一种肥厚型心肌病基因分型方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因分型领域，具体属于一种肥厚型心肌病基因分型方 法及其检测试剂盒。

背景技术

肥厚型心肌病(HCM)是最常见的心肌病之一，以左心室和右心室 及室间隔非对称性肥厚为特征，排除其他可能引起心肌肥厚的心血管疾 病和全身疾病。其临床表现多样，从无症状到轻度胸闷、心悸再到恶性 心律失常、心力衰竭，甚至青少年时期猝死等。

据估计，在普通人群中HCM发病率约为1/500。随着分子生物学的 迅猛发展和人类基因组计划的完成，心肌病的致病基因研究取得了很大 进展。已证实肥厚型心肌病为常染色体显性遗传疾病，单一等位基因突 变即可致病。该病约有55％发病呈家族聚集性，称为家族性肥厚型心肌 病(FHCM)。迄今为止，已确定了11个编码肌节蛋白基因的200余种突 变，可引起单纯性HCM，不伴有其他心脏表现和心脏外表现。其中包括 5个编码粗肌丝的基因：β-肌球蛋白重链基因(MYH7)，肌球蛋白结合蛋 白C基因(MYBPC3)。α-肌球蛋白重链基因(MYH6)，必需轻链基因(MYL3)， 调控轻链基因(MYL3)；5个编码细肌丝的基因：心肌肌钙蛋白T基因 (TNNI3)，肌动蛋白基因(ACTC)，肌钙蛋白T基因(TNNI2)，心肌肌钙蛋 白C基因(TNNC1)和α-原肌球蛋白基因(TPM1)；1个编码粗丝联接蛋自 基因：TTN。其中，最常见的三种突变类型是β-肌球蛋白重链基因 (MYH7)、肌球蛋白结合蛋白C基因(MYBPC3)和心脏肌钙蛋白T基因 (TNNT2)，占家族性肥厚型心肌病的70-90％。

肥厚型心肌病由于临床表现十分多样，目前确诊主要是靠实验室检 查。超声心电图目前仍是肥厚型心肌病诊断最常用、最可靠、最经济的 诊断方法。另外还有心脏核磁、心电图改变等检查方法。但是临床诊断 方法不足之处是被确诊的患者都是已经发展到了发病的中晚期，这对治 疗和手术来说都是不利因素。

HCM的致病基因及突变位点在不同国家、不同种族之间的分布差异 很大。而HCM心肌病已成为影响我国居民身心健康及人口生存质量的重 大公共卫生问题，鉴于越来越多的心肌病与遗传因素有关，对于心肌病 的基因分型已经越来越有必要，而国内外在这方面目前还是空白。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是通过对HCM的致病基因MYH7、MYBPC3 和TNNT2进行基因突变的检测，从基因序列和分子结构水平来辅助鉴定 是否携带HCM心肌病致病基因突变。

本发明提供的技术方案为提供一种肥厚型心肌病基因分型方法，所 述方法包括：

a、对样本DNA中基因MYH7、MYBPC 3和TNNT2进行基因突变的检测， 所述基因突变的检测包括MYH7、MYBPC3和TNNT2的基因外显子的PCR 扩增及DNA测序，

c、将步骤b中扩增测序后得到的序列与数据库中的标准序列进行 比对，从而确定基因分型结果。

优选的，所述PCR扩增及DNA测序包括PCR序列扩增、PCR产物纯 化和双脱氧链终止法DNA测序。

优选的，所述PCR序列扩增的反应体系为1μL的10×PCR Buffer、 1μL的2μM引物、1μL的2mM dNTP mix、1μL15mM的MgCl₂、1U的 Taq酶、1μL 20ng/μL的DNA模板，然后加双蒸水至10μL，

反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，65℃退火30秒， 72℃延伸2分钟，共35个循环；72℃延伸5分钟。

优选的，所述双脱氧链终止法DNA测序的反应体系为0.25uL的2.5 ×BigDye、0.875uL5×BigDye Seq Buffer、1uL5pmoL/μL的引物、 1.875uL灭菌去离子水、1uL纯化的PCR产物；

反应条件：94℃预变性2分钟；94℃变性10秒，55℃退火10秒， 60℃延伸3分钟，25个循环。

优选的，所述PCR产物纯化采用EDTA-乙醇法。

优选的，所述双脱氧链终止法DNA测序所用的通用测序引物序列如 SEQ ID NO：1-2所示。

优选的，所述MYH7基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如：SEQ ID  NO：3-28所示；

所述MYBPC3基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如：SEQ ID  NO：29-50所示；

所述TNNT2基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如：SEQ ID  NO：51-58所示。

本发明提供的另一个技术方案为提供一种肥厚型心肌病基因PCR检 测试剂盒，包括MYH7、MYBPC3和TNNT2的基因外显子的PCR扩增引物，

所述MYH7基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如：SEQ ID NO：3-28 所示；

所述MYBPC3基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如：SEQ ID  NO：29-50所示；

所述TNNT2基因外显子的PCR扩增引物碱基序列如：SEQ ID  NO：51-58所示。

优选的，所述肥厚型心肌病基因PCR检测试剂盒还包括所述MYH7、 MYBPC3和TNNT2各基因外显子PCR扩增产物的DNA测序的通用测序引物， 所述通用测序引物序列如SEQ ID NO：1-2所示。

本发明的有益效果为(1)辅助早期诊断：找出家族成员中无症状的 遗传受累者及无遗传受累者；(2)辅助指导选择性生育，杜绝此病在这 一家族中“蔓延”。

具体实施方式

本发明的肥厚型心肌病MYH7、MYBPC3、TNNT2基因突变是指MYH7、 MYBPC3、TNNT2基因各外显子所发生的单碱基替换、插入突变、缺失突 变及复合突变等。

本发明还提供了一种本发明DNA测序的通用测序引物，大大简化了 操作步骤。所述的通用测序引物序列是：UF：5’ -ggaggactgctcacgaact-3’；UR：5’-gggacacgcagtcgacatc-3’，UF代 表未甲基化特异性上游引物，UR代表未甲基化特异性下游引物。

本发明的肥厚型心肌病MYH7、MYBPC3、TNNT2基因突变检测方法， 包括下列步骤：

(1)应用对象或材料

a.社会人群的血液；机体组织细胞；蜡块和福尔马林固定组织； 各类冻存、固定保持细胞。

b.患有心肌病或类似心肌病综合征的患者及其家族血缘人员的血 液及其上述材料。

c.肥厚型心肌病相关患者的血液标本。

(2)样本DNA提取

a.新鲜组织：商业化DNA提取试剂盒或是自配试剂。

b.固定和石蜡组织：商业化DNA提取试剂盒。

c.血液标本和液体细胞：商业化DNA提取试剂盒或是自配试剂。

(3)PCR扩增

MYH7、MYBPC3、TNNT2基因外显子的PCR扩增。所述的PCR扩增是 指反应液为1μL的10×PCR Buffer、1μL的2μM引物、1μL的2mM dNTP  mix、1μL的15mM MgCl₂、1U Taq酶、20ng/μL DNA模板加1μL，然 后加ddH₂O至10μL。反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒， 65℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共35个循环；72℃延伸5分钟。

(4)DNA测序及结果分析。

所述的测序反应中的PCR反应体系包括测序引物、PCR纯化产物和 双脱氧链终止法DNA测序。所述双脱氧链终止法DNA测序的反应体系为 0.25uL的2.5×BigDye、0.875uL5×BigDye Seq Buffer、1uL5pmoL/ μL的引物、1.875uL灭菌去离子水、1uL纯化的PCR产物；

反应条件：94℃预变性2分钟；94℃变性10秒，55℃退火10秒， 60℃延伸3分钟，25个循环。

实施例1

本发明提供的一种肥厚型心肌病基因PCR检测试剂盒，包括MYH7、 MYBPC3和TNNT2的基因外显子的PCR扩增测序的引物碱基序列，还包括 PCR扩增反应液：1μL的10×PCR Buffer、1μL的2μM引物、1μL的 2mM dNTP mix、1μL 15mM的MgCl₂、1U Taq酶、1μL 20ng/μL的DNA 模板，加ddH₂O补足体积至10μL。

所述的MYH7基因外显子的PCR引物序列见表1，参考基因组序列为 GenBank数据库登录号为NM_000364.1的序列(本专利的参考序列对此 有所修正)。

所述的MYBPC3基因外显子的PCR引物序列见表2，参考基因组序列 为GenBank数据库登录号为U91629.1的序列。

所述的TNNT2基因外显子的PCR引物序列见表3，参考基因组序列 为GenBank数据库登录号为NM_000364.1的序列(本专利的参考序列对 此有所修正)。

表1 MYH7基因外显子PCR引物序列

表2 MYBPC3基因外显子PCR引物序列

表3 TNNT2基因外显子PCR引物序列

实施例2

1.PCR-测序法检测MYH7基因外显子的突变

研究对象为医院诊断明确的肥厚型心肌病病人，共80例，经家族 调查无血缘关系。其中，包括肥厚型心肌病家系先证者40人，相关家 系成员285人，散发病例40人。正常研究对照80例为性别、年龄匹配 的健康人。

取患者EDTA抗凝静脉血3mL，用1.5mL管分装，每管300μL。每 管加入500μL红细胞裂解液(10mM PH＝7.5 Tris-Cl，0.32M蔗糖，1％ Triton-X-100，5mM MgCl₂)，混匀后9000rpm离心30s，倒掉上清。重 复以上步骤2-3次，直到上清变清澈为止。在上述白细胞沉淀中，加入 300μL白细胞裂解液(10mM PH＝8.0 Tris-Cl，400mM NaCl，2mM pH8.0 的Na₂EDTA)，及40μL 10％SDS，震荡30s，悬浮白细胞，置于56℃水浴 30min。然后加入120μL 5M NaCl，混匀后12000rpm离心3min。然后 将上清转移到另一只干净的1.5mL试管中，然后加入2倍体积(约900 μL)的无水乙醇，混匀后12000rpm离心5min。然后弃上清，加500μ L 70％乙醇，轻轻震荡数秒，12000rpm离心3min。弃上清，再次加500 μL 70％乙醇，轻轻震荡数秒，12000rpm离心3min。弃上清，风干，加 ddH₂O 40-50μL，测定OD_260/280(OD值在1.7-1.9比较合适)，-20℃保存 备用。

a.MYH7基因外显子的PCR扩增

所用的PCR扩增引物见表1，PCR扩增是指反应液为1μL的10×PCR  Buffer、1μL的2μM引物、1μL的2mM dNTP mix、1μL的15mM MgCl₂、 1U Taq酶、20ng/μL DNA模板加1μL，然后加ddH₂O至10μL。

反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，65℃退火30秒， 72℃延伸2分钟，共35个循环；72℃延伸5分钟。

按照上述条件对各患者或对照的基因组DNA进行PCR扩增。

b.扩增产物的纯化

取5μL扩增产物，向其中加入0.4μL 5U/μL的Exo I和1.6μL 1U/ μL的Fast AP，混匀离心后，于37℃下15min，85℃下15min，进行酶 切纯化。然后每管加入15μL ddH₂O进行稀释备用。

c.PCR产物的测序反应

测序反应中的PCR反应体系包括测序引物、PCR纯化产物和双脱氧 链终止法DNA测序。

采用经典的EDTA-乙醇法(每管加入1μL 125mM EDTA；每管加入25 μL 100％酒精，混匀，室温避光放置15min；12000rpm 4℃离心30min， 马上去除酒精；每管加入70-100μL 70％酒精，混匀，12000rpm 4℃离 心15min，马上去除酒精；让残余的酒精挥发干)纯化测序PCR产物， 纯化好的产物加入10μL Hi-Di甲酰胺，振荡混匀后，用ABI3730xl测 序仪进行测序，通用测序引物为是：UF：5’-ggaggactgctcacgaact-3’； UR：5’-gggacacgcagtcgacatc-3’，UF代表未甲基化特异性上游引物； UR代表未甲基化特异性下游引物，测序后的数据用Sequence Analysis 5.2和SeqScape 2.6软件进行数据分析，与参考序列进行比较，由此筛 选出的突变序列列于表4中。

所述双脱氧链终止法DNA测序的反应体系为0.25uL的2.5× BigDye、0.875uL5×BigDye Seq Buffer、1uL5pmoL/μL的引物、1.875uL 灭菌去离子水、1uL纯化的PCR产物；

反应条件：94℃预变性2分钟；94℃变性10秒，55℃退火10秒， 60℃延伸3分钟，25个循环。

表4 80例肥厚型心肌病患者MYH7基因突变筛查结果

2、PCR-测序法检测MYBPC3基因外显子的突变

MYBPC3基因外显子的PCR扩增与2基本相似，只是引物换成表2中 的引物。扩增产物的纯化与测序反应及测序产物的纯化按照实施例2操 作进行。由此筛选出的突变序列列于表5中。

表5 80例肥厚型心肌病患者MYBPC3基因突变筛查结果

3、PCR-测序法检测TNNT2基因外显子的突变

TNNT2基因外显子的PCR扩增与实施例2基本相似，只是引物换成 表3中的引物。扩增产物的纯化与测序反应及测序产物的纯化按照实施 例2操作进行。由此筛选出的突变序列列于表6中。

表680例肥厚型心肌病患者TNNT2基因突变筛查结果

在80例患者中未发现有能导致扩张型心肌病的突变。在80例正 常对照样品中未发现上述位点突变及其他能导致HCM的突变。

本发明有助于：(1)早期诊断：找出家族成员中无症状的遗传受累 者及无遗传受累者；(2)指导选择性生育，杜绝此病在这一家族中“蔓延”； (3)对高血压-心肌肥厚合并肥厚型心肌病患者进行鉴别诊断；(4)对运 动员心肌肥厚与肥厚型心肌病进行鉴别诊断；(5)与其他类型的心肌病 (如扩张型心肌病等)进行区分，对治疗起到一定的辅助作用。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围， 凡是利用本发明说明书及所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间 接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围 内。