包含抑制二肽基肽酶-IV活性的化合物以及其他抗糖尿病剂或抗肥胖剂作为活性成分的、用于预防和治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物

技术领域

本发明涉及用于预防和治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，所述 的药物组合物包含以下活性成分：抑制二肽基肽酶-IV(DPP-IV)活 性的化合物、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂合物；以及一 种或多种其他抗糖尿病剂或抗肥胖剂。

背景技术

二肽基肽酶-IV(在本文中称为DPP-IV)被称为DP-IV、DP-4 或DAP-IV，是符合以下条件的酶：在酶分类中通常被认定为 EC3.4.14.5；功能上属于丝氨酸蛋白酶(Barrett A.J.等人，Arch. Biochem.Biophys.，1995，247-250)；并且将N末端的二肽从以序列 H-Xaa-Pro-Y(或H-Xaa-Ala-Y)起始的肽上切断，其中Xaa代表任 意亲脂性氨基酸，Pro代表脯氨酸，Ala代表丙氨酸(Heins J.等人， Biochim.et Biophys.Acta，1988，161)。该酶分布广泛，并发现存在 于各种哺乳动物组织诸如肾、肝和小肠中(Hegen M.等人，J. Immunol.，1990，2908-2914)。DPP-IV起初被认定为膜结合蛋白。 近来，又认定了它的可溶形式(Duke-Cohan J.S.等人，J.Biol.Chem.， 1995，14107-14114)。根据最近发表的研究和报道显示，DPP-IV的 这一可溶形式与该酶的膜结合形式有着相同的结构和功能，并且发现 其在血液中不具有某种特定的膜结合结构域(Christine D.等人，Eur.J. Biochem.，2000，5608-5613)。

对DPP-IV最初的兴趣集中于其在激活T淋巴细胞方面的作用。 负责激活T淋巴细胞的DPP-IV被明确地定命为CD26。有报道表明， CD26与人类免疫缺陷病毒(HIV)相结合或是与其发生相互作用 (Guteil W.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1994，6594-6598)，因而 有人提出DPP-IV抑制剂在治疗AIDS方面可能有一定作用(Doreen  M.A.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1996，2745-2748)。

除了参与免疫系统的关键作用之外，DPP-IV的主要功能源于其 如上所述的肽分解活性。由于发现DPP-IV是牵涉到小肠中胰高血糖 素样蛋白-1(以下称为“GLP-1”)降解的关键酶，人们对DPP-IV的 作用给予了特别的关注(Mentlein R.等人，Eur.J.Biochem.，1993， 829-835)。GLP-1是由30个氨基酸组成的肽类激素，该肽类激素由 肠L细胞分泌，作为小肠摄入食物的响应(Goke R.等人，J.Biol. Chem.，1993，19650-19655)。由于已知这种肽类激素对于胰岛素在 控制餐后血糖水平方面的作用具有提高效力的效果(Holst J.J.等人， Diabetes Care，1996，580-586)，人们假定DPP-IV抑制剂也可能有 效地用于治疗II型糖尿病。基于这一假设，开发了早期形式的DPP-IV 抑制剂，并有一些报道证明了其在动物试验中的治疗有效性(Pauly R. P.等人，Metabolism，1999，385-389)。此外，缺少DPP-IV的小鼠或 大鼠维持GLP-1活性和高的胰岛素水平，从而使血糖水平降低， DPP-IV基因的这一基因中断或基因突变对个体动物的存活并未显示 出显著的影响(Marguet D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000， 6874-6879)。因此，人们提出，DPP-IV作为治疗II型糖尿病的强效 治疗剂是可行的，这也加快了DPP-IV抑制剂的研发。

GLP-1与各种组织中受体的结合会引起饱腹感(饱胀的感觉)、 胃排空的延迟以及受促进的胰β-细胞生长。因此，通过将GLP-1本 身进行静脉内给药，用于治疗上述II型糖尿病的临床试验正逐渐增 加(Verdich C.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，2001，4382-4389)。 GLP-1的体内半衰期仅为2分钟(Kieffer T.J.等人，Endocrinology， 1995，3585-3596)，因而如此短的半衰期成为直接将GLP-1用作治疗 剂的主要障碍。从那以后，众多的研究小组和研究机构针对GLP-1 的衍生进行了许多尝试，结果是开发出了能够将短的体内半衰期延长 的肽，并将其商品化(Deacon C.F.，Diabetes，2004，2181-2189)。 然而，这一GLP-1衍生物仍然受到作为注射制剂的根本性限制。此 外，由于活性GLP-1(7-36)仅在很短的时间内(如2分钟)被DPP-IV 降解并随后转化为非活性GLP-1(9-36)这一事实，大量的关注正越 来越多地集中于对高效DPP-IV抑制剂的开发。

开发DPP-IV抑制剂的开始阶段与其他抑制剂的开发趋势相类 似。也就是说，大多数的研究结果都是对于底物类似物而言的。这些 底物类似物中具有代表性的一种是作为早期研究的产物所得到的二 肽衍生物；基于DPP-IV对于含有脯氨酸这一特定氨基酸的肽显示出 显著亲和力的事实，上述早期研究在具有与脯氨酸(Pro)的结构类 似的母核上进行(Chinnaswamy T.等人，J.Biol.Chem.，1990， 1476-1483)。脯氨酸类似结构的典型实例包括吡咯烷(pyrrolidide) 和噻唑烷(thiazolidide)，并且含有这些母核化合物的衍生物对于 DPP-IV酶显示出可逆的竞争性抑制活性(Augustyns K J L.等人，Eur. J.Med.Chem.，1997，301-309)。在这些广泛研发的产物中，对于特 定化合物尤其是Val-Pyr(缬氨酸-吡咯烷)和Ile-Thia(异亮氨酸-噻 唑烷)等的作用机制和功效进行了不断的试验。特别来说，由于 Val-Pyr结构对于DPP-IV显示出相对较弱的抑制活性(Hanne B.R. 等人，Nat.Struct.Biol.，2003，19-25)，所以大量的关注都集中于 Ile-Thia，这推动了对Ile-Thia化合物衍生物进行深入细致的钻研和探 究。

除了上述钻研和探究所关注并得到的衍生化合物之外，具有最突 出的活性的化合物为由Merck&Co.，Inc.尝试开发的β-氨基酸噻唑烷 系列。然而，根据在大鼠中进行的药效学试验和药物动力学试验的结 果，所得到的化合物显示出十分低的生物利用度(bioavailability)， 并且在抑制酶活性方面具有明显的局限性(Jinyou Xu等人，Bioorg. Med.Chem.Lett.，2004，4759-4762)。因此，由于存在严重的缺点， 人们中断了对此系列化合物的进一步开发。

在上述调研的过程中，Merck注意到：除了噻唑烷化合物母核之 外，β-氨基酸同样是对于DPP-IV抑制活性具有显著效果的关键因素。 这一发现被应用于用不同的母核化合物代替噻唑烷母核的方法 (Linda L.B.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2004，4763-4766)。通 过随后的研究，人们合成出了用哌嗪母核代替噻唑烷母核的各种衍生 物，并进行了药效测试和药效学研究。遗憾的是，Merck的哌嗪衍生 物仍然受困于十分低的生物利用度。根据为克服这一缺点而进行的化 合物优化，人们通过将哌嗪基团修饰为三唑并哌嗪基团开发出了西他 列汀(Sitagliptin)，即产品MK-0431(商品名：JANUVIA)。在2006 年获得美国FDA新药批准的情况下，这一产品目前在市面上有售。

因此，本发明者发现当在哌嗪酮基团上进行的取代包含杂原子 时，与常规的DPP-IV抑制剂相比，如此修饰的化合物不仅具有优异 的DPP-IV抑制活性，而且能够实现显著改善的生物利用度；然后， 本发明者成功地合成了含有β-氨基的新型杂环化合物，并完成了由 下述式1表示的化合物的发明。基于这一点，提交了韩国专利申请号 2007-0038462的该化合物的申请。

(在式1中，X为OR¹、SR¹或NR¹R²，其中R¹和R²独立地为 C₁-C₅低级烷基，或NR¹R²的R¹和R²可形成含有杂元素O的5元环 至7元环。)

除了目前正积极开发的DPP-IV抑制剂之外，临床上使用的或正 在开发中的糖尿病治疗剂或肥胖症治疗剂包括α-葡糖苷酶抑制剂、 双胍、胰岛素促分泌素、胰岛素增敏剂和大麻素受体-1拮抗剂等。

α-葡糖苷酶抑制剂显示出延缓小肠吸收碳水化合物的作用，该抑 制剂包括阿卡波糖、伏格列波糖、乙格列酯和米格列醇等。双胍的实 例包括二甲双胍、苯乙双胍或丁双胍。胰岛素促分泌素可分为磺酰脲 类和非磺酰脲类。磺酰脲类的实例包括格列本脲(优降糖)、格列吡 嗪、格列齐特、格列美脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲、醋酸己脲、氨磺 丁脲、氯磺丙脲、格列波脲、格列喹酮、格列生脲、格列索脲、格列 派特、格列吡脲(glyclopyamide)、glycylamide和格列戊脲等。非磺 酰脲类的实例包括瑞格列奈和那格列奈等。

二甲双胍(一种典型的双胍)是调节高血糖水平而不刺激胰腺分 泌胰岛素的降血糖剂，并且其有利之处在于：由于二甲双胍与体重增 加无关，因此可将它应用于肥胖的糖尿病患者；同时由于它的作用机 理不同，也可将它应用于对磺酰脲药物不敏感的患者。尽管二甲双胍 的作用机理尚未清楚知晓，但与磺酰脲药物相比，该药物仅仅降低糖 尿病患者的血糖水平，而不影响正常受试者的血糖水平，并且不具有 任何刺激胰腺中的β-细胞从而刺激胰岛素分泌的作用。已知二甲双 胍增强外周细胞(例如肝脏和肌肉)中胰岛素的作用，并降低来自肝 脏的葡萄糖生成；据某些研究报道，二甲双胍在骨骼肌中发挥作用， 并使葡萄糖穿过细胞膜的运动作用增强。此外，二甲双胍的特征在于 改善血脂异常(dyslipidemia)以降低血LDL-胆固醇水平和血甘油三 酯水平。在临床上，可将二甲双胍以直至每日2000mg的相对较高的 剂量进行给予，每日两次(例如早晚各一次)。当给予的二甲双胍超 过2000mg时，随进餐每日给予三次，但最大每日剂量为2500mg。

将二甲双胍应用于体重过重的糖尿病患者时，它被评价为优异的 糖尿病治疗剂。然而，应该注意小心谨慎，因为可伴随有如下的不良 副作用：肠胃系统紊乱，例如腹泻、恶心和呕吐等；血液系统紊乱， 例如维生素B12缺乏等；乳酸性酸中毒，乳酸性酸中毒是严重的代 谢性并发症，该并发症较为罕见，但通过体内二甲双胍的累积可导致 50％的死亡率；以及诸如此类的副作用。

胰岛素增敏剂是相对新近开发的药物，具有噻唑烷二酮(TZD) 结构，并且作用于过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)。胰岛素增 敏剂的实例包括曲格列酮、环格列酮、罗格列酮(AVNADIA)、吡格 列酮(ACTOS)和恩格列酮等。除上述药物之外，尚有各种研究正 在进行。

大麻素受体-1拮抗剂是相对新近开发的药物靶标(drug targets)， 其抑制内源性大麻素(endocannabinoid)的过度活性来调节体重和能 量的平衡以及葡萄糖和脂质的代谢，并对存在于中枢神经系统和外周 神经系统中的大麻素受体-1(CB1受体)发挥作用。

大麻素受体-1拮抗剂的实例包括利莫那班(ACOMPLIA)、奥特 那班、伊必那班(Ibinabant)和苏利那班(Surinabant)等。除上述 药物之外，尚有各种研究正在进行。

然而，因为糖尿病或肥胖症是慢性病并且病症复杂，所以在许多 情况下，疾病的症状正在发展，并伴随有各种并发症。因此，有必要 选择最适于个体患者的病症的药剂。当单独给予单一药剂时，在一些 情况下根据症状可获得充分的效果。此外，在许多情况下，由于长期 给药会导致许多问题(例如剂量增加或出现不良副作用)，所以在临 床实践中难以选择药剂。因此，最近已提出组合给予一种或多种具有 不同机理的药物的各种方法，代替给予单一药剂的方法。

具体而言，对将DPP-IV抑制剂和常规的糖尿病治疗剂结合给药 的文献进行的研究表明，通过将3-20％(w/w)西他列汀、25-94％(w/w) 二甲双胍、0.1-10％(w/w)润滑剂和0-35％(w/w)粘合剂混合而制 备的药物组合物已经公开。对于可商购的化合物维格列汀(来自 Novartis，商品名为Galvus)的情况，在国际公开公报WO 07/078726 中公开了维格列汀和二甲双胍的比为50-98％、60-98％、70-98％或 80-98％的结合丸剂，国际公开公报WO 06/135693中记载了通过直接 压锭法(direct compression method)获得的维格列汀和PPAR激动剂 吡格列酮的结合丸剂。然而，这些文献记载了在包含DPP-IV抑制剂 和二甲双胍或PPAR激动剂的制剂中的药学最佳组成比例，而没有记 载这两种药物的协同作用。

此外，JPET(2004)，310，614-619中记载，在将DPP-IV抑制 剂缬氨酸-吡咯烷(val-pyr)与二甲双胍组合给予动物时，提高了胰 高血糖素样蛋白的水平，减少了食物的摄入和体重的增加，并协同地 提高了葡萄糖耐受性。

Life Science(2007)，81，72-79中公开，维格列汀和罗格列酮 结合给药使血清葡萄糖、甘油三酯和葡萄糖耐受性得到显著改善，已 有的不良副作用(例如由罗格列酮引起的水肿等)通过结合给予维格 列汀得以减轻。

国际公开公报WO 04/052362中发现，作为对维格列汀和微粉化 非诺贝特(PPAR激动剂)进行的葡萄糖耐受性试验的结果，单独给 予维格列汀时曲线下面积(AUC)减少了18％，单独给予非诺贝特 时的AUC降低了7％，但是结合给予这两种药物时，AUC降低了33％， 同时提高了胰岛素敏感性，减少了体重增加。

J.Pharmacol Sci.(2007)，104，29-38中提到，在将E3024(DPP-IV 抑制剂)、伏格列波糖(α-葡糖苷酶抑制剂)和阿卡波糖结合给药时， 有效地降低了餐后高血糖水平；JPET(2007)，320(2)，738-746中 提到，E3024与作为一种胰岛素促分泌素的格列本脲或那格列奈结合 给药也有效地降低了餐后高葡萄糖水平。

韩国专利公开号2003-0019440中提到，在将国际公开公报WO 99/061431中记载的化合物与常规的糖尿病治疗剂结合给药时，显著 降低了血浆DPP-IV活性、血红蛋白浓度(HbA1C，％)和血浆葡萄 糖。

国际公开公报WO 07/074884中记载，当阿格列汀(alogliptin) 与伏格列波糖、吡格列酮等结合给药时，增强了胰腺的保护作用。

国际公开公报WO 07/006769中提到，在将维格列汀和利莫那班 (二者为大麻素受体-1拮抗剂)结合给药时，有效地改善了血糖水平 和脂质水平以及体重；WO 06/119260中记载，当将西他列汀和大麻 素受体-1拮抗剂结合给药时，提高了葡萄糖耐受性和胰岛素耐受性。

因此，本发明者开发了式1的化合物(新型DPP-IV抑制剂)， 并发现当该化合物与抗糖尿病剂或抗肥胖剂结合给药时，显示出优异 的葡萄糖耐受性，有效地抑制了血糖水平，并减少了脂肪量(fat  mass)，由此完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供用于预防和治疗糖尿病或肥胖症的药物组 合物，所述的组合物包含抑制二肽基肽酶-IV活性的化合物和其他抗 糖尿病剂或抗肥胖剂作为活性成分。

根据本发明，用于所预防和治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物包 含以下活性成分：(1)由下述式1表示的化合物、其药学上可接受的 盐、其水合物或其溶剂合物；以及(2)一种或多种其他抗糖尿病剂 或抗肥胖剂。

(在式1中，X如本文所定义。)

根据本发明，包含作为一种新型DPP-IV抑制剂的化合物和一种 或多种其他抗糖尿病剂或抗肥胖剂作为活性成分的药物组合物可通 过给予该组合物而用于预防和治疗糖尿病和肥胖症等，从而与其他常 规的抗糖尿病药或抗肥胖药相比，增强了葡萄糖耐受作用、血糖水平 的抑制作用和脂肪量减少的作用。

附图说明

图1为显示出含有式1的化合物和二甲双胍的混合组合物的抗糖 尿病效果的等效线图(isobologram)。

图2为显示出在不同的动物给药剂量时，仅单一混合物组分的抑 制百分比以及比值为1∶1的混合组合物的抑制百分比的图。

图3为显示出在肥胖小鼠中，单剂量化合物1、二甲双胍和不同 的动物给药剂量比为1∶50至1∶150的混合组合物在葡萄糖耐受性方面 的抑制百分比的图。

图4为显示出在肥胖小鼠中，将化合物1、二甲双胍和不同的动 物给药剂量比为1∶50至1∶150的混合组合物给予2周后，在血浆葡萄 糖方面的抑制百分比的图。

图5为显示出在糖尿病小鼠中，将化合物1、PPARγ激动剂和不 同的动物给药剂量比为1∶0.01至1∶0.4的混合组合物给予七天后，在 血糖方面的抑制百分比的图。

图6为显示出化合物1、磺酰脲系列药剂和不同的剂量比为1∶0.2 至1∶3.2的混合组合物在血糖方面的抑制百分比的图。

图7为显示出化合物1、α-葡糖苷酶抑制剂和不同的剂量比为 1∶0.03至1∶0.18的混合组合物在血糖方面的抑制百分比的图；以及

图8为显示出化合物1、大麻素受体-1拮抗剂和不同的剂量比为 1∶1至1∶10的混合组合物在葡萄糖耐受性改善方面的抑制百分比的 图。

具体实施方式

下文，将详细地描述本发明。

本发明提供用于预防和治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，该组 合物包含以下活性成分：(1)由下述式1表示的化合物、其药学上可 接受的盐、其水合物或其溶剂合物；和(2)一种或多种其他抗糖尿 病剂或抗肥胖剂。

在式1中，

X为OR¹、SR¹、或NR¹R²；

其中，R¹和R²独立地为C₁-C₅低级烷基，或NR¹R²的R¹和R²可形成含有杂元素O的5元环至7元环。

式1中的C₁-C₅低级烷基可包括C₁-C₅烷基和环烷基。

由式1表示的化合物可具有两个不对称中心，因而可在β-碳和 哌嗪的3-位碳上具有不对称中心。因此，所述中心可以以单一非对映 异构体、外消旋体、外消旋混合物或非对映异构体混合物的形式存在， 所有这些形式均可包括于由本发明式1所表示的化合物之内。

此外，本发明的式1所表示的化合物可部分地以互变异构体的形 式存在，并且单独的互变异构体及其混合物可包括于本发明的化合物 之内。

可使用光学纯的起始原料或已知的试剂，根据本领域已知的常规 方法，通过立体选择合成得到本发明的立体异构体。

由本发明的式1表示的化合物优选的实例如下：

(1)(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲 基)哌嗪-2-酮；

(2)(S)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲 基)哌嗪-2-酮；

(3)(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(甲氧基甲基) 哌嗪-2-酮；

(4)(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(异丙氧基甲 基)哌嗪-2-酮；

(5)(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(环戊基氧基 甲基)哌嗪-2-酮；

(6)(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-[(二乙基氨 基)甲基]哌嗪-2-酮；

(7)(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-[(甲基乙基 氨基)甲基]哌嗪-2-酮；

(8)(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(吗啉代甲基) 哌嗪-2-酮；以及

(9)(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁基硫基 甲基)哌嗪-2-酮。

本发明式1的杂原子化合物的药学上可接受的盐可通过本领域 已知的任何制备盐的常规方法进行制备，所述杂原子化合物含有β- 氨基。

本文所使用的术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的、 无毒的碱或酸(包括无机碱或有机碱以及无机酸或有机酸)所制备的 盐。来源于无机碱的盐的实例包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、 亚铁盐、锂盐、镁盐、锰酸盐、锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。特别优 选铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。固态盐可具有一种或多种晶体结 构，或是可以以水合物的形式存在。来源于药学上可接受的无毒有机 碱的盐的实例包括一级胺、二级胺或三级胺、取代胺(如天然存在的 取代胺)、环胺或阳离子交换树脂，这些物质例如：精氨酸、甜菜碱、 咖啡因、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、二乙胺、2-(二乙基氨基)乙醇、 2-(二甲基氨基)乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、 还原葡萄糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、组氨酸、海巴 明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基还原葡萄糖胺、吗啉、哌 嗪、哌啶、多胺树脂(polyamine resin)、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、 三乙胺、三甲胺、三丙胺和氨丁三醇(tromethamine)等。

当本发明所述的化合物为碱性时，其盐可由药学上可接受的无毒 酸(包括无机酸和有机酸)制得。所述的酸的实例包括乙酸、苯磺酸、 苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢 溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、 粘酸(mucic acid)、硝酸、扑酸(pamoic acid)、泛酸、磷酸、琥珀 酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸和己二酸等。优选地，所述的药学上 可接受的酸可为乙酸、柠檬酸、盐酸、苹果酸、磷酸、琥珀酸、酒石 酸和己二酸。更优选地，所述的药学上可接受的酸可为酒石酸。

如本文中使用的那样，所指定的式1的化合物意在包括其药学上 可接受的盐。

本发明式1的化合物或其药学上可接受的盐的水合物意在包含 化学计算量或非化学计算量的水，所述的水通过非共价分子间作用力 结合。该水合物可含有1当量以上的水、通常为1-5当量的水。可通 过将本发明式1的化合物或者其药学上可接受的盐在水或含水溶剂 中进行结晶，来制备上述水合物。

本发明式1的化合物或其药学上可接受的盐的溶剂合物意在包 含化学计算量或非化学计算量的溶剂，所述的溶剂通过非共价分子间 作用力结合。优选的溶剂具有挥发性且无毒，并适于对人类进行给药。 例如，可提及乙醇、甲醇、丙醇和二氯甲烷等。

本发明式1的化合物可根据韩国专利申请号2007-0038462中的 记载容易地得到。具体而言，(1)可通过标准的成肽反应(peptidization  reaction)，将(3R)-叔丁氧羰基氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸和(R)-(3- 叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(以D-丝氨酸甲酯作为起始原料合成)合成 为中间体(R)-4-[(R)-2-(叔丁氧基甲基)-3-氧代哌嗪-1-基]-4-氧代 -1-(2，4，5-三氟苯基)-丁-2-基氨甲酸叔丁酯(步骤1)；然后经过脱保护 (步骤2)，再进行中和，从而得到式1形式的化合物。

式1的化合物为DPP-IV抑制剂，对DPP-IV和生物利用度显示 出优异的抑制活性，并且可用于预防和治疗由DPP-IV所引起的疾病， 例如糖尿病和肥胖症等。

与本发明式1所表示的化合物混合、以提供预防和治疗糖尿病或 肥胖症的组合物的抗糖尿病剂或抗肥胖剂可优选选自于由α-葡糖苷 酶抑制剂、双胍、胰岛素促分泌素、胰岛素增敏剂和大麻素受体-1 拮抗剂所组成的组。然而，并不限制于此。

本发明所述的双胍是指包含双胍结构且具有下述作用的药物：例 如无氧酵解促进作用、外周胰岛素增强作用、肠道吸收葡萄糖的抑制 作用和肝糖原异生的抑制作用。所述的双胍可选自于由二甲双胍、丁 双胍和苯乙双胍所组成的组，但并不限制于此。

本发明所述的胰岛素增敏剂是指下述药物：改善胰岛素作用功能 异常，以降低血糖水平；通常具有噻唑烷二酮(TZD)结构；并且作 用于过氧化物酶体增生物激活受体(PRAR)。所述的胰岛素增敏剂可 选自于由曲格列酮、环格列酮、罗格列酮(AVNADIA)、吡格列酮 (ACTOS)和恩格列酮所组成的组，但不限制于此。

本发明所述的胰岛素促分泌素是指促进胰腺β-细胞分泌胰岛素 的药物，并且可以是具有磺酰脲结构或非磺酰脲结构的药物。优选地， 所述的胰岛素促分泌素可以是具有磺酰脲结构的药物，该药物选自于 由格列本脲(优降糖)、格列吡嗪、格列齐特、格列美脲、妥拉磺脲、 甲苯磺丁脲、醋酸己脲、氨磺丁脲、氯磺丙脲、格列波脲、格列喹酮、 格列生脲、格列索脲、格列派特、格列吡脲、glycylamide和格列戊 脲所组成的组；或者所述的胰岛素促分泌素可以是具有非磺酰脲结构 的药物，例如瑞格列奈或那格列奈；但不限制于此。

本发明所述的α-葡糖苷酶抑制剂是指竞争性抑制α-葡糖苷酶的 药物，所述的α-葡糖苷酶为消化道中的一种消化酶，其抑制淀粉和 二糖等的消化和吸收。所述的α-葡糖苷酶抑制剂可选自于由阿卡波 糖、伏格列波糖、乙格列酯和米格列醇所组成的组，但不限制于此。

本发明所述的大麻素受体-1拮抗剂是指抑制内源性大麻素的过 度活性，以调节体重和能量平衡以及葡萄糖和脂质的代谢。所述的大 麻素受体-1拮抗剂可选自于由利莫那班(ACOMPLIA)、奥特那班、 伊必那班和苏利那班所组成的组，但不限制于此。

本发明所述的药物组合物的剂量(dose or dosage)随患者的体重、 年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排空速率 (evacuation rate)以及疾病的严重程度等而变化。通常的剂量单位 基于以单次剂量给予70公斤的人类受试者，以判断是否达到治疗有 效剂量的活性成分的量进行计算。然而，将会明了的是，活性成分的 精确的治疗有效剂量会随着所使用的各活性组分的相对量、所使用的 具体药物和上述的协同作用的比值而变化。

式1的化合物可优选以约0.1至约1,5000mg/kg的范围包含于药 物组合物中。然而，该范围可根据症状进行增减。

此外，公知的推荐剂量适合作为包含在本发明的药物组合物中的 其他抗糖尿病剂或抗肥胖剂的每日临床剂量。例如，约500mg至约 2000mg的剂量通常已知为二甲双胍的每日临床剂量。

可基于将要给予的剂量，在1∶16.7至1∶450的范围内对包含在本 发明的药物组合物中的由式1表示的化合物以及其他抗糖尿病剂或 抗肥胖剂的混合比进行选择。本领域技术人员可容易地确定将要给予 的最优治疗有效剂量，该剂量会随着以下因素而变化：以基于各自 ED₃₀值份数的协同比(synergistic ratio)使用的活性成分的量、制剂 的强度、给药的方式以及所治疗的病症或者疾病的发展情况。此外， 与所治疗的具体受试者有关的因素(包括受试者的年龄、体重、饮食 和给药时间)将使得需要将剂量调整至适当的治疗有效水平。

本发明所述的药物组合物可在基于各自ED₃₀值份数的协同比的 范围内进行给药。所述的ED₃₀值是指显示出30％的抑制百分比时药 物组合物的剂量。可通过如下方式得到抑制百分比：在血糖变化曲线 上，除去没有给予葡萄糖的组的曲线下面积，计算试验组的曲线下面 积；将得到的值与已经给予葡萄糖的对照组的值进行比较；计算抑制 比。通常，建议将有效剂量定义为在小鼠试验中将AUC抑制30％以 上的剂量(WO2006/076231A2)。

在本发明所述的药物组合物中，可以以基于各自ED₃₀值份数的 9∶1至1∶3的比值范围、更优选1∶1的比值包含式1的化合物和双胍。

在本发明所述的药物组合物中，当式1的化合物与双胍的混合比 为1∶16.7以下或1∶450以上(基于重量比)时，可出现功效不佳或者 不良副作用。相反，在1∶16.7至1∶450的范围内，可出现葡萄糖耐受 性方面的协同改善效果。因此，可优选以1∶16.7至1∶450(基于重量 比)的范围包含这两种药剂。然而，该比值并不限制于此。

在本发明所述的药物组合物中，当由式1表示的化合物和胰岛素 增敏剂的混合比为1∶0.01以下或1∶0.4以上(基于重量比)时，因为 偏离胰岛素增敏剂的每日临床剂量的值，所以可能出现功效不佳或者 不良副作用。相反，在1∶0.01至1∶0.4的范围内，可出现功效方面的 协同改善效果。因此，化合物1和胰岛素增敏剂的混合比可优选处于 1∶0.01至1∶0.4(基于重量比)的范围内。然而，该比值并不限制于 此，可根据症状进行调整。

在本发明所述的药物组合物中，当式1的化合物和胰岛素促分泌 素的混合比为1∶0.2以下或1∶3.2以上(基于重量比)时，该剂量可 超过胰岛素促分泌素的每日临床剂量，或者可出现功效不佳。相反， 在1∶0.2至1∶3.2的范围内，可出现功效方面的协同改善效果。因此， 化合物1和胰岛素促分泌素的混合比可优选在1∶0.2至1∶3.2的范围 内。然而，该比值并不限制于此。

此外，在本发明的药物组合物中，当由式1表示的化合物和α- 葡糖苷酶抑制剂的混合比为1∶0.03以下或1∶0.18以上(基于重量比) 时，该剂量可超过α-葡糖苷酶抑制剂的每日临床剂量，或者可能出 现功效不佳。相反，在1∶0.03至1∶0.18的范围内，可出现功效方面 的协同改善效果。因此，优选化合物1和α-葡糖苷酶抑制剂的混合 比在1∶0.03至1∶0.18的范围内。然而，该比值并不限制于此。

在本发明所述的药物组合物中，当式1的化合物和大麻素受体-1 拮抗剂的混合比为1∶0.1以下或1∶1以上(基于重量比)时，该剂量 可超过大麻素受体-1拮抗剂的每日临床剂量，或者可出现功效不佳。 因此，优选化合物1和大麻素受体-1拮抗剂的混合比在1∶1至1∶10 的范围内。然而，该比值并不限制于此。

本文所使用的术语“给予/给药”意思是采用适合的方法将预定 的物质引入到患者体内。只要能够使药到达所希望的组织，本发明所 述的组合物可通过任何常见途径进行口服给药或者胃肠外给药。同 时，可使用某些能够将活性物质运输到靶细胞内的设备，给予所述的 组合物。优选口服给予本发明所述的药物组合物，但并不限制于此。 胃肠外给药包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射或者胸腔内注射， 但并不限制于此。

在临床给药期间，本发明所述的药物组合物可配制成各种口服给 药或者胃肠外给药的诸多形式，并且可以这些形式进行给予所述的组 合物。

用于口服给药的剂型的实例可包括片剂、丸剂、硬胶囊剂/软胶 囊剂、溶液剂、悬浮液剂、乳剂、糖浆剂、颗粒剂和酏剂(elixirs) 等。除所述的活性成分外，这些药物制剂可含有一种或多种常规的稀 释剂或赋形剂，例如填充剂、增量剂(extenders)、润湿剂、崩解剂、 助流剂、粘合剂和表面活性剂等。崩解剂的实例可包括琼脂、淀粉、 海藻酸或其钠盐、无水磷酸一氢钙等。助流剂的实例可包括二氧化硅、 滑石、硬脂酸或其镁盐或钙盐、以及聚乙二醇等。粘合剂的实例可包 括硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素 钠、聚乙烯吡咯烷酮和低取代羟丙纤维素等。此外，该药物制剂可包 含稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和甘 氨酸等。如果希望的话，该制剂可进一步包含常规已知的泡腾混合物、 吸收剂、着色剂、香料和甜味剂等。

用于胃肠外给药的剂型的实例可包括无菌的水溶液剂、非水溶液 剂、悬浮液剂、乳剂、冻干剂或栓剂。可使用下述物质作为非水溶剂 或悬浮剂：丙二醇；聚乙二醇；植物油，例如橄榄油；可注射酯类， 例如油酸乙酯；以及诸如此类。可将诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、 乳化剂、稳定剂和防腐剂的常规添加剂用作可注射制剂的基质。通过 在水中将式1的化合物或其药学上可接受的盐与二甲双胍同稳定剂 或者缓冲剂混合，可将根据本发明实施例的药物组合物制成溶液剂或 者悬浮液剂，并且可制成单位剂型(例如安瓿或小瓶)。可对该组合 物进行灭菌，或者该组合物可包含辅料(例如，防腐剂、稳定剂、润 湿剂或乳化剂、用于渗透压调节的盐以及缓冲剂等)。此外，该组合 物可进一步包含其他治疗上有用的物质。该组合物可用常规方式通过 混合、造粒或者包衣的方法进行制备。

实施例

接下来，将参考下面的制备例、实施例、试验例和制剂例更为详 细地对本发明进行描述。然而，提供下列实例仅仅是为了说明性的目 的，并不应以任何方式限制本发明的范围。

<制备例>式1的化合物及其药学上可接受的盐的制备

<制备例1>(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基 甲基)哌嗪-2-酮的制备

步骤(1)：(R)-1-三苯甲基氮杂环丙烷-2-羧酸甲酯的制备

将200g的D-丝氨酸甲酯盐酸盐添加到1.8L的氯仿中，使反应 溶液冷却至0℃，向其中缓慢添加448mL三乙胺。向反应混合物中 缓慢添加358.4g三苯甲基氯后，搅拌1小时。将反应混合物升至室 温后，向其中添加1L氯仿，随后用2.5L水进行洗涤。将有机层用 硫酸镁进行干燥，并再次冷却至0℃，然后向其中依次缓慢添加484 mL三乙胺和15.7g的4-甲基氨基吡啶。将反应混合物搅拌5分钟， 并向其中缓慢添加139mL甲磺酰氯。将反应混合物升至室温后搅拌 4小时，然后回流12小时。将反应混合物冷却至室温，然后依次用4 L水和3L盐水进行洗涤。将有机层用硫酸镁进行干燥，再减压缩浓 至干。将3L乙醇添加到得到的残留物中，然后进行搅拌。所产生的 固体经过滤得到329g标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：7.42～7.49(m，6H)，7.18～7.32(m， 9H)，7.68(s，1H)，3.74(s，3H)，2.24(m，1H)，1.87(m，1H)， 1.40(m，1H)

步骤(2)：(R)-氮杂环丙烷-1，2-二羧酸1-苄基酯2-甲基酯的制备

将328.4g的(R)-1-三苯甲基氮杂环丙烷-2-羧酸甲酯溶解于1.4L 氯仿中，并使反应溶液冷却至0℃，然后向其中缓慢添加462mL三 氟乙酸。将反应混合物搅拌1小时，然后添加2L水，搅拌10分钟 后除去有机层。将水层用碳酸氢钠中和，不经进一步纯化即用于接下 来的反应。

向该水层中添加2L乙醚与120.5g碳酸氢钠，并使反应溶液冷 却至0℃，然后向其中缓慢滴入165mL氯甲酸苄酯。将反应混合物 搅拌2小时，然后除去水层。将有机层用硫酸镁进行干燥，再减压浓 缩蒸干，然后通过柱层析进行纯化，从而得到108.5g标题化合物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：7.32-7.36(m，5H)，5.13(s，2H)， 3.09(dd，J＝3.2，5.4Hz，1H)，2.58(dd，J＝1.2，3.2Hz，1H)，2.47 (dd，J＝1.2，5.4Hz，1H)

步骤(3)：(R)-2-氨基-3-叔丁氧基丙酸甲酯的制备

将1.1g的(R)-氮杂环丙烷-1，2-二羧酸1-苄基酯2-甲基酯溶解于 11mL氯仿中，再向其中添加18mL叔丁醇。然后向反应混合物中缓 慢滴入1.2mL BF₃OEt₂，再搅拌12小时。向反应混合物中添加2L 水将反应终止。然后，将有机层分离出来并用硫酸镁进行干燥，再减 压浓缩蒸干，不经进一步纯化即用于接下来的反应。

将得到的残留物溶解于10mL甲醇中，再向其中添加分散于2 mL乙酸乙酯中的740mg钯/碳，然后在环境大气压下通入1小时氢 气。将反应混合物过滤并减压蒸干，从而得到736mg标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：4.21(m，1H)，3.82(s，3H)， 3.74～3.88(m，2H)，1.20(s，9H)

步骤(4)：(R)-3-叔丁氧基-2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙基氨基]丙酸 甲酯的制备

将736mg在步骤3中制得的(R)-2-氨基-3叔丁氧基丙酸甲酯溶 解于14mL二氯甲烷中，然后向其中缓慢添加6335mg的N-叔丁氧 羰基-2-氨基乙醛的甲醇溶液。将反应混合物冷却至0℃，然后逐渐添 加1.2mL三乙胺和1.78g三乙酰氧基硼氢化钠。将反应混合物升至 室温，再搅拌12小时。向其中添加饱和碳酸氢钠溶液将反应终止， 将有机层用10mL水和盐水依次进行洗涤，然后减压浓缩蒸干。得 到的残留物通过柱层析进行纯化，从而得到355mg标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：5.10(m，1H)，3.71(s，3H)， 3.56(m，2H)，3.40(m，1H)，3.15～3.28(m，2H)，2.81(m，1H)， 267(m，1H)，1.42(s，9H)，1.13(s，9H)

步骤(5)：(R)-2-[(苄氧羰基)(2-叔丁氧羰基氨基)乙基氨基]-3-叔 丁氧基丙酸甲酯的制备

将355mg在步骤4中制得的(R)-3-叔丁氧基-2-[2-(叔丁氧羰基氨 基)乙基氨基]丙酸甲酯溶解于11mL四氢呋喃中，使所得反应混合物 冷却至0℃，然后向其中添加187mg碳酸氢钠。向其中缓慢滴入192 μl氯甲酸苄酯，然后将反应混合物升至室温。12小时后将反应混合 物减压蒸干，再添加10mL乙酸乙酯，然后用10mL水洗涤有机层。 将有机层用硫酸镁进行干燥，再减压蒸干，然后通过柱层析进行纯化， 从而得到410mg标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：7.36～7.25(m，5H)，5.82～5.72(m， 1H)，5.17～5.03(m，2H)，4.15(m，1H)，3.98(m，1H)，3.81(m， 1H)，3.73(s，3H)，3.60(m，1H)，3.42～3.28(m，3H)，1.40(s， 9H)，1.14(s，9H)

步骤(6)：(R)-2-(叔丁氧基甲基)-3-氧代哌嗪-1-羧酸苄酯的制备

将410mg在步骤5中制得的(R)-2-[(苄氧羰基)(2-叔丁氧羰基氨 基)乙基氨基]-3-叔丁氧基丙酸甲酯溶解于10mL甲醇中，使反应混合 物冷却至0℃，然后向其中缓慢添加4mL的2N盐酸/乙醚，再搅拌 3小时。将反应混合物减压蒸干，不经进一步纯化即用于接下来的反 应。

将得到的残留物溶解于10mL二氯甲烷中，使反应混合物冷却 至0℃，然后向其中缓慢添加152μl三乙胺。将1.1mL三甲基铝(2.0M 的甲苯溶液)缓慢添加到反应混合物中，并将反应混合物升至室温， 然后搅拌12小时。使反应混合物冷却至0℃，并添加饱和氯化铵水 溶液终止反应。将10mL乙酸乙酯添加到反应混合物中，再用10mL 盐水进行洗涤。将有机层用硫酸镁干燥，然后减压蒸干。将得到的残 留物通过柱层析进行纯化，得到103mg标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：7.34～7.25(m，5H)，6.27(m， 1H)，5.14(m，2H)，4.57(m，1H)，4.19(m，1H)，4.08(m，1H)， 3.94(m，1H)，3.74(m，1H)，3.64(m，1H)，3.42(m，1H)，3.29 (m，1H)，1.09(s，9H)

步骤(7)：(R)-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮的制备

将103mg在步骤6中制得的(R)-2-(叔丁氧基甲基)-3-氧代哌嗪-1- 羧酸苄酯溶解于2mL甲醇中，再向其中添加分散于1mL乙酸乙酯 中的50mg钯/碳，然后在环境大气压下通入1小时氢气。将反应混 合物过滤并减压蒸干，得到58mg标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：6.41(brs，1H)，3.76(m，3H)， 3.63(m，1H)，3.52(m，1H)，3.42(m，1H)，3.28(m，1H)，3.16 (m，1H)，2.95(m，1H)，2.45(brs，1H)，1.17(s，9H)

步骤(8)(R)-4-[(R)-2-(叔丁氧基甲基)-3-氧代哌嗪-1-基]-4-氧代 -1-(2，4，5-三氟苯基)丁-2-基氨甲酸叔丁酯的制备

将104mg(3R)-叔丁氧基羰基氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸和58 mg的(R)-(3-叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮添加到4mL的N，N-二甲基甲酰 胺中，然后向其中添加63mg的1-羟基苯并三唑(HOBT)和217μl 二异丙基乙基胺。使反应混合物冷却至0℃，并向其中添加78mg的 1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)，然后在室温下搅拌 12小时。将反应混合物用10mL乙酸乙酯进行稀释，再用盐水洗涤 两次。将有机层用硫酸镁进行干燥，然后进行浓缩。将得到的残留物 通过柱层析进行纯化，得到97mg标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：7.03(m，1H)，6.88(m，1H)， 5.97(m，1H)，5.48(m，1H)，4.16～4.07(m，1H)，4.02～3.91(m， 1H)，3.74(m，2H)，3.37(m，2H)，3.24(m，1H)，2.92(m，2H)， 2.80(m，1H)，2.59(m，2H)，1.34(d，9H)，1.13(s，9H)

步骤(9)：(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁 氧基甲基)哌嗪-2-酮的制备

将97mg在步骤8中制得的(R)-4-[(R)-2-(叔丁氧基甲基)-3-氧代 哌嗪-1-基]-4-氧代-1-(2，4，5-三氟苯基)丁-2-基氨甲酸叔丁酯溶解于3 mL甲醇中，然后添加2mL的2N-盐酸/乙醚，再在室温下搅拌3小 时。

将反应混合物减压浓缩蒸干，向其中添加10mL的5％碳酸氢钠 水溶液，然后用10mL二氯甲烷/2-丙醇(4/1(v/v))的混合溶液萃 取两次，再将有机层减压蒸干，得到55mg固体标题化合物。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：7.27(m，1H)，7.14(m，1H)， 4.56～4.39(m，1H)，3.96～3.81(m，3H)，3.70(m，1H)，3.46(m， 1H)，3.43～3.32(m，1H)，2.83～2.65(m，3H)，2.58～2.40(m，2H)， 1.16(s，3H)，1.11(s，6H)

<制备例2>(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(甲氧基甲 基)哌嗪-2-酮的制备

用甲醇代替制备例1的步骤3中的叔丁醇，然后通过与制备例1 的步骤4至步骤9类似的方式合成标题化合物。

<制备例3>(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(异丙氧基 甲基)哌嗪-2-酮的制备

用异丙醇代替制备例1的步骤3中的叔丁醇，然后通过与制备例 1的步骤4至步骤9类似的方式合成标题化合物。

<制备例4>(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(环戊基氧 基甲基)哌嗪-2-酮的制备

使用环戊醇代替制备例1的步骤3中的叔丁醇，然后通过与制备 例1的步骤4至步骤9类似的方式合成标题化合物。

<制备例5>(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-[(二乙基 氨基)甲基]哌嗪-2-酮的制备

在制备例1的步骤3中，加入二乙胺代替叔丁醇，并用回流代替 BF₃OEt₂的加入，然后通过与制备例1的步骤4至步骤9类似的方式 合成标题化合物。

<制备例6>(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-[(甲基乙 基氨基)甲基]哌嗪-2-酮的制备

在制备例1的步骤3中，用甲乙胺代替叔丁醇，并用回流代替 BF₃OEt₂的加入，然后通过与制备例1的步骤4至步骤9类似的方式 合成标题化合物。

<制备例7>(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(吗啉代甲 基)哌嗪-2-酮的制备

在制备例1的步骤3中，用吗啉代替叔丁醇，并用回流代替 BF₃OEt₂的加入，然后通过与制备例1的步骤4至步骤9类似的方式 合成标题化合物。

<制备例8>(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁基硫 基甲基)哌嗪-2-酮的制备

用叔丁基硫醇代替制备例1的步骤3中的叔丁醇，然后通过与制 备例1的步骤4至步骤9类似的方式合成标题化合物。

<制备例9>(S)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基 甲基)哌嗪-2-酮的制备

用L-丝氨酸甲酯盐酸盐代替制备例1的步骤1中的D-丝氨酸甲 酯盐酸盐，然后通过与制备例1的步骤2至步骤9类似的方式合成标 题化合物。

<实施例>包含式1的化合物和抗糖尿病药物或抗肥胖药物的组合物 的制备

<实施例1>式1所表示的化合物和双胍的混合组合物的制备

<实施例1-1>以基于ED₃₀的比值9∶1包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和二甲双胍的药物组合物的制备

称取制备例1中制得的化合物和二甲双胍，用0.5％的甲基纤维 素制备10mL/kg的悬浮液，组成均为(0.045-0.36mg/kg制备例1中 制得的化合物：0.75-6mg/kg二甲双胍)/10mL。

<实施例1-2>以基于ED₃₀的比值3∶1包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和二甲双胍的药物组合物的制备

用类似于实施例1-1中的方法进行制备，组成均为(0.042-0.33 mg/kg制备例1中制得的化合物：1.25-10mg/kg二甲双胍)/10mL。

<实施例1-3>以基于ED₃₀的比值1∶1包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和二甲双胍的药物组合物的制备

用类似于实施例1-1中的方法进行制备，组成均为(0.025-0.2 mg/kg制备例1中制得的化合物：3.25-30mg/kg二甲双胍)/10mL。

<实施例1-4>以基于ED₃₀的比值3∶1包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和二甲双胍的药物组合物的制备

用类似于实施例1-1中的方法进行制备，组成均为(0.0125-0.1 mg/kg制备例1中制得的化合物：5.625-45mg/kg二甲双胍)/10mL。

<实施例2>式1所表示的化合物和胰岛素增敏剂的混合组合物的制 备

<实施例2-1>以基于重量比的比值1∶0.4包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和罗格列酮的药物组合物的制备

称取在制备例1中制得的化合物和罗格列酮，用0.5％的甲基纤 维素制备5mL/kg的悬浮液，组成均为(1mg制备例1中制得的化合 物+0.4mg罗格列酮)/5mL。

<实施例2-2>以基于重量比的比值1∶0.01包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和罗格列酮的药物组合物的制备

用类似于实施例2-1中的方法进行制备，组成均为(40mg制备 例1中制得的化合物+0.4mg罗格列酮)/5mL。

<实施例3>式1所表示的化合物和胰岛素促分泌素的混合组合物的 制备

<实施例3-1>以基于重量比的比值1∶0.2包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和格列美脲的药物组合物的制备

称取制备例1中制得的化合物和格列美脲，用0.5％的甲基纤维 素制备10mL/kg的悬浮液，组成均为(0.1mg制备例1中制得的化 合物+0.02mg格列美脲)/10mL。

<实施例3-2>以基于重量比的比值1∶3.2包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和格列美脲的药物组合物的制备

用类似于实施例3-1中的方法进行制备，组成均为(0.1mg制备 例1中制备的化合物+0.32mg格列美脲)/10mL。

<实施例4>式1所表示的化合物与α-葡糖苷酶抑制剂的混合组合物 的制备

<实施例4-1>以1∶0.03的比值包含(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三 氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐)和伏格列波 糖的药物组合物的制备

称取在制备例1中制得的化合物和伏格列波糖，用0.5％的甲基 纤维素制备10mL/kg的悬浮液，组成均为(0.3mg制备例1中制得 的化合物+0.009mg伏格列波糖)/10mL。

<实施例4-2>以1∶0.18的比值包含(R)-4-[(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三 氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐)和伏格列波 糖的药物组合物的制备

用类似于实施例4-1中的方法进行制备，组成均为(0.3mg制备 例1中制得的化合物+0.054mg伏格列波糖)/10mL。

<实施例5>式1所表示的化合物和大麻素受体-1拮抗剂的混合组合 物的制备

<实施例5-1>以基于重量比的比值1∶10包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和利莫那班的药物组合物的制备

称取在制备例1中制得的化合物和利莫那班，用0.5％的甲基纤 维素制备5mL/kg的悬浮液，组成均为(0.3mg制备例1中制得的化 合物+3mg利莫那班)/5mL。

<实施例5-2>以基于重量比的比值1∶1包含(R)-4-[(R)-3-氨基 -4-(2，4，5-三氟苯基)丁酰基]-3-(叔丁氧基甲基)哌嗪-2-酮(酒石酸盐) 和利莫那班的药物组合物的制备

用类似于实施例5-1中的方法进行制备，组成均为(3mg制备 例1中制得的化合物+3mg利莫那班)/5mL。

<试验例1>制备例中得到的化合物的混合组合物的协同作用的测定

<1-1>将制备例1中制得的化合物与二甲双胍的混合组合物单 次给予正常小鼠时产生的协同作用的测定

为了检验将本发明制备例1中制备的化合物与二甲双胍的混合 组合物单次给予所产生的协同作用，对单一物质和混合组合物进行下 面的试验。

试验对象与试验方法

将作为试验对象的实验用小鼠(C57BL/6小鼠)在试验前禁食 16-17小时。试验当天早上从小鼠的尾静脉采集血液，用ACCU-CHEK 活力型血糖仪(Roche Diagnostics)对血糖水平进行测定。在给予葡 萄糖前30分钟(-30分钟)，口服给予本发明的药物组合物；30分钟 后(0分钟)，再口服给予葡萄糖溶液(2g/kg/10mL)。在下述指定 的时间点进行血液的采集：即将给予药物之前、即将给予葡萄糖之前 以及给予葡萄糖后15、30、60、90和120分钟。

制备例1中制得的化合物和二甲双胍的ED₃₀的计算

通过抑制百分比(％)和ED₃₀，确定在口服葡萄糖耐量试验 (OGTT)中单次给予单一药物对血糖变化曲线的影响。通过从葡萄 糖负荷组(glucose challenged groups)中减去非葡萄糖负荷对照的血 糖AUC，再将得到的值与已经给予葡萄糖的对照组的值进行比较， 由经归一化为非葡萄糖负荷对照的曲线下面积(AUC)数据产生每次 治疗的抑制百分比的值。通常，建议将有效剂量定义为在小鼠试验中 将AUC抑制30％以上时的剂量(WO2006/076231A2)。ED₃₀值是指 显示出30％的抑制百分比时的剂量，采用线性回归分析对本实施例的 第三剂量间隔时间(the third dose interval)进行计算。

结果确定，本发明制备例1中制得的化合物的ED₃₀为0.20 mg/kg，二甲双胍的ED₃₀为29.6mg/kg(表1、表2)。

<表1>制备例1中制得的化合物的葡萄糖耐受性结果

<表2>二甲双胍的葡萄糖耐受性结果

对制备例1中制得的化合物和二甲双胍的混合复合物(实施例1 中的混合组合物)的协同作用程度的测定

通过等效线图，对每种固定比值的组合物可行的协同作用 (feasible synergistic effetcs)进行分析(R.J.Tallarida等，Life Sci. 1989，45，947)。该方法包括确定混合物的剂量(OGTT试验中显示 30％的抑制百分比时的剂量(ED_30mix))以及在简单加和的情况下预 计的相应剂量(ED_30add)。当在某个固定比值处，确定ED_30mix＜ED_30add时，混合物具有协同作用。ED_30add由各药物的ED₃₀计算得到。在图 1中，各物质ED₃₀值的份数在其各自的坐标轴上给出。如图1中的 值1所示，仅使用制备例1中制得的化合物时的ED₃₀值为0.2mg/kg； 如图1中的值1所示，仅使用二甲双胍时的ED₃₀值为30mg/kg。因 此，将这两种单一药物的ED₃₀值组合起来的线表示由不同比值下的 葡萄糖耐受作用计算得到的简单加和(ED_30add)。因此，在图1中关 于所研究的每种混合物指定的点A、B、C和D表示：通过对在制备 例1中制得的化合物与二甲双胍的比值为9∶1、5∶1、1∶1和1∶3的混 合物进行的实际试验，测得的ED₃₀值(ED_30mix)的份数。图1中点 A′、B′、C′和D′表示在简单加和的情况下预计的剂量(ED_30add)的份 数，对应于制备例1中制得的化合物和二甲双胍的比值为9∶1、5∶1、 1∶1和1∶3的混合物。

用所希望的比值乘以0.2mg/kg和30mg/kg(分别为制备例1中 制得的化合物的ED₃₀值和二甲双胍的ED₃₀值)，计算出每个份数中 实际给予动物的剂量比。给药在如下范围内进行：0.045-0.36mg/kg 制备例1中制得的化合物+0.75-6mg/kg二甲双胍，比值9∶1； 0.042-0.33mg/kg制备例1中制得的化合物+1.25-10mg/kg二甲双胍， 比值5∶1；0.025-0.2mg/kg制备例1中制得的化合物+3.25-30mg/kg 二甲双胍，比值1∶1；0.0125-0.2mg/kg制备例1中制得的化合物+ 5.625-45mg/kg二甲双胍，比值1∶3。当将这种组成应用于健康的成 年人时(约70kg)，该剂量对应于0.88-25.2mg制备例1中制得的化 合物和52.5-3150mg二甲双胍，并且该剂量包含了二甲双胍的每日 临床剂量500-2000mg。由试验得到，比值为9∶1、5∶1、1∶1、和1∶3 的混合物ED_30mix/ED_30add值为0.817、0.437、0.359和0.443，这些值 基于制备例1中制得的化合物和二甲双胍各自的ED₃₀值的份数进行 计算(表3)。由此结果出发，通过将对应于各比值的ED_30add的实际 剂量与ED_30mix/ED_30add相乘计算出ED_30mix；并确定由于在全部的比值 都有ED_30mix＜ED_30add，因此观察到了协同葡萄糖耐受性的改善效果。 具体而言，在比值为5∶1、1∶1和1∶3的混合物中在葡萄糖耐受性 (ED_30add/ED_30mix)方面观察到了2倍以上的改善效果。表3和图1 的等效线图表明了基于各物质ED₃₀值的份数所选择的恰当比值的相 互作用。

<表3>制备例1中制得的化合物与二甲双胍的混合组合物的协 同作用

( )表示在图1中的等效线图上的位置。

此外，图2表明了与单独给予每种物质的抑制百分比相比，该混 合组合物在葡萄糖耐受性方面显示出显著的改善效果。

结果，当将该比值转化为制备例1中制得的化合物与二甲双胍实 际给予动物的剂量比时，在1∶16.7至1∶450这一宽的剂量范围中观察 到了葡萄糖耐受性的改善效果。

<1-2>将制备例1中制得的化合物与二甲双胍的混合组合物对 肥胖小鼠进行单次给予和重复给予所产生的协同作用的测定

试验对象与试验方法

为了对将本发明制备例1中制得的化合物和二甲双胍的复合物 重复给予所产生的协同作用进行检验，评价向肥胖小鼠单次给药对于 OGTT血糖变化曲线的影响以及2周重复给药对于血糖抑制百分比的 影响。通过向试验小鼠(C57BL/6小鼠)供应5个月的高脂肪饲料 (60kcal％脂肪，Research Diets，D12492)，将所得到的饮食诱导的 肥胖小鼠用作试验对象。用0.5％的甲基纤维素(MC)制得在制备例 1中制得的化合物1的悬浮液，组成为0.1mg/kg和0.15mg/kg。用 0.5％的MC制备二甲双胍的悬浮液，组成为7.5mg/kg和15mg/kg。 按如下剂量制备6mL/kg的复合物：(0.1mg/kg制备例1中制得的化 合物+15mg/kg二甲双胍)/5mL和(0.15mg/kg制备例1中制得的 化合物+7.5mg/kg二甲双胍)/5mL。

将肥胖小鼠在试验前禁食16-17小时，试验当天早晨从小鼠的尾 静脉采集血液，用ACCU-CHEK活力型血糖仪(Roche Diagnostics) 对血糖水平进行测定。在给予葡萄糖之前30分钟(-30分钟)，口服 给予本发明的混合组合物；30分钟后(0分钟)，再口服给予葡萄糖 溶液(2g/kg/mL)。在下述指定的时间点进行血液的采集：即将给予 药物之前、即将给予葡萄糖之前以及给予葡萄糖后15、30、60、90 和120分钟。通过计算各组的曲线下面积，并将得到的值与已给予葡 萄糖的对照组的值进行比较，计算出抑制百分比的值。

单次给予混合组合物所产生的协同作用的测定

下面的表4、表5和图3显示出将所给予的各种药物进行单次给 予所产生的抑制百分比。

<表4>制备例1中制得的化合物和二甲双胍的抑制百分比

<表5>制备例1中制得的化合物和二甲双胍的混合组合物的抑 制百分比

对于血糖AUC的改善作用而言，0.1mg/kg和0.15mg/kg的制备 例1中制得的化合物显示出2％和3％的抑制百分比，而7.5mg/kg和 15mg/kg的二甲双胍显示出7％和11％的抑制百分比。相反，0.1mg/kg 制备例1中制得的化合物+15mg/kg二甲双胍的复合物以及0.15 mg/kg制备例1中制备的化合物+7.5mg/kg二甲双胍的复合物其血糖 AUC分别被抑制了19％和28％。这表明观察到了比单次给予单一药 物的算术和(arithmetic sum)更高的协同作用(图3)。

重复给药所产生的协同作用

表6、表7和图4显示出重复给药2周后的抑制百分比。

<表6>给予制备例1中制得的化合物和二甲双胍所产生的抑制 百分比

<表7>制备例1中制得的化合物和二甲双胍的混合组合物的抑 制百分比

与对照组相比，通过给予0.1mg/kg和0.15mg/kg制备例1中制 得的化合物，使血浆葡萄糖改善了2％和15％。与对照组的水平相比， 7.5mg/kg和15mg/kg二甲双胍使将血浆葡萄糖改善了13％和14％。 相反，0.1mg/kg制备例1中制得的化合物+15mg/kg二甲双胍的复 合物或者是0.15mg/kg制备例1中制得的化合物+7.5mg/kg二甲双 胍的复合物使血浆葡萄糖分别改善了21％和31％。这表明观察到了 比单次给予单一药物的算术和更高的协同作用(图4)。

结果，当将该比值转化为制备例1中制得的化合物和二甲双胍在 重复给药期间被实际给予动物的剂量比时，在1∶50至1∶150这一宽的 剂量范围中观察到了协同功效方面的改善效果。

<试验例2>对肥胖小鼠给予式1的化合物和胰岛素增敏剂的混合组 合物所产生的协同作用的测定

<2-1>将制备例1中制得的化合物和罗格列酮的混合组合物对 肥胖小鼠进行重复给予所产生的协同作用的测定

试验对象与试验方法

为了对本发明制备例1中制备的化合物与PPARγ激动剂(胰岛 素增敏剂)的复合物的协同作用进行检验，评价向作为糖尿病小鼠的 db/db小鼠重复给予所述的复合物所产生的血糖抑制百分比。使用八 周龄的雄性小鼠(db/db小鼠)作为试验对象。已知罗格列酮为TZD 系列的药物，它与目前用于临床实践的吡格列酮具有相同的母核，并 通过相同的机理对血糖进行调节；考虑到基于ED₃₀(就糖尿病小鼠 试验中的血糖降低而言)的临床剂量的必要比值，将上述评价当中罗 格列酮的剂量选定为0.4mg/kg。考虑到预计临床剂量的复合比 (complex ratio)，对于固定剂量的罗格列酮，将制备例1中制得的化 合物的剂量选定为1mg/kg和40mg/kg(复合比1∶0.01至1∶0.4)。由 于1∶0.01以下至1∶0.4以上的复合比为偏离罗格列酮的每日临床剂量 的值，因而担心可能出现功效不佳或不良副作用，所以将该复合比限 定在1∶0.01至1∶0.4。用0.5％的甲基纤维素(MC)制备各种药物浓 度的悬浮液。称取各种化合物，用0.5％的甲基纤维素制备5mL/kg 的悬浮液，每种组成为(1mg制备例1中制备的化合物+0.4mg罗 格列酮)/5mL以及(40mg制备例1中制备的化合物+0.4mg罗格 列酮)/5mL。

对糖尿病小鼠口服给予药物，给药1小时后从尾静脉采集血液， 用ACCU-CHEK活力型血糖仪(Roche Diagnostics)对血糖进行测定。 与对照组进行比较，计算关于血糖的抑制百分比。

给药所产生的协同作用的测定

下面的表8、表9和图5显示出与对照组相比，给药7天所产生 的血糖抑制百分比的试验结果。

<表8>在给予制备例1中制备的化合物和罗格列酮期间的抑制 百分比

<表9>在给予制备例1中制备的化合物和罗格列酮的混合组合 物期间的抑制百分比

与对照组相比，给予1mg/kg和40mg/kg制备例1中制得的化 合物所产生的血糖抑制百分比经计算分别为21％和11％；给予0.4 mg/kg的PPARγ激动剂罗格列酮使得抑制百分比改善了10％。此外， 1mg/kg制备例1中制得的化合物+0.4mg/kg罗西格列酮的复合物或 者是40mg/kg制备例1中制得的化合物+0.4mg/kg罗格列酮的复合 物经计算分别改善了49％和79％。这表明观察到了比单次给予单一 药物的算术和更高的协同作用(图5)。

结果，将该比值转化为制备例1中制得的化合物和PPARγ激动 剂罗格列酮被实际给予糖尿病小鼠的剂量比时，在1∶0.01至1∶0.4这 一宽的剂量范围中观察到了协同功效方面的改善效果。

<试验例3>制备例1中制得的化合物和胰岛素促分泌素的混合组合 物的协同作用的测定

<3-1>将制备例1中制得的化合物和格列美脲的混合组合物进 行单次给予所产生的协同作用的测定

试验对象与试验方法

为了对本发明制备例1中制得的化合物和磺酰脲系列药物(胰岛 素促分泌素)的复合物的协同作用进行检验，评价单一物质和复合物 对单次给药的OGTT血糖变化曲线的抑制百分比。使用8周龄的雄 性试验小鼠(C57BL/6小鼠)，使其在试验前禁食16-17小时。试验 当天早晨从尾静脉采集血液，用ACCU-CHEK活力型血糖仪(Roche  Diagnostics)对血糖水平进行测定。在给予葡萄糖之前30分钟(-30 分钟)，口服给予本发明的混合组合物；30分钟后(0分钟)，口服给 予葡萄糖溶液(2g/kg/10mL)。在下述指定的时间点进行血液的采集： 即将给予药物之前、即将给予葡萄糖之前以及给予葡萄糖后15、30、 60、90和120分钟。通过计算除去未给予葡萄糖的组之后各组的曲 线下面积，再将得到的值与已给予葡萄糖的对照组的值进行比较，计 算出抑制百分比的值。为了对本次评价中复合物的协同作用或加和作 用(additive effects)进行评价，用0.5％的甲基纤维素(MC)制备 0.1mg/kg制备例1中制得的化合物的悬浮液，同时用0.5％的MC制 备组成为0.02mg/kg和0.32mg/kg磺酰脲系列药物格列美脲(胰岛 素促分泌素)的悬浮液，从而使得复合比可以涵盖在预计的临床剂量 内，该复合比处于使制备例1中制得的化合物的剂量保持不变的状 态。格列美脲为促进胰腺分泌胰岛素的药物，其具有与格列吡嗪和格 列本脲等相同的机理。通过称取单一化合物并混合，以10mL/kg制 得格列美脲的复合物，该复合物的组成为：(0.1mg制备例1中制得 的化合物+0.02mg格列美脲)/10mL以及(0.1mg制备例1中制得 的化合物+0.32mg格列美脲)/10mL。当该混合比为1∶0.2以下或1∶3.2 以上时，可出现功效不佳或不良副作用。因此，将制备例1中制得的 化合物与格列美脲的混合比设定为1∶0.2至1∶3.2。

通过给药所产生的协同作用的测定

下面的表10、表11和图6显示出与试验中对照组相比，血糖抑 制百分比的试验结果。

<表10>给予制备例1中制得的化合物和格列美脲所产生的抑制 百分比

<表11>给予制备例1中制备的化合物和格列美脲的混合组合物 所产生的抑制百分比

作为该试验的结果，与对照组相比，0.1mg/kg制备例1中制得 的化合物1的情况显示出7.7％的抑制百分比。当使用0.02mg/kg和 0.32mg/kg的格列美脲时，与对照组相比，血糖的抑制百分比经计算 分别为-3.69％和10.9％。此外，当使用0.1mg/kg制备例1中制得的 化合物+0.02mg/kg格列美脲的复合物以及0.1mg/kg制备例1中制 得的化合物+0.32mg/kg格列美脲的复合物时，该抑制百分比经计算 分别为20.2％和48.7％。这表明观察到了比单次给予单一药物的算术 和更高的协同作用(图6)。

总而言之，在制备例1中制得的化合物和格列美脲的剂量比为 1∶0.2至1∶3.2的范围中，观察到了协同作用的改善。

<试验例4>式1的化合物和α-葡糖苷酶抑制剂的混合组合物的协同 作用的测定

<4-1>将在制备例1中制得的化合物与伏格列波糖的混合组合 物进行给予所产生的协同作用的测定

试验对象与试验方法

为了对本发明制备例1中制得的化合物与α-葡糖苷酶抑制剂系 列药物在将药物复合后所产生的协同作用进行检验，评价单一物质及 其复合物在单次给药口服蔗糖耐受性试验血糖变化曲线中的抑制百 分比。使用8周龄雄性试验小鼠(C57BL/6小鼠)作为试验对象。使 小鼠在试验前禁食16-17小时。试验当天早晨从小鼠的尾静脉采集血 液，用ACCU-CHEK活力型血糖仪(Roche Diagnostics)对血糖水平 进行测定。在给予蔗糖之前30分钟(-30分钟)，口服给予本发明的 药学混合组合物；30分钟后(0分钟)，口服给予葡萄糖溶液(2g/kg/10 mL)。在下述指定的时间点进行血液的采集：即将给予药物之前、即 将给予蔗糖之前以及给予蔗糖后15、30、60、90和120分钟。通过 计算除去未给予蔗糖的组以后各组的曲线下面积，并将得到的值与已 给予蔗糖的对照组的值进行比较，计算出抑制百分比值。为了对本次 评价中的复合物所产生的协同作用或加和作用进行评价，用0.5％的 甲基纤维素(MC)制得剂量为0.3mg/kg的制备例1中制得的化合 物的悬浮液，同时用0.5％的MC制备组成为0.009mg/kg和0.054 mg/kg的α-葡糖苷酶抑制剂伏格列波糖的悬浮液(复合比1∶0.03至 1∶0.18)，从而使得该复合比可以涵盖在预计的临床剂量内，该复合比 处于使制备例1中制得的化合物的剂量保持不变的状态。伏格列波糖 为与阿卡波糖具有相同机理的药物，称取单一药物，以得到下述组成 并制备成10mL/kg的悬浮液：(0.3mg制备例1中制得的化合物+ 0.009mg伏格列波糖)/10mL以及(0.3mg制备例1中制得的化合 物+0.054mg伏格列波糖)/10mL。当所述的混合比为1∶0.03以下或 1∶0.18以上时，可出现功效不佳或者不良副作用。因此，将该混合比 设定为1∶0.03至1∶0.18。

给药所产生的协同作用

下面的表12、表13和图7显示出与试验中的对照组相比，血糖 抑制百分比的试验结果。

<表12>在给予制备例1中制得的化合物和伏格列波糖期间的抑 制百分比

<表13>在给予制备例1中制得的化合物和伏格列波糖的混合组 合物期间的抑制百分比

作为试验的结果，与对照组相比，0.3mg/kg制备例1中制得的 化合物1的情况显示出12％的抑制百分比。当使用0.009mg/kg和 0.054mg/kg的伏格列波糖时，与对照组相比，计算出的血糖抑制百 分比分别为1％和53％。此外，当使用0.3mg/kg制备例1中制得的 化合物+0.009mg/kg伏格列波糖的复合物以及0.3mg/kg制备例1中 制得的化合物+0.054mg/kg伏格列波糖的复合物时，抑制百分比经 计算分别为25％和65％。这表明观察到了比单次给予单一药物的算 术和更高的协同作用或者加和作用(图7)。

总而言之，制备例1中制得的化合物和伏格列波糖在1∶0.03至 1∶0.18这一宽的剂量比的范围中观察到了协同作用或加和作用方面 的改善。

<试验例5>式1的化合物和大麻素受体-1拮抗剂的混合组合物的协 同作用的测定

<5-1>将制备例1中制得的化合物和利莫那班的混合组合物重 复给药所产生的对于OGTT血糖变化曲线的协同作用

试验对象与试验方法

为了对将制备例1中制得的化合物和大麻素受体-1拮抗剂重复 给予所产生的协同作用进行检验，评价向肥胖小鼠给药4周对OGTT 血糖变化曲线和脂肪量的影响。通过向试验小鼠(C57BL/6小鼠)供 应高脂肪饲料(60kcal％脂肪，Research Diets，D12492)5个月后， 得到的饮食诱导的肥胖小鼠，并将其用作试验对象。用0.5％的甲基 纤维素(MC)制备组成为0.3mg/kg和3mg/kg的制备例1中制得的 化合物的悬浮液，0.3mg/kg被认为是最小的有效功效。用0.5％的 MC制备利莫那班(大麻素受体-1拮抗剂)的悬浮液，组成为3mg/kg。 利莫那班与大麻素受体-1拮抗剂(例如奥特那班、伊必那班和苏利那 班)具有相同的母核结构，并以下述剂量制成5mL/kg的利莫那班复 合物：(0.3mg制备例1中制得的化合物+3mg利莫那班)/5mL以 及(3mg制备例1中制得的化合物+3mg利莫那班)/5mL。当混合 比为1∶0.1以下或1∶1以上时，该剂量可超过利莫那班的每日临床剂 量或者可出现功效不佳。因此，将该混合比设定为1∶0.1至1∶1。

将肥胖小鼠在试验前禁食16-17小时，试验当天早晨从小鼠的尾 静脉采集血液，用ACCU-CHEK活力型血糖仪(Roche Diagnostics) 对血糖水平进行测定。在给予葡萄糖之前30分钟(-30分钟)，口服 给予本发明的药学混合组合物；30分钟后(0分钟)，再口服给予葡 萄糖溶液(2g/kg/10mL)。在下述指定的时间点进行血液的采集：即 将给予药物之前、即将给予葡萄糖之前以及给予葡萄糖后15、30、 60、90和120分钟。通过计算各组的曲线下面积，并将得到的值与 已经给予葡萄糖的对照组的值进行比较，计算出抑制百分比的值。

给药所产生的协同作用

下面的表14、表15和图8显示出与试验中的对照组相比，血糖 抑制百分比的试验结果。

<表14>给予制备例1中制得的化合物和利莫那班所产生的抑制 百分比

<表15>给予制备例1中制备的化合物和利莫那班的混合组合物 所产生的抑制百分比

与对照组相比，0.3mg/kg和3mg/kg制备例1中制得的化合物 所产生的血液AUC被抑制了18.2％和35.3％。与对照组相比，3mg/kg 的利莫那班所产生的血液AUC被抑制了1.1％。相反，0.3mg/kg制 备例1中制备的化合物+3mg/kg利莫那班或者是3mg/kg制备例1 中制得的化合物+3mg/kg利莫那班所产生的血液AUC分别被抑制了 32.8％和30.7％。因此，观察到了协同作用或加和作用(图8)。

<5-2>重复给予制备例1中制得的化合物与利莫那班的混合组 合物所产生的脂肪量减少的作用

试验对象与试验方法

用与试验例5-1相同的方式对试验对象和试验药物进行试验，将 脂肪量计算为附睾脂肪(epidydimal fat)和腹膜后脂肪(retroperitoneal  fat)的和，对给药4周后的脂肪量进行测定。

下面的表16和表17显示出了上述结果。

<表16>制备例1中制得的化合物和利莫那班对脂肪量减少的作 用

^*相对于HF-DIO对照组，P＞0.05

<表17>制备例1中制得的化合物和利莫那班的混合组合物对脂 肪量减少的作用

^*相对于HF-DIO对照组，P＞0.05

给药4周后，给予0.3mg/kg或3mg/kg制备例1中制得的化合 物所得到的脂肪量分别减少了-1.65％和8.71％，给予3mg/kg大麻素 受体-1拮抗剂所得到的脂肪量减少了41.5％。此外，给予0.3mg/kg 制备例1中制得的化合物+3mg/kg大麻素受体-1拮抗剂或者是给予 3mg/kg制备例1中制得的化合物+3mg/kg大麻素受体-1拮抗剂所得 到的脂肪量分别减少了42.1％和51.2％。因而观察到了加和作用。

因此，在肥胖小鼠上，在剂量比1∶1-1∶10的范围中观察到了制备 例1中制得的化合物和大麻素受体-1拮抗剂的协同功效改善作用或 加和功效改善作用。

<制剂例>药物制剂的制备

<1-1>粉剂的制备

制备例1中制得的化合物和二甲双胍的混合组合物    2g

乳糖                                           1g

将上述成分混合，装入不透气的小袋制成粉剂制剂。

<1-2>片剂制剂的制备

制备例1中制得的化合物和二甲双胍的混合组合物    100mg

玉米淀粉                                       100mg

乳糖                                           100mg

硬脂酸镁                                       2mg

使上述成分混合，然后根据常规的制备方法压片制成片剂制剂。

<1-3>胶囊制剂的制备

制备例1中制得的化合物和二甲双胍的混合组合物    100mg

玉米淀粉                                       100mg

乳糖                                           100mg

硬脂酸镁                                       2mg

将上述成分混合，然后根据常规的制备方法将混合后的成分封入 明胶胶囊，制成胶囊制剂。

<1-4>注射溶液剂的制备

制备例1中制得的化合物和二甲双胍的混合组合物    10μg/ml

添加BP级稀盐酸直至达到pH3.5

BP级注射用氯化钠                               最大1mL

将式1的7α-氨基类固醇衍生物溶解于具有适当体积的BP级注 射用氯化钠后，将所形成的溶液的pH用BP级稀盐酸调至pH 3.5。 通过BP级注射用氯化钠控制该溶液的体积，然后充分地混合。再将 该溶液填充至由透明玻璃制成的5ml I型安瓿后，通过使安瓿的上空 部分熔融对安瓿进行密封，再在高压釜(autoclave)中于120℃灭菌 15分钟以上，制得注射溶液剂。

尽管已经为说明性的目的公开了本发明优选的实施方式，但是本 领域技术人员将会明了的是，在不背离所附的权利要求书中公开的本 发明的范围和精神的情况下，可进行各种改变、添加和替换。