A和SA1具有相同的单体组成。它们彼此不同之处在于用乙醇将SA1A稀释成0.1％浓度v/v，而用乙醇将SA1稀释成0.25％v/v浓度或更高一些。用乙醇稀释的单体的稀释度示于表3。表2显示了所用单体的化学结构。

表1.所用的可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂

表2：单体的结构

简言之，用乙醇将单体稀释至0.1体积％或0.25体积％的浓度，加入Durocur 1173(3％体积/单体体积)光引发剂。利用生物技术精确移液系统(BioTek Precision Pipetting System)将2微升体积的稀释单体可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂加入经等离子体处理的环状烯烃共聚物96孔板(康宁生命科学开发组(Corning Life Science Development group)提供)的孔中。

各孔接收预定的可溶胀(甲基)丙烯酸酯单体制剂，其中一些孔涂布有MATRIGEL^TM作为阳性对照。施加涂层获得的平均厚度为小于或等于0.5微米。除非另有表述，得到的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的平均厚度约为0.1微米。对于涂布有可溶胀(甲基)丙烯酸酯单体制剂的孔，室温下在通风橱中蒸发3小时以除去乙醇溶剂。然后在N₂吹扫的盒中(具有熔凝二氧化硅窗)，用13mW/cm²脉冲(100Hz)的紫外光(Xenon RC-801)固化涂层1分钟。

对于许多可溶胀的(甲基)丙烯酸酯制剂，用5微升0.1v/v％丙烯酸单体的乙醇溶液或2微升0.25v/v％丙烯酸单体的乙醇溶液涂布96-孔板的孔，获得5纳升单体/孔，涂层厚度为0.13-0.20微米。所用的各种制剂和浓度及体积列于下表3。

表3：施加的可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂和浓度/体积

实施例2：多肽偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面

在设计评估多肽与上述制备的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层偶联的一系列实验中，将多肽(Ac-ArgGlyGlySerAspProIleTyrLys-NH₂(SEQ ID NO：3)/Rhod-GlyArgGlyAspSerProIleIleLys-NH₂(SEQ ID NO：4))的混合物偶联于包含1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学物质的制剂SA1A的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层(参见表1、2和3)。简言之，将50μL 0.1mM EDC和0.05mM NHS的DMF溶液分散在涂布有可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂的96-孔环状烯烃共聚物平板的孔中。活化羧基1-1.5小时，然后吸出活化溶液。然后立即将在25mM磷酸缓冲液pH 7.4配制的50μL多肽溶液分散入孔中，环境条件下，孔表面NHS酯与肽伯胺基团之间反应1.5小时，然后吸出肽溶液。然后立即将水配制的50μL 1M乙醇胺(pH 8.0-8.5)分散入孔中，环境条件下进行封端反应1.5小时。随后吸出封端溶液，孔用磷酸缓冲液，1％SDS溶液，最后用去离子水洗涤。利用Tecan微阵列扫描仪定量测定荧光。或者，采用西格玛-阿尔得里奇公司的商品化QuantiPro BCA测定试剂盒定量测定多肽。肽溶液总共含有1000μM、100μM、50μM、10μM、5μM、1μM或0μM的肽。

表4：偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面并在hESC培养物中测试的肽

许多这些序列在N-末端具有Lys-Gly-Gly(KGG)氨基酸序列。Lys氨基酸具有含氨基的侧链，将该氨基酸用于使肽偶联于活化的(甲基)丙烯酸酯涂层。Gly-Gly氨基酸用作间隔基团以使推定的RGD表位突出离开涂布表面从而能优化肽与细胞表面受体的生物-特异性相互作用。据信，连接序列不是必需的，或者可使用较短的序列。备选或者附加，可利用非氨基酸连接基团(例如聚环氧乙烷连接基团等)作为间隔基团(参见，例如图6)。应该知道，各实施方式的本发明肽序列中可存在或不存在该序列。

图3显示关于肽(Ac-ArgGlyGlySerAspProIleTyrLys-NH₂(SEQ IDNO：27)/Rhod-GlyArgGlyAspSerProIleIleLys-NH₂(SEQ ID NO：28))混合物与如上所述制备的制剂SA1A的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层偶联的能力的荧光数据。图3A是与平均约1微米厚的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层偶联的肽的荧光强度图像，肽浓度从0升高至1000μM。图3B是与平均约0.1微米厚的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层偶联的肽的荧光强度图像，肽浓度从0提高至1000μM。图3C是涂布于1微米或0.1微米厚度表面上的肽的浓度与荧光强度的关系图。如图3所示，偶联于涂层的肽量随着偶联缓冲液中肽浓度而升高。采用相同方案与肽偶联的两种厚度(1微米和0.1微米)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的荧光强度提示肽固定在涂层表面，而不是均匀贯穿可溶胀(甲基)丙烯酸酯的主体中。如果是均匀贯穿可溶胀(甲基)丙烯酸酯的主体中，可以预计这两种涂层的荧光强度有数量级上的差别。

图4显示实施例2所述的QuantiPro BCA测定的结果。分析肽偶联的可溶胀(甲基)丙烯酸酯获得570nm的吸光度为0.076AU。在1-15μg/ml观察到线性关系(如图中直线所示)。虽然结果数据接近检测极限(1μg/ml)，但得到的密度与荧光实验获得的密度良好对应(BCA为5.6pmol/mm²，荧光为8.6pmol/mm²)。

实施例3：HT-1080细胞粘附和增殖试验

为评估采用这些偶联方法与各实施方式的可溶胀(甲基)丙烯酸酯偶联的多肽使得细胞粘附和增殖的能力，将肽Ac-LysTyrGlyArgLysArgLeuGlnValGlnLeuSerIleArgThr-NH₂(SEQ IDNO：22)(AG-73，粘附肽)和Ac-Ac-GlyArgGlyGluSerProIleTyrLys-NH₂(SEQID NO：30)(RGE，阴性对照)偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯(如上所述)，评估HT-1080人纤维肉瘤细胞与可溶胀(甲基)丙烯酸酯的粘附。简言之，室温下涂布层粘连蛋白(5μg/mL，西格玛-阿尔得里奇公司)对照孔1小时。37℃，用在磷酸缓冲盐水(PBS)配制的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭所有孔。先用PBS简单洗涤诸孔，再与0.1％BSA在Iscove的改进Dulbecco培养基(IMDM)中温育，然后接种细胞。在标准细胞培养条件下，用含10％FBS(隆萨公司(Lonza))的IMDM(隆萨公司)将HT-1080人纤维肉瘤细胞(ATCC编号：CCL-121)培养至90％汇合。胰蛋白酶处理细胞，37℃，5％CO₂下在含10％FBS的IMDM中恢复30分钟。恢复后，洗涤细胞，重悬在IMDM配制的0.1％BSA中，以30,000个细胞/孔的密度接种到肽偶联的平板上。在标准细胞培养条件下进行细胞粘附1小时。从孔中吸出培养基，固定粘附细胞，室温下用20％甲醇配制的50微升0.2％结晶紫染色8分钟。先在5分钟期间加入水配制的1％SDS，然后检测570nm的吸光度来定量测定细胞对结晶紫的吸收。对于该试验，多肽偶联后，可溶胀(甲基)丙烯酸酯上的其余NHS酯与乙醇胺或氨基丙基吗啉反应以降低可溶胀(甲基)丙烯酸酯对结晶紫染料的吸收。

图5显示HT-1080粘附试验的结果，其显示HT-1080细胞粘附于各实施方式的本发明SAP表面，如实施例3所述。根据层粘连蛋白上的细胞数量将可溶胀(甲基)丙烯酸酯-肽表面上粘附细胞的相对数量(通过OD 570nm)归一化。测试100微米AG-73(SEQ ID NO：24)、10、1和0μM浓度的肽。获取OD 570nm检测值，将读数相对于层粘连蛋白粘附归一化。“AG-73”是SAP-AG-73(SEQ ID NO：24)。“bAG-73”是SAP-AG-73(SEQ ID NO：24)，其在多肽偶联前先用乙醇胺封端。“RGE”是SAP-RGE(SEQ ID NO：30)。RGE是非粘附肽。

HT-1080细胞专门粘附于粘附肽Ac-LysTyrGlyArgLysArgLeuGlnValGlnLeuSerIleArgThr-NH₂(SEQ ID NO：22)(AG-73)，不粘附于在肽偶联前用乙醇胺封端的表面(1)(显示为bAG-73或封端的AG-73)或偶联有非粘附肽Ac-GlyArgGlyGluSerProIleTyrLy-NH₂(SEQ ID NO：30)(RGE)的(2)。100μM肽溶液和10μM AG-73肽溶液获得粘附表面，而1μM AG-73肽溶液未获得粘附表面。几乎没有细胞粘附于SAP-bAG-73，表明AG-73特异性吸附于合成的聚合表面。

实施例4：培养未分化干细胞的试验

如表4所列，选择细胞粘附肽与hESC联用。该多肽列表所含的肽已证明靶向两种重要的细胞受体类别，整联蛋白和硫酸类肝素蛋白多糖(HSPG)。这些肽还包括层粘连蛋白的各种结构域和链的序列。还包括其它蛋白的细胞粘附肽。

为筛选表4所示肽向未分化hESC的粘附特性提供满意细胞培养表面的能力，利用1000μM溶液将肽偶联于制剂SA1A的可溶胀(甲基)丙烯酸酯(参见表1、2和3)。肽购自GS公司(GenScript Corporation)。所有肽在C-末端酰胺化。向所选肽的N-末端加入聚乙二醇(PEG)重复单元的间隔基团。例如，PEO₄指四个乙二醇重复单元，PEO₁₂指12个乙二醇重复单元。间隔基团含有端基胺。由GS公司将间隔基团加入多肽。

将各种肽浓度(1000μM、100μM、10μM、1μM和0μM)的Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH₂(SEQ IDNO：4)(BSP序列)偶联于上述制剂SA1、SA1A和SA5的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层。

先通过喷雾70％乙醇对所有实验平板进行灭菌，再进行细胞接种，层流罩中干燥并用200微升Dulbecco的磷酸缓冲盐水(DPBS)洗涤五次。用补加了80ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(研发系统公司(R&DSystems)，目录号234-FSE/CF)和0.5ng/ml转化生长因子-β1(TGFβ1)(研发系统公司，目录号240B)的100微升化学成分确定的培养基Xvivo10(隆萨公司，目录号04-743Q)，将H7hES细胞以35,000个细胞/孔(96-孔板)的密度接种在肽偶连的可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面。MATRIGEL^TM(MG)-涂布诸孔用作未分化hES细胞粘附的阳性对照。在标准细胞培养条件下(37℃，5％CO₂)培养细胞48小时，然后固定和加工以供AttoPhos试验来检测碱性磷酸酶活性，其是未分化hES细胞的已知标记，和/或如下所述作BCIP染色。

实施例5：AttoPhos筛选

如下所示进行AttoPhos筛选。简言之，温育结束时，用150微升DPBS清洗细胞，室温下用4％低聚甲醛固定10分钟(70微升/96-孔板的每孔)。用150微升DPBS洗涤细胞一次，用100微升碱性磷酸酶的AttoPhos荧光底物(普罗迈格公司(Promega))(DPBS作1∶3稀释)避光处理10分钟。利用PE公司(Perklin Elmer)的维克多3微板读数计获得485/535nm的AttoPhos荧光强度。实验表面的AttoPhos荧光强度表示为MATRIGEL^TM对照％。

实施例6：BCIP/NBT染色

如下所示进行hES细胞的(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)/四唑氮蓝(NBT)染色以便评估集落形态。简言之，获得AttoPhos荧光强度读数后，用150微升DPBS洗涤细胞，进行BCIP染色以评估细胞集落形态。将70微升BCIP/NBT加入各孔，室温下温育20-30分钟并温和搅拌(以获得所需的颜色强度)。染色结束时，用150微升DPBS洗涤细胞一次，用光学显微镜扫描或分析。将实验表面上的H7hES集落形态与MATRIGEL^TM(阳性对照)上的集落形态作比较。

图6显示利用制剂SA1A筛选未分化干细胞的肽支持物的筛选试验结果。与MATRIGEL^TM对照相比，Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ IDNO：4)，BSP序列显示了显著的支持未分化干细胞的能力(56-60％AttoPhos荧光强度(FI))。一些肽偶联于PEO间隔基团/连接基团(SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26)，如下所示：NH₂PEO₄-ArgAsnIleAlaGluIleIleLysAspIle-NH₂(SEQ ID NO：25)或NH₂-PEO₄-LysAlaPheAspIleThrTyrValArgLeuLysPhe-NH₂SEQ ID NO：26)，其中PEO可以是PEO₄或PEO₁₂。如图7所示，如通过细胞的BCIP染色评估，在含有Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ IDNO：4)，BSP序列的表面上培养的干细胞集落(图7B)显示与MATRIGEL^TM(图7A)相似的集落形态。单独在可溶胀(甲基)丙烯酸酯基材(制剂编号1)上未观察到干细胞生长(图7C)。图8显示AttoPhos测量值，以MATRIGEL^TM性能百分比表示，对SA1制剂，随肽浓度(为1、10、100和1000μM)逐级升高。如图8所示，未分化干细胞在含有Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)，BSP序列的可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂SA1A表面上的粘附和生长是肽浓度依赖性的。这些数据整体上提示在化学成分确定的培养基条件下，采用1000μM浓度偶联的Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQID NO：4)，BSP序列可支持未分化H7hES细胞粘附和生长。

现在参看图9，可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层的制备方式和可溶胀(甲基)丙烯酸酯的组分影响Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)，BSP序列支持未分化干细胞生长的能力。CB/TOP是未涂布的环状烯烃共聚物细胞培养器皿(等离子体处理的)。SA1A是偶联和未偶联Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂(如图6中标示的)。SA5是表1所示的另一种偶联和未偶联的Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂。MG是MATRIGEL^TM对照。如图9所示，，制剂SA5不提供在有化学成分确定的培养基存在下负载培养未分化hES细胞的涂层，与MATRIGEL^TM所示相当。不想受理论的束缚，但这可能是因为有显著量的聚(乙二醇)600而没有在两端共聚的丙烯酸羧乙酯，从而可能在SA表面上产生刷状层(brush layer)，而非聚合物网络。如图9所示，偶联于制剂SA1的Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)，BSP序列导致与MATRIGEL^TM对照相当的AttoPhos FI。这与制剂SA1A不同，后者与Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)，BSP序列偶联显示约60％的MATRIGEL^TM AttoPhos FI(如图6和图8所示)。如上所述，制剂SA1和SA1A的组分基本上相同，只有制备涂层的方式不同(SA1A：0.1％、5微升；SA1：0.25％、2微升)。涂层的厚度可能是至关重要的。例如，在各实施方式中，将SA涂层厚度维持在0.5微米以下可能是至关重要的。因此，制备可溶胀(甲基)丙烯酸酯基材的方式以及化学组成和可溶胀(甲基)丙烯酸酯结构可影响肽-偶联的可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面支持在化学成分确定的培养基中培养未分化干细胞的能力。

实施例7：测试与Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)，BSP序列偶联的其它SA涂层

制备偶联于Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)，BSP序列的其它可溶胀(甲基)丙烯酸酯层(SA层或涂层)，按照以上实施例测试。图10A和10B是在化学成分确定的培养基条件下，未分化H7hES细胞在与肽Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)偶联后的不同可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂上的粘附和生长的AttoPhos检测值的柱状图。相对于MATRIGEL^TM上细胞的荧光强度(FI)，将所有筛选表面上细胞的AttoPhos FI归一化(图10)。与MATRIGEL^TM对照相比，图10A和10B中报道的所有可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂显示相似或更高的AttoPhos FI，而细胞的BCIP染色评估到集落形态类似于MATRIGEL^TM(数据未显示)。

对于图10中报道的可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂，从高度亲水性单体例如丙烯酰胺，或中等亲水性单体例如甲基丙烯酸羟丙酯聚合网络。亲水性单体的比例为60-90％。含羧基的功能单体的比例为10％-30％。交联单体的比例为1％-10％。与BSP-RGD肽Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQID NO：4)偶联后，在化学成分确定的无动物条件下，所有测试的制剂与阳性对照MATRIGEL^TM相比，支持相似或更高的hESC粘附。

实施例8：测试偶联于SA1的其它肽

在以上实施方式中，Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)，BSP肽显示当偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯聚合物层时负载在化学成分确定的无动物条件下培养未分化的hESC。Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQID NO：4)，BSP肽掺入小鼠的Bonesialo蛋白(BSP)的RGD粘附表位。现已鉴定了其它含RGD的肽。然而，对于每一种细胞类型，不是所有的RGD序列可获得相同水平的细胞培养性能。一些细胞类型可在不同的特定肽上培养更好。侧接RGD基序的序列可显著影响细胞粘附程度并影响粘附后的分化过程。不想受理论的束缚，但整联蛋白介导的细胞粘附可能包括细胞粘附的多种细胞事件，包括细胞扩散及张力丝(stress fiber)和粘着斑(focaladhesion)。不想受理论的束缚，但肽偶联的(甲基)丙烯酸酯支架可能允许这些整联蛋白介导的细胞结合事件。在本实施例中，研究了偶联含不同RGD的肽对各实施方式的SA涂层的影响。具体地说，提供了显示未分化干细胞对偶联于(甲基)丙烯酸酯涂层的各实施方式的RGD肽的反应的数据，其中所述RGD表位衍生自人纤连蛋白。

纤连蛋白是细胞粘附蛋白。以前鉴定了具有纤连蛋白的细胞粘附活性并掺入RGD表位的多肽(参见，例如美国专利号4,661,111)。在本实施例中，将人纤连蛋白序列的15聚体序列(SEQ ID NO：12)(称为长-FN或l-FN)偶联于SA1 SA涂层。还研究了偶联于SA1的较短的市售可得(美国肽公司(American Peptide Co.，Inc.))7-聚体纤连蛋白序列(SEQ ID NO：11)(称为短-FN或s-FN)的影响。不想受理论的限制，但预期短肽的构象稳定性可能有限并可导致细胞粘附特性降低。s-FN多肽是衍生自人纤连蛋白的6-聚体序列，其中额外的Lys氨基残基在C-末端。除了大小是15-聚体表位l-FN的一半外，该6-聚体s-FN肽通过C-末端连接，因此改变细胞培养容器表面上RGD表位的取向。

此外，由于肽内偶联氨基酸残基的位置不同，l-FN和s-FN RGD序列将RGD表位以两种不同且相反的取向呈递至胞外整联蛋白。

在本实施例中，l-FN(SEQ ID NO：12)、s-FN(SEQ ID NO：11)和Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)，BSP肽偶联于以上实施例所述的制剂SA1制备的(甲基)丙烯酸酯层。如实施例5所述进行AttoPhos研究。结构示于图11。图11是显示在纤连蛋白偶联可溶胀(甲基)丙烯酸酯梯度上生长的hESC的AttoPhos染色的柱状图。S-FN是7-聚体纤连蛋白肽偶联的丙烯酸酯。L-Fn是15-聚体纤连蛋白肽偶联的丙烯酸酯。10-、100-和1000-反映了产生这些涂层的输入肽浓度(μM)。

如图11所示，短纤连蛋白序列(s-FN)的性能与长纤连蛋白序列(l-FN)相当。虽然BSP序列看来更好地负载未分化干细胞培养(与纤连蛋白序列相比)，但可能Yaa_lXaa_nArgGlyAspXaa_mYaa_l(SEQ ID NO：1)形式的任何氨基酸序列会是基于肽的细胞培养支架的可接受的选择，其中Xaa和Yaa是任何天然或合成的氨基酸，其中至少一个Xaa或Yaa具有能与表面羧基进行亲核加成/形成酰胺键的官能团。

实施例9：测试偶联于SA1的其它肽：环状肽

在以上实施例中，当偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯聚合物层时，15-聚体Ac-KGGNGEPRGDTYRAY-NH₂(SEQ ID NO：4)，BSP肽显示支持未分化hESC在化学成分确定的无动物条件下培养。不想受理论的束缚，但短的柔性肽在水性介质中不能很好地维持其天然构象。构象不稳定的问题在极短肽中可能是极为普遍的。为模拟天然蛋白质中推定RGD表位的拟-β转角样构象，现已利用极短肽，例如五聚体或十聚体开发了肽环化方案。在本实施例中，环状13和17-聚体RGD肽偶联于各实施方式的SA涂层。

此外，将聚环氧乙烷(PEO)连接基团偶联的RGD序列偶联于各实施方式的SA涂层。不想受理论的束缚，加入间隔基团/连接基团可通过使得肽表位离开SA涂层而改善肽表位的生物利用度。另外，PEO连接基团中环氧乙烷单元的亲水性质可降低蛋白与表面的非特异性吸附。由加利福尼亚州维斯塔的美国肽公司将连接基团加入多肽。

由加利福尼亚州92081维斯塔阿凡达切尔西1271(American PeptideCompany，Inc.，1271 Avenida Chelsea，Vista，CA 92081)的美国肽公司或北卡罗莱纳州28106马修斯市史密斯农场路3100邮箱200的CEM公司(CEMCorporation，P.O.Box 200，3100 Smith Farm Road，Matthews，NC 28106)合成本实施例所用的所有肽。

如以上实施例所述，将以下肽偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯层，制剂SA1。环状结构参见表5。

(i)Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2(SEQID NO：4)，“BSP”；

(ii)NH2-PEO4-AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2(SEQID NO：5)，“连接基团BSP”；

(iii)Ac-LysGlyGlyLys4AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrAsp17-NH₂，Lys4-Asp17酰胺环，(SEQ ID NO：6)，“环状BSP 17-聚体”；

(iv)Ac-LysGlyGlyLys⁴GluProArgGlyAspThrTyrArgAsp¹³-NH₂，Lys⁴-Asp¹³酰胺环，(SEQ ID NO：7)，“环状BSP 13-聚体”；

(v)Ac-LysGlyGlyCys⁴AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrCys¹⁷-NH₂，Cys⁴-Cys¹⁷二硫键连接的环，(SEQ ID NO：8)，如配方4所示的“二硫键-BSP 17-聚体”；和

(vi)Ac-LysGlyGlyCys⁴GluProArgGlyAspThrTyrArgCys¹⁷-NH₂，Cys⁴-Cys¹³二硫键连接的环，(SEQ ID NO：9)，“二硫键-BSP 13-聚体”。

表5

采用两种化学方案合成环状肽。第一方案利用环化赖氨酸侧链上的游离氨基官能团与天冬氨酸侧链上的游离羧基官能团产生的酰胺连接键。第二方案利用在肽序列中两个半胱氨酸的游离巯基之间产生的二硫键(参见WO1989005150)。由北卡罗莱纳州马修斯市CEM公司进行这些环化。

13-聚体和17-聚体酰胺连接的环状肽分别产生10和14个氨基酸的RGD。类似地，13-聚体和17-聚体二硫键连接的环状肽分别产生10和14个氨基酸的环状RGD。

图12显示HT-1080与按照胞外基质蛋白纤连蛋白(FN，5mg/mL)标准化的SAP-BSP(环状)、Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2(SEQ ID NO：4)(1000mM)和非粘附肽GRGESPIYK(SEQ ID NO：30)(RGE，1000mM)-涂布表面的粘附，其中所述BSP肽通过二硫键(SEQ ID NO：8)和(SEQ ID NO：9)环化。与Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2(SEQ ID NO：4)-偶联的(甲基)丙烯酸酯相似，(SEQ ID NO：8)和(SEQ ID NO：9)环状BSP二硫键肽-偶联的(甲基)丙烯酸酯表面支持HT-1080粘附。与线形BSP-偶联的(甲基)丙烯酸酯，Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2(SEQ ID NO：4)类似，图13显示(SEQ ID NO：6)(酰胺环状BSP 17聚体)和(SEQ ID NO：7)(酰胺环状BSP 13聚体)、酰胺环化BSP肽-偶联的(甲基)丙烯酸酯也支持HT-1080粘附。

在偶联有酰胺键结合的环化多肽的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上培养的人胚胎干细胞(hESC)的AttoPhos染色结果示于图14。简言之，将H7hESC在偶联有线形或环状BSP肽以形成SAP-BSP或SAP-BSP(环状)表面的SA上培养。采用酰胺键合环化BSP。在SAP-BSP(SEQ ID NO：4)表面和偶联于(SEQ IDNO：6)(酰胺环状BSP 17聚体)和(SEQ ID NO：7)(酰胺环状BSP 13聚体)的SA涂层上培养48小时后，对细胞进行AttoPhos试验。MATRIGEL^TM-涂布的基材孔用作阳性对照。如图14所示，H7细胞在环状和线形BSP偶联的SA表面上显示相似的粘附/生长反应。在酰胺键-环化SAP-BSP(环状)表面的13聚体和17聚体形式之间未观察到明显的细胞反应差别。结果提示酰胺键连接的环状和线形BSP偶联SA能支持未分化H7 hESC粘附/生长。

图15显示与SA-BSP(SEQ ID NO：4)和MATRIGEL^TM相比，在偶联有二硫键结合的环化多肽(SEQ ID NO：8)(二硫键环状BSP 17聚体)和(SEQ IDNO：9)(二硫键环化BSP 13聚体)的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层上培养的人胚胎干细胞(hESC)的AttoPhos染色结果。简言之，将H7 hESC在偶联有线形或环状BSP肽以形成SAP-BSP或SAP-BSP(环状)表面的SA上培养48小时。培养48小时后，固定细胞并进行AttoPhos试验。如图15所示，H7细胞在环状和线形BSP偶联的SA表面上显示相似的粘附/生长反应。在SAP-BSP(环状)表面的13聚体和17聚体形式之间未观察到明显的细胞反应差别。令人感兴趣的是，与较低浓度(100μM)的线形SAP-BSP相比，二硫键合的SAP-BSP表面显示更高的细胞AttoPhos反应(比较图15和图8中100uM肽浓度的AttoPhos FI)。结果提示，在各实施方式中，二硫键连接的环状和线形BSP偶联SA都能支持未分化H7粘附/生长，其中环状BSP在较低的肽浓度显示更高的细胞反应。

在各实施方式中，本发明提供细胞培养制品，其包括：具有表面的基材；设置在该基材表面上的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层，其中所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层由包含含羧基(甲基)丙烯酸酯单体、交联(甲基)丙烯酸酯单体和能与该含羧基(甲基)丙烯酸酯单体及该交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体的组合物形成；和与该可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的含羧基单体产生的羧基偶联的肽。在各实施方式中，该可溶胀(甲基)丙烯酸酯层在水中的平衡水含量为约5％-约50％或约10％-约40％。在各实施方式中，含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体是丙烯酸2-羧基乙酯。在各实施方式中，交联(甲基)丙烯酸酯单体是二甲基丙烯酸四(甘醇)酯或二丙烯酸四(甘醇)酯。在各实施方式中，亲水性单体选自下组：甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸2-羟乙酯、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯或3-磺基丙基二甲基-3-甲基丙烯酰胺基丙基-铵。在各实施方式中，交联(甲基)丙烯酸酯单体与含羧基甲基(丙烯酸酯)单体与亲水性单体的体积比是约1-10∶约10-40∶约60-90。或者，在各实施方式中，交联(甲基)丙烯酸酯单体与含羧基甲基(丙烯酸酯)单体与亲水性单体的体积比是约3∶20∶80。在各实施方式中，该可溶胀(甲基)丙烯酸酯层不含多肽交联剂。

在各实施方式中，与可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的含羧基单体产生的羧基偶联的肽包含Yaa_lXaa_nArgGlyAspXaa_mYaa_l(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列，其中n是0-4的整数，m是0-5的整数，l是0或1，各Xaa独立地为任何天然或仿生氨基酸，Yaa独立地为任何天然或仿生氨基酸。前提是该肽包含至少一个具有能与可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的游离羧基进行亲核加成的官能团的氨基酸，其中所述含羧基(甲基)丙烯酸酯单体产生所述游离羧基。在各实施方式中，Yaa包含赖氨酸。

在其他实施方式中，与可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的含羧基单体产生的羧基偶联的肽包含Yaa_lXaa_mZaaXaa_nArgGlyAspXaa_mBaaXaa_mYaa_l(SEQ ID NO：3)所示氨基酸序列，其中n是0-4的整数，m是0-5的整数，l是0或1，各Xaa独立地为任何天然或仿生氨基酸，Zaa和Baa各自独立地为在它们各自侧链的原子之间具有共价键以形成多肽的环状部分的任何天然或仿生氨基酸，和Yaa独立地为任何天然或仿生氨基酸；前提是该多肽包含至少一个具有能与可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的游离羧基进行亲核加成的官能团的天然或仿生氨基酸，其中所述含羧基(甲基)丙烯酸酯单体产生所述游离羧基。在各实施方式中，Yaa包含赖氨酸。

在各实施方式中，与可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的含羧基单体产生的羧基偶联的肽包含LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ IDNO：4)、AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ ID NO：5)、LysGlyGlyLys⁴AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrAsp¹⁷(SEQ IDNO：6)，其中Lys⁴和Asp¹⁷一起形成酰胺键使多肽的一部分环化；LysGlyGlyLys⁴GluProArgGlyAspThrTryArgAsp¹³(SEQ ID NO：7)，其中Lys⁴和Asp¹³一起形成酰胺键使多肽的一部分环化；LysGlyGlyCys⁴AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyrCys¹⁷(SEQ IDNO：8)，其中Cys⁴和Cys¹⁷一起形成二硫键使多肽的一部分环化；LysGlyGlyCys⁴GluProArgGlyAspThrTryArgCys¹³(SEQ ID NO：9)，其中Cys⁴和Cys¹³一起形成二硫键使多肽的一部分环化；GlyArgGlyAspSerProLys(SEQ ID NO：11)；和LysGlyGlyAlaValThrGlyArgGlyAspSerProAlaSerSer(SEQ ID NO：12)。

在各实施方式中，可溶胀(甲基)丙烯酸酯层具有均匀的厚度。在各实施方式中，可溶胀(甲基丙烯酸酯)层厚度小于约2微米。

实施例10：倍增时间

采用酶促子培养方法(胶原酶IV处理)，然后用DPBS洗涤，刮下并重悬在化学成分确定的培养基中，从而每4-5天传代(约75％汇合)如以上实施例4所述培养的H7人胚胎干细胞。与用Matrigel表面平行培养的细胞相比，评估每代的细胞集落形态、细胞数量、活力和hESC-特异性标记表达概况。采用下式评估各表面涂层上的倍增时间(DT)，其中DT＝以小时计的倍增时间；T＝以小时计的总培养时间；D₀＝接种细胞密度和D＝收获细胞密度：

式2：DT＝T×log2/logD-logD₀

图16显示在MATRIGEL^TM(MG)表面、偶联有确定的含RGD肽(BSP)(SEQ ID NO：4)的SA1和偶联于含RGD肽与连接基团(BSP-PEO₄)NH₂-PEO₄-AsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ ID NO：5)的SA1上，在化学成分确定的无动物产生的培养基条件下培养的未分化H7hESC的倍增时间实验结果。简言之，在6-孔板中，用化学成分确定的培养基(Xvivo10+bFGF和TGFb1)将H7hESC在SAP-BSP或BSP-PEO4偶联的SA上连续培养10代。在MATRIGEL^TM-涂布的基材表面上培养的细胞用作阳性对照。评估各代的细胞倍增时间、细胞活力和Oct4hESC标记的表达(数据未显示)。在各实施方式中，将未分化干细胞培养至10代视作“长期培养”这些细胞。这些各实施方式中，将细胞培养5代、7代、10代、11代、12代、13代、14代、15代、16代、17代、18代、19代、20代或更长时间视作长期培养。本领域技术人员应知道虽然培养的一群细胞可以是或可变成混合细胞类型，但该细胞培养物中显著比例的细胞必须保持未分化状态才能视作传代成功。在本发明的各实施方式中，传代是有足够百分比的细胞保持它们的未分化状态从而能视作未分化细胞群的成功传代。

在各实施方式中，培养分离的未分化细胞群的方法包括：提供细胞培养制品，该制品具有基材、设置在该基材上的合成聚合物层和偶联于该合成聚合物层的肽，其中该肽包含RGD的氨基酸序列；在偶联于该细胞培养制品的合成聚合物层的多肽上用化学成分确定的细胞培养基培养该未分化的干细胞和维持培养该细胞至少5代、至少10代或更多代。在各实施方式中，化学成分确定的培养基包含碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1。在各实施方式中，干细胞是人干细胞或人胚胎干细胞，可以是H1或H7人胚胎干细胞。

其它实施方式包括培养分离细胞群的方法，包括：提供细胞培养制品，该制品具有基材、设置在该基材上的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层和偶联于该可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的肽，其中可溶胀(甲基)丙烯酸酯由包含含羧基的(甲基)丙烯酸酯单体、交联(甲基)丙烯酸酯单体和能与该含羧基(甲基)丙烯酸酯单体及该交联(甲基)丙烯酸酯单体聚合的亲水性单体的组合物形成，并且其中该肽包含RGD的氨基酸序列；将细胞与偶联于该细胞培养制品的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的多肽接触；在化学成分确定的细胞培养基中培养该细胞以维持细胞培养。在各实施方式中，该细胞是未分化的干细胞、人胚胎干细胞或H1或H7细胞。在各实施方式中，该方法还包括在其它细胞培养制品上用化学成分确定的细胞培养基使细胞传代5代或更多代，其中5代或更多代或10代或更多代中的每次传代后50％或更多的细胞保持未分化状态。在各实施方式中，化学成分确定的培养基包含碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1，可以是约80ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和约0.5ng/ml转化生长因子-β1。

如图16所示，在MATRIGEL^TM-涂布的表面上培养细胞的倍增时间在各代之间显著变化，与之相比，H7hESC在SAP-BSP或SAP-BSP-PEO₄表面上的倍增时间更一致。这些变化可以是因为MATRIGEL^TM-涂布表面的批次之间和制品之间不一致。SAP-BSP和SAP-BSP-PEO₄上的平均细胞倍增时间是41(+/-6)小时，而在MATRIGEL^TM上的平均细胞倍增时间是50(+/-12)小时，反映出MATRIGEL^TM表面上的不一致水平较高。

SAP-BSP和MATRIGEL^TM表面上的平均细胞活力和Oct4-阳性细胞组分相同：活力为86(+/-2)％，Oct4-阳性细胞组分为92(+/-4)％。这些结果提示，在各实施方式中，SAP-BSP和SAP-BSP-PEO₄表面能支持长期培养未分化的H7hESC，包括多次传代，而不影响细胞活力或未分化状态，但能改进细胞倍增时间的一致性。

实施例11：测试其它细胞类型

人胚胎干细胞难以培养。因此，它们是用于显示细胞培养表面的各实施方式的适用性的良好模型从而为难以培养的细胞提供相关细胞培养条件。然而，许多细胞类型是“贴璧依赖性的”。即，许多细胞需要额外的细胞基质或血清以在长期细胞培养中保持健康。不想受理论的束缚，但对于需要含血清培养基的粘附细胞，血清除了提供除细胞培养所需的有丝分裂因子(例如各种生长因子)外还提供各种粘附蛋白。血清中存在的粘附蛋白(可包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等)可吸附到塑料细胞培养器皿上从而形成粘附细胞的附着表面。本实施例显示应用本发明的肽偶联(甲基)丙烯酸酯涂层不限于干细胞。本实施例报道的数据证明各实施方式的本发明合成肽偶联(甲基)丙烯酸酯涂层能取代对含血清培养基或生物学涂层的需求。

在以下实施例中，用本发明的各实施方式的肽偶联可溶胀(甲基)丙烯酸酯细胞培养基材测试人成人间充质干细胞(hMSC)、心肌细胞(从H7人胚胎干细胞分化)、人纤维肉瘤(HT1080)细胞和HepG2/C3A细胞。

对于实施例12-17所示的结果，在从实施例1和实施例2的制剂SA1形成并如实施例2所述偶联于Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2(SEQ ID NO：4)(BSP)的表面上培养细胞。除非另有表述，如实施例1所述制备细胞培养表面。

实施例12：骨髓衍生的hMSC细胞

在组织培养处理的T-75烧瓶上，用含10％FBS的标准培养基(MSCGM，隆萨公司，目录号PT-3001)扩增骨髓衍生的hMSC(隆萨公司，目录号PT-2501)一代。hMSC细胞通常需要在其培养基中含有2-10％的血清。在第8天，用胰蛋白酶收集约80-90％汇合的细胞，用DPBS洗涤两次，以7,000个细胞/平方厘米的密度接种在康宁公司的TCT-PS 6孔板或涂布有Ac-LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr-NH2(SEQ IDNO：4)-偶联的制剂SA1所示可溶胀(甲基)丙烯酸酯的6孔板。用以下所述3种不同的培养基条件研究两种体系。

1)MSCGM，补加10％胎牛血清(FBS)的hMSC培养的标准培养基是用于体外培养hMSC的标准条件。用于偶联细胞培养处理的培养器皿。

2)StemPro MSC-SFM(英杰公司，目录号A10332-01)，为hMSC培养所设计的无血清培养基。这些化学成分确定的培养基需要与CellStart人源化ECM基质(英杰公司，目录号A10142)联用。

3)Xvivo10(隆萨公司，目录号04-743Q)+GF(GF，生长因子-20ng/ml bFGF+0.5ng/ml TGFb1)。

每2-3天重新给予细胞相应的培养基。每天监测细胞粘附/扩散、形态和生长。在第7天用胰蛋白酶收集细胞，利用TB和血球计数器进行细胞计数。补加10％FBS的MSCGM是在塑料培养器皿上体外培养hMSC的标准培养基，并且是本项研究的对照。选择StemPro MSC-SFM和XVivo10+GF(隆萨公司)培养基，因为它们是本领域所用的熟知化学成分确定的无血清培养基。StemPro MSC-SFM培养基是为培养hMSC专门设计的，含有专利生长因子等。利用含血清和化学成分确定的培养基比较SAP-BSP表面与这些标准品。

图17A-17C是显示在3种不同培养基条件下，与TCT相比，在本发明各实施方式中hMSC生长的显微照片。在图17A中，MSCM+10％FBS培养基用于在SAP-BSP表面(上图)和TCT(下图)上培养hMSC。MSCM+10％FBS代表了用于商品化培养供临床应用的hMSC的标准培养基条件。在中图，即图17B中，MSC+SFM是由英杰公司投入市场的用于hMSC培养的专门培养基StemPro，其含有专利生长因子混合物。在图17C中，使用Xvivo+GF。该培养基组合包含Xvivo基础培养基，补加了bFGF和TGFb1，如以上实施例4所述。

图17A显示在补加10％FBS的MSCM培养基中，hMSC细胞在TCT表面和各实施方式的本发明SAP-BSP表面上看起来相似。图17B和17C显示没有FBS存在下，本发明的合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面的SAP-BSP实施方式提供的细胞生长优于TCT表面。图17B和17C显示第7天时，所有培养条件下的形态和细胞数。对于两种不含血清的条件，BSP-丙烯酸酯表面上的细胞数明显高于TCT上的，Xvivo+GF条件中的细胞数超过10％FBS条件中的细胞数。此外，对于两种表面，10％FBS培养基中的初始细胞粘附和铺展(2-20小时)比无血清条件更有效。在随后的时间点(3-7天)，无血清条件下BSP-丙烯酸酯表面上的细胞存活/增殖高于TCT上的。本发明的各实施方式能在无血清培养基中培养hMSC。

图18是显示在不同的确定培养基条件下7天后，TCT和BSP-(甲基)丙烯酸酯上hMSC细胞数比较的柱状图。虽然有FBS存在时两种表面的性能相当，但没有FBS存在时，SAP-BSP(BSP肽丙烯酸酯)表面相比于TCT提供明显改善的细胞培养表面。

实施例13：H7hESC细胞

以上实施例描述了各实施方式的肽偶联可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面在体外扩增hESC中的应用。在本实施例中，其它数据证明各实施方式的SAP表面可用于长期体外扩增hESC细胞。虽然显示了H7hESC的数据，但H1hESC细胞系在这些表面扩增也获得相似结果。图19给出了在实施例4所述培养基条件下，H7细胞在BSP偶联和Matrigel涂布的表面上的倍增时间的代表性比较。数据表明合成SAP表面的细胞培养性能与Matrigel^TM涂层相当或更好。此外，流式细胞术分析测定到BSP偶联的丙烯酸酯表面培养的细胞显示hESC-特异性标记表达类似于MATRIGEL^TM(图20)。

实施例14：流式细胞术

各代结束时，采用流式细胞术分析合成表面或MATRIGEL^TM上培养的H7hES细胞的hESC标记表达。在4℃进行整个染色过程。简言之，对于各样品，将5×10⁵个细胞(固定并为Oct4作透化处理，活细胞对Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA4标记作透化处理)重悬在50微升保护溶液(blocking solution)(DPBS配制的10％HI山羊血清)，温育15分钟，然后加入50微升保护缓冲液配制的标记特异性第一抗体(0.5微克/样品)或相应的同种型对照(0.5微克/样品)，(温育)30分钟。用BD生物科学公司(BD Biosciences)的2ml染色缓冲液(SB)洗涤后，将细胞在SB中与相应的第二抗体(0.25微克/样品)避光温育30分钟。对于活力评估，SB洗涤后用PI(SB配制的2微克/毫升)染色细胞5分钟。用BD生物科学公司的FACS Calibur获取30,000门控事件(为PI-阴性活细胞群设定门控)。利用CellQuest Pro软件(BD)实施所有分析。结果示于图20。结果显示MATRIGEL^TM和SAP-BSP合成表面上hESC-特异性标记表达极其相似。

实施例15：H7hESC分化成心肌细胞

实施例13公开了在各实施方式的BSP偶联可溶胀(甲基)丙烯酸酯上培养未分化hESC。本实施例公开了利用相同表面使这些细胞分化成心肌细胞。可通过任何合适的方法获得干细胞衍生的心肌细胞。普通技术人员应知道，还可利用此类肽偶联(甲基)丙烯酸酯使得hESC细胞分化成其它谱系，例如胰岛细胞、神经元细胞、成骨细胞等。

Laflamme等“Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cellsin pro-survival factors enhance function of infracted rats(促存活因子中衍生自人胚胎干细胞的心肌细胞增强骨折大鼠的功能)，Nature Biotechnology，25：1015-1024(2007)描述了培养分化hESC的方法。简言之，可将未分化的人胚胎干细胞，例如衍生自女性H7人胚胎干细胞系的那些以约100,000个细胞/平方厘米的密度接种在MATRIGEL^TM-涂布的平板上，每天重新加入hES细胞生长培养基(KO DMEM+20％血清替换物，1mM 1-谷氨酰胺，1％NEAA，0.1mM 2-ME加上hbFGF，80ng/ml和TGFb1，0.5ng/ml)。为诱导分化，可用补加了约100ng/ml人重组活化素A(购自研发系统公司(R&DSystems))的RPMI-B27培养基(可购自英杰公司)替换KO-SR，(温育)约24小时，然后与10ng/ml人重组BMP4(购自研发系统公司)(温育)72小时。当然可采用任何其它合适的方法。

在合成SAP-BSP表面上用化学成分确定的培养基长期培养hESC后，细胞仍保留分化成治疗上感兴趣的细胞类型的能力。在SAP-BSP表面上培养H7细胞10代，然后利用相同的SAP-BSP表面分化成心肌细胞(CM)。采用LaFlamme(同上)的直接分化方案。简言之，首先利用“敲除血清替换”培养基(KO-SR)[KO-DMEM(英杰公司，编号10829018)；20％KO-SR(英杰公司，编号10828-028)；1％非必需氨基酸(英杰公司，编号11140-050)；1mML-谷氨酰胺；0.1mM β-巯基乙醇；80ng/ml hbFGF和0.5ng/ml hTGF-β1(研发公司；编号234-FSE/CF和#240-B)中预处理H7细胞10-14天。汇合后形成细胞单层后，通过在补加了B27(英杰公司，编号17504044)的RPMI 1640培养基(英杰公司，编号11875)中连续加入以下重组生长因子诱导CM分化：人活化素A-100ng/ml(研发系统公司，编号338-AC-CF)，24小时；然后是人BMP4(骨形态发生蛋白4)-10ng/ml(研发系统公司，编号314-BP-CF)，72小时。然后使细胞在RPMI 1640-B27培养基中再恢复2周。每2-3天更好培养基直至在培养物中观察到跳动(beating)CM。

实施例16：心肌细胞(从H7人胚胎干细胞分化)

基于信息和原则，关于hESC分化成生理学相关(有功能)心肌细胞的所有出版的报道需要涂布有Matrigel^TM或其它ECM蛋白的基材。本实施例中报道的数据证明各实施方式的本发明SAP表面，包括SAP-BSP合成含RGD多肽偶联的可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面能取代对生物学涂层涂布的2D/3D支架的需求。

对于CM标记评估，将分化细胞固定在6-孔板上并为Nkx2.5/α-活化素双重免疫染色进行加工(示于图21A)，或收集细胞、固定并为α-活化素(图21B)或Nkx2.5(图21C)流式细胞术分析进行加工。这些结果显示未分化H7hESC在SAP-BSP合成表面上用化学成分确定的培养基长期培养后(10代以上)，细胞仍能分化成心肌细胞。分化效率非常类似于MATRIGEL^TM表面上见到的(数据未显示)。数据还提示SAP-BSP表面可用于取代目前使用的MATRIGEL^TM以便将hESC直接分化成心肌细胞。

实施例17：HT1080细胞

利用HT1080细胞，我们在本实施例中证明此类合成肽偶联的(甲基)丙烯酸酯涂层可为需要生物学涂层或含血清培养基的任何细胞类型提供合适的细胞培养表面。

选择培养人纤维肉瘤(HT1080)细胞以证明肽偶联的丙烯酸酯表面的通用性。HT1080细胞常规生长在含血清培养基中。此类细胞类型生长的ATCC推荐方案需要ATCC-配制的补加10％胎牛血清的Eagle最低限必需培养基(目录号30-2003)。据信，血清内的粘附蛋白有助于这些细胞粘附于塑料表面。

对于本实施例，在组织-培养处理的T150烧瓶(TCT，康宁公司，430825)中，用含有10％胎牛血清(FBS，隆萨公司，14-502F)的Iscove改进的Dulbecco培养基(IMDM，隆萨公司，12-722Q)将HT-1080(ATCC编号CCL-121)细胞培养至70％汇合。70％汇合时用含血清(IMDM+10％FBS)或不含血清(IMDM)的培养基补充细胞培养基，一天后收获细胞。用0.05％胰蛋白酶-EDTA(吉布可公司(Gibco)/英杰公司，25300)收获100％汇合时的细胞，用Dulbecco的磷酸缓冲盐水(DPBS，吉布可公司/英杰公司，14190)洗涤两次。将细胞在含血清或不含血清的IMDM(+16ng/mL重组人FGF碱性(研发系统公司234-FSE/CF)和+0.5ng/mL重组人TGF-B1(研发系统公司，240-B-002))中以25,000个细胞/平方厘米的密度接种到以下96孔板上：TCT-聚苯乙烯(TCT-PS，康宁公司，3603)、可溶胀(甲基)丙烯酸酯(SA1)涂布的Xenor和SAP-BSP涂布的Xenor。每2-3天用相应的培养基重新培养细胞。每天监测细胞粘附/铺展、形态和生长。根据生产商的方案，采用细胞增殖试验(CellTiter水性单溶液细胞增殖试验(CellTiterAQueous One Solution Cell Proliferation Assay，普罗迈格公司，G3581))评估细胞汇合时-第二天(含血清)和第5天(不含血清)-各表面上相对细胞数。图22是比较有血清(S，黑色柱)和没有(SF，白色柱)血清存在下，TCT、SA1(甲基)丙烯酸酯-涂布和SAP-BSP偶联涂层上HT-1080细胞的细胞滴度数据的柱状图。图23显示比较有血清和没有血清存在下，TCT、(甲基)丙烯酸酯-涂层和BSP偶联涂层上HT-1080细胞的形态的显微照片。CellTiter试验的数据示于图22，细胞形态的比较示于图23。TCT-PS是等离子体处理的TCT表面。SA1是表1的SA1制剂。SAP-BSP是BSP-肽偶联(SEQ ID NO：4)的SA1制剂。前三幅图是不含血清条件下(SF，第5天)，最后一幅图是有血清存在时，第2天。该数据显示利用RGD多肽偶联的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层培养HT-1080细胞的可行性。HT-1080细胞是为粘附目的提供需要用血清的代表性工程改造细胞系。

实施例18：HepG2/C3A细胞粘附于偶联有层粘连蛋白多肽的SAP层

在100微升培养基中将HepG2/C3A细胞(ATCC编号CRL-10741)以25,000个细胞/孔一式三份涂布在96孔形式的SAP表面，BD BioCoat^TM胶原I和康宁处理的Topas^TM上，用补加了1％青霉素-链霉素(英杰公司编号15140-155)的Eagle极限必需培养基(ATCC编号30-2003)培养。培养基未补加胎牛血清(如细胞系供应商推荐的)，SAP表面也未接触胎牛血清。培养平板在37℃、5％CO₂和95％相对湿度下温育24小时。如实施例1所述制备具有SA表面的细胞培养平板。根据实施例2偶联肽。偶联于SA层的多肽列于表5。与胶原I相比，显示结果优于75％粘附的多肽(参见图24)在表6中以星号标出。图24中的线条表明胶原1上细胞的75％性能。

表6：偶联于SA层的多肽

采用细胞毒性试验(普罗迈格CytoTox非放射性细胞毒性试验，编号G1780)测定HepG2/C3A细胞的粘附，该试验评估粘附于培养表面的活细胞数。培养24小时后，用磷酸缓冲液剧烈洗涤细胞，通过引入裂解缓冲溶液裂解并在37℃温育1小时自维持粘附于培养表面的活细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)。利用平板读数计读取490nm吸光度来检测释放的乳酸脱氢酶的生物学活性(PE公司的维克多3)。

比较SAP，胶原I和处理的Topas^TM上活细胞的估计数量(LDH活性的吸光度)示于图24。细胞培养表面的比较证明含以下层粘连蛋白肽序列的康宁SAP支持HepG2/C3A细胞的无血清粘附≥胶原I的75％，并高于处理的Topas^TM：KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS(SEQ IDNO：13)、KGGTWYKIAFQRNRK(SEQ ID NO：16)、KYGSETTVKYIFRLHE(SEQ ID NO：19)和KYGKAFDITYVRLKF(SEQ ID NO：22)。此外，在康宁SAP上培养的HepG2/C3A细胞显示与在胶原I上培养的细胞类似的细胞形态。

因此，公开了“用于在化学成分确定的培养基中培养细胞的合成表面”的各实施方式。本领域技术人员应知道可用公开的实施方式之外的实施方式实施本文所述的阵列、组合物、试剂盒和方法。公开的实施方式是出于说明而非限制的目的。