重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株(SC/AAca)的制备及应用

技术领域

本发明涉及重组基因工程疫苗，具体地，本发明涉及一种用于预防动物和人甲型H1N1流感的重组基因工程疫苗，更具体地，本发明涉及一种用于预防动物和人甲型H1N1流感的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株。

背景技术

A型流感病毒是一种能广泛感染禽类和哺乳动物的分节段的负链RNA构成的囊膜病毒。在全世界，流感常以零星暴发兼杂随机的大流行的形式出现，在过去的几十年里，各国家主要选择利用的仍然是全病毒灭活疫苗，它主要刺激机体产生体液免疫抵抗相同亚型的血凝素表面糖蛋白。

截至2009年12月，开始于墨西哥的甲型H1N1流感的大流行，已在全球造成超过1万人死亡，并且疫情仍在继续扩大。为了对应疫情的发展，我们进行了冷适应活疫苗株的研制。

AH/AAca是以AA/ca疫苗为6个内部基因(PB2，PB1，PA，NP，M和NS)供体，以我国流行的抗原性具有代表性的H5N1亚型人禽流感病毒，A/Anhui/2/2005(我国人禽流感分离株，简称AH/05)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体，同时删除了高致病力相关的HA裂解位点多个碱性氨基酸，通过流感病毒反向遗传操作，在符合人类疫苗生产标准的低代次Vero细胞上救获的基因重组病毒。该重组冷适应致弱病毒具有冷适应性(cold-adapted，ca)和温度敏感性(temperature-sensitive，ts)，感染复制局限于上呼吸道，可直接鼻腔喷入接种，免疫原性良好，且具有高度生物安全性(Fan S et al.，2009)。冷适应性是指重组活疫苗株在25℃低温培养条件下能很好地生长，而相应的野生病毒却不能在此条件下生长。温度敏感性是指重组活疫苗株在39℃高温培养条件下生长受到限制，而其野生病毒在此条件下却能很好的生长，而病毒的这两种生物学特性是由其内部基因决定的。

人工自然重组技术是一种简单有效的构建2:6重组病毒疫苗株方法，流感病毒的基因组由8个分段的负链RNA片段组成，当2个病毒共同感染鸡胚或细胞时，其基因组片段会发生互换，从而产生一些新的重组病毒(reassortant)，通过血清的处理，则能够有效的筛选2:6重组病毒疫苗株(H.Chen et al.，2003)。

发明内容

鉴于全病毒灭活疫苗免疫原性差、需要添加佐剂、生产比较困难、副反应大、不适合于有慢性疾病的人群、老人和3岁以下儿童的使用。因此，本发明人利用人工自然重组方法，以2009年世界大流行的甲型流感，中国内地首例甲型H1N1流感分离株A/SC/1/2009(简称SC)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体，以流感病毒疫苗株AH/AAca(H5N1)为6个内部基因(聚合酶PB2(PB2)，聚合酶PB1(PB1)，聚合酶PA(PA)，核蛋白(NP)，基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS))的供体，自然重组得到了1株基因重组病毒，命名为SC/AAca(H1N1)。即，以AH/AAca(H5N1)的6个内部基因作为骨架基因，并以2009年流感大流行国内甲型流感病毒分离株A/SC/1/2009的HA和NA基因作为表面基因，利用自然重组方法，制备了重组病毒SC/AAca(H1N1)。

实验证实，该株病毒具有体外培养ca和ts特性，只能在小鼠呼吸系统内复制，呈典型的冷适应低致病力表型。该病毒与我国甲型H1N1流感病毒流行株抗原性一致，并且具有良好的鸡胚适应性，可作为防制甲型H1N1流感的疫苗株。

因此，本发明提供以下各项：

1.一种重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株，其特征在于表达甲型H1N1流感病毒的表面抗原血凝素蛋白和神经氨酸酶蛋白。

2.根据以上1所述的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株，其还表达冷适应疫苗株的6个蛋白：聚合酶PB2亚基(PB2)，聚合酶PB1亚基(PB1)，聚合酶PA亚基(PA)，核蛋白(NP)，基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)。

3.根据以上2的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株，其中所述冷适应疫苗株是流感病毒冷适应致弱病毒疫苗株AH/AAca(H5N1)。

4.根据以上1至3中任一项的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株，其中所述表面抗原血凝素蛋白和神经氨酸酶蛋白的氨基酸序列来源于甲型H1N1流感分离株A/SC/1/2009。

5.一种生产根据以上1-4任何一项的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株的方法，该方法包括：

(1)用甲型H1N1流感病毒株和冷适应疫苗株共同接种鸡胚尿囊腔或细胞进行自然重组；

(2)用抗所述冷适应疫苗株的抗体筛选，除去表面基因来源于所述冷适应疫苗株的毒株；和

(3)稀释纯化，除去内部基因来源于所述甲型H1N1流感病毒株的毒株。

6.根据以上5所述的方法，其中所述冷适应疫苗株是流感病毒冷适应致弱病毒疫苗株AH/AAca(H5N1)。

7.根据以上5所述的方法，其中所述甲型H1N1流感病毒株是甲型H1N1流感分离株A/SC/1/2009。

8.根据以上5-7任一项所述的方法获得的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株。

9.重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株SC/AAca(H1N1)(简称SC/AAca)，其保藏号为CCTCC NO：V201007。

10.根据以上1-4、8或9中任何一项的重组甲型H1N1流感病毒冷适应弱毒活疫苗株在制备预防甲型H1N1流感病毒所导致疾病的药物中的应用。

11.根据以上10所述的应用，其中所述药物用于预防动物或人的甲型H1N1流感病毒感染。

生物材料保藏

甲型H1N1重组流感病毒(Influenza virus)冷适应弱毒活疫苗株SC/AAca(H1N1)于2010年3月1日保藏于位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：V201007。

附图说明

图1A.以AH/AAca毒株cDNA为模板，利用SC和AH/AAca毒株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物进行的扩增，其中第一至第八泳道为使用SC毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物对AH/AAca毒株cDNA的扩增；M为DNAMarker 2000；第九至第十六泳道为使用AH/AAca毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物对AH/AAca毒株cDNA为模板的扩增；

图1B.以SC毒株cDNA为模板，利用AH/AAca和SC毒株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物对SC毒株cDNA为模板的扩增，其中第一至第八泳道为使用AH/AAca毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物对SC毒株cDNA为模板的扩增；M为DNA Marker 2000；第九至第十六泳道为使用SC毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物对SC毒株cDNA为模板的扩增；

图2.SC/AAca重组病毒的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的RT-PCR扩增，

1～8泳道：重组病毒SC/AAca利用AH/AAca的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物；M：DNA分子质量标准；10～17泳道：重组病毒SC/AAca利用SC的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物；

图3.SC/AAca重组病毒和甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009(SC)野生病毒的温度敏感性试验；

图4.SC/AAca重组病毒和甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009(SC)野生病毒的冷适应性试验。

序列说明

SEQ ID No.1：SC/AAca HA基因；

SEQ ID No.2：SC/AAca NA基因；

SEQ ID No.3：SC/AAca PB2基因；

SEQ ID No.4：SC/AAca PB 1基因；

SEQ ID No.5：SC/AAca PA基因；

SEQ ID No.6：SC/AAca NP基因；

SEQ ID No.7：SC/AAca M基因；和

SEQ ID No.8：SC/AAca NS基因。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实验材料

1.病毒株

AH/AAca    (H5N1)(简称AH/AAca)

A/SC/1/2009(H1N1)(简称SC)

均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感中心。

2.SPF鸡胚及细胞

9-11日龄的SPF鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF鸡胚孵化室，MDCK细胞(狗肾细胞)购自中国科学院武汉病毒研究所，低代次Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)购自中国科学院武汉病毒研究所。

3.主要试剂

DATP、dGTP、dCTP、dTTP和rTaq DNA聚合酶购于大连宝生物工程有限公司；RNA提取试剂TRIzol，鼠源反转录酶(MLV)试剂盒、DTT、RNaseOUT、Pfx高保真DNA聚合酶购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒与小量质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；测序反应试剂盒(CEQTM DTCS Quick Start Kit)购自BECKMAN公司；TPCK胰蛋白酶和低血清DMEM培养基购自Invitrogen公司；抗流感病毒AH/AAca(H5N1)抗血清购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感中心。

4.引物

分析比较，设计合成能扩增出甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009毒株的8个特异性片段而不能扩增出流感病毒AH/AAca(H5N1)毒株的任何片段的甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009的16条鉴别引物，合成引物序列见表1。

表1  甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009的8个特异性片段的引物序列

另外，设计合成只能扩增出流感病毒AH/AAca(H5N1)毒株的8个特异性片段而不能扩增出甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009毒株的任何片段的流感病毒AH/AAca(H5N1)的16条鉴别引物，合成引物序列见表2。

表2  流感病毒AH/AAca(H5N1)的8个特异性片段的引物序列

实施例1：筛选、鉴定重组病毒方法的建立

利用TRIzol强裂变剂法，提取流感病毒AH/AAca(H5N1)和甲型H1N1流感分离株A/SC/1/2009的RNA，进行反转录，然后用上述设计的流感病毒AH/AAca(H5N1)(表2)和甲型H1N1流感分离株A/SC/1/2009(表1)的片段特异性鉴别引物做PCR反应。PCR产物电泳结果见图1。

如图1A所示，当以流感病毒AH/AAca(H5N1)的cDNA为模板，利用上述合成的流感病毒AH/AAca(H5N1)和甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009毒株的32条片段特异性鉴别引物扩增时，只有AH/AAca(H5N1)毒株的特异性鉴别引物扩增出了流感病毒AH/AAca(H5N1)毒株的8条特异性片段，而甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009毒株的特异性鉴别引物没有扩增出任何片段。

如图1B所示，当以甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009毒株的cDNA为模板，利用上述合成的流感病毒AH/AAca(H5N1)和甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009毒株的32条片段特异性鉴别引物扩增时，只有甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009毒株的特异性鉴别引物扩增出了甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009毒株的8条特异性片段，而流感病毒AH/AAca(H5N1)毒株的特异性鉴别引物没有扩增出任何片段。

由此证明已经建立了筛选方法，这种系统可以鉴定所制备的重组病毒的8条基因分别是来源于流感病毒AH/AAca(H5N1)还是甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009。

实施例2：重组甲型H1N1流感病毒的制备与鉴定

1.共感染-使两个病毒基因组发生重组：

100μl的甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009和50μl的流感病毒AH/AAca(H5N1)(简称AH/AAca)混合加入850μl PBS中，共同接种10日龄的SPF鸡胚尿囊腔进行自然重组。35℃培养24小时，收集尿囊液。

2.抗体筛选-除去表面基因来源于流感病毒AH/AAca(H5N1)的毒株：

取50μl在上述特定的人工条件下收获的尿囊液和600μl倍比(4倍)稀释的抗流感病毒AH/AAca(H5N1)抗血清混合，室温作用30分钟，再每个稀释度接种三枚鸡胚。接着，接种的鸡胚在35℃培养箱中培养48小时，测定每个稀释度接种的鸡胚尿囊液的血凝价(参见实验动物血凝抑制试验国家标准(GB)(GB/T 14926.54-2001))，收集并保留低稀释度的流感病毒AH/AAca(H5N1)抗血清处理后接种的鸡胚有血凝价的尿囊液。然后，相同方法做第二次的抗血清处理，同样收集并保留低稀释度的流感病毒AH/AAca(H5N1)抗血清处理后接种的鸡胚有血凝价的尿囊液。

3.稀释纯化-除去内部基因来源于H1N1流感病毒的毒株：

按照上述方法处理得到的病毒在鸡胚上进行3代有限克隆纯化，利用TRIzol强裂变剂法，提取病毒RNA，进行反转录，然后用设计的流感病毒AH/AAca(H5N1)和甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009病毒片段特异性鉴别引物(表2和1)做PCR扩增。然后，对扩增产物进行核酸凝胶电泳，鉴定得到的重组病毒HA和NA基因来源于甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009，PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因来源于流感病毒AH/AAca(H5N1)，即获得了重组甲型H1N1流感病毒SC/AAca(见图2)。

4.重组病毒的序列鉴定

提取重组病毒SC/AAca的RNA，RT-PCR分别扩增出重组病毒SC/AAca的全基因组的8个片段，对PCR产物进行核酸凝胶电泳，胶回收后测定每一片段的序列(序列分别如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7和SEQID No.8所示)。利用DNAStar软件，对测定的序列和野生毒株甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009和流感病毒AH/AAca(H5N1)的序列进行序列比较，发现重组病毒SC/AAca的基因组均没有任何核苷酸的变化，表明重组病毒的HA和NA来自于甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009；6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS来自流感病毒AH/AAca(H5N1)。

5.重组病毒SC/AAca的抗原性分析

根据亲本毒株甲型H1N1流感病毒国内分离株A/SC/1/2009与重组病毒的抗原和血清进行交叉HI试验(参见实验动物血凝抑制试验国家标准(GB)(GB/T 14926.54-2001))的抗原性分析数据，从试验结果可以看出抗原差异小于2倍，说明重组后，病毒依然保持着亲本毒株的抗原性(参见表3)。

表3：亲本毒株A/SC/1/2009与重组病毒SC/AAca的抗原性分析

实施例3：重组甲型H1N1流感病毒的生物学活性

1.重组病毒的温度敏感性(temperature sensitive)测定

温度敏感性(Ts)是比较病毒株在适合的生长温度33℃和高温39℃生长条件下在MDCK细胞上的复制滴度。如果在39℃高温条件下，病毒在MDCK细胞上的生长滴度比其在33℃合适的生长温度下的生长滴度降低100倍以上时，那么就认为这个病毒具有温度敏感性特征，反之亦然。

重组甲型H1N1流感病毒SC/AAca在冰上作10倍倍比稀释，即100μl病毒+900μl含有2μg/mL TPCK胰蛋白酶的PBS，混匀；吸取100μl稀释的病毒液至下一管900μl PBS中，混匀，依次类推，直到稀释到10^-9。将稀释好的病毒加到事先准备好的每孔含有大约70-80％密度的MDCK细胞96孔细胞培养板上，每个稀释度平行接种4个细胞孔，每孔100μl，在37℃吸附2h，将上清吸掉，加入含有2μg/mL TPCK胰蛋白酶的低血清DMEM培养基。用同样的方法接种另一块96孔板。将接种完的两块细胞板分别放在33℃或39℃的CO₂培养箱，孵育48h后，用血凝试验检测每个温度下病毒的复制情况，用Reed-Muench方法计算半数组织培养感染剂量(TCID50)。以同样的方法检测A/SC/1/2009野生病毒在33℃与39℃下的复制情况。然后比较重组病毒和野生病毒在33℃与39℃的TCID50。

结果表明，SC/AAca重组病毒在33℃和39℃培养条件下的复制滴度相差10^7.83倍，甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009野生病毒在33℃和39℃培养条件下的复制滴度相差无几。因此，制备的重组病毒在33℃和39℃培养条件下复制滴度相差远远大于100倍。而野生病毒在33℃和39℃培养条件下的复制滴度基本一致，差值小于100倍。因此制备的重组病毒SC/AAca具有温度敏感性生物学特性，而野生病毒A/SC/1/2009没有此特性(见图3)。

2.重组病毒的冷适应性(cold-adapted)测定

冷适应性(cold-adapted)是比较病毒株在34℃适合生长温度条件下和在25℃低温生长条件下在鸡胚上的复制滴度。在25℃低温条件下，如果病毒在鸡胚上的生长滴度与其在34℃度生长条件下的生长滴度的差值在100倍之内，就认为这个病毒具有冷适应性特征，反之亦然。

分别将重组病毒SC/AAca和相应的野生病毒A/SC/1/2009在冰上作10倍倍比稀释，即100μl病毒+900μl PBS，混匀，吸取100μl的病毒稀释液到下一管900μl PBS中，混匀，依次类推，一直稀释到10^-9。将稀释好的病毒每个稀释度接种5枚10日龄的SPF鸡胚，将接种好的鸡胚放置于25℃低温培养箱孵化72h。并且以同样的方法每个稀释度接种另外5枚10日龄的SPF鸡胚，并放置于34℃鸡胚孵化箱孵化72h。用血凝试验检测病毒在各孵化温度下的增值滴度，用Reed-Muench方法计算鸡胚半数感染量(EID50)，并比较重组病毒SC/AAca和野生病毒A/SC/1/2009在25℃与34℃孵化条件下的增值滴度。

结果表明，SC/AAca重组病毒在25℃培养条件下的复制滴度和34℃培养条件下的复制滴度差别不大，病毒复制滴度的差值在100倍以内。与其相应野生病毒A/SC/1/2009在25℃培养条件下几乎不能复制，而在34℃条件下复制很好。因此制备的重组病毒具有冷适应性生物学特性，而与其相应的野生病毒甲型H1N1流感病毒A/SC/1/2009没有此特性。(结果见图4)

参考文献

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2.Jin，H.，Zhou，H.，Lu，B.，Kemble，G.，2004，Imparting temperature sensitivity andattenuation in ferrets to A/Puerto Rico/8/34 influenza virus by transferring the geneticsignature for temperature sensitivity from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60.Journal ofvirology 78，995-998.

3.H.Chen，Y.Matsuoka，David Swayne，Q.Chen，N.J.Cox，B.R.Murphy，K.Subbarao.Generation and characterization of a cold-adapted influenza A H9N2reassortant as a livepandemic influenza virus vaccine candidate.Vaccine 21(2003)4430-4436.

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>重组甲型H1N1流感病毒弱毒活疫苗株(SC/AAca)的研制及其应用

<130>IB097228

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1701

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>1

atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcga ccgcaaatgc agacacatta    60

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<211>2280

<212>DNA

<213>Influenza virus

<400>3

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