EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及EBF1基因mRNA的 3’UTR在抑制基因表达中的应用。

背景技术

植物激素乙烯信号转导中两个关键的转录因子EIN3/EIL1在蛋白 水平上受到由两个F-Box类蛋白EBF1/EBF2所介导的泛素化降解调 控。目前关于EBF1/EBF2基因功能的研究主要进展是被受体感知到的 乙烯信号能够负调EBF1/EBF2蛋白积累(Plant Cell.2010 Jul；22(7)：2384-401.)，从而使其蛋白量减少。但是对于这两个基因的 mRNA的研究还没有人进行深入的研究，只是2004年曾有人报道(Mol  Cell.2004 Jul 23；15(2)：173-83.)这两个基因的mRNA受到外切核酸酶 EIN5的负调。

EBF1，EBF2基因成熟mRNA的3’UTR分别为695nt和590nt，至今 为止还不清楚这么长的序列在生物体内是否具有某种特定的生物学 功能。

发明内容

本发明的目的是提供EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达 中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制 基因表达中的应用，其是将编码EBF1 3’UTR的核苷酸序列与报告基 因GFP编码序列重组得到一个结构为GFP-3’UTR的重组基因然后整 合至宿主基因组中，并随宿主基因组进行表达。其中，所述宿主为植 物，优选为拟南芥等。

前述编码EBF1 3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，或该序 列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有EBF1 3’UTR同 等功能的核苷酸序列。

本发明还提供EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制植物生长发育中 的应用。

本发明还提供EBF1基因mRNA的3’UTR在获得乙烯不敏感型转 基因植物中的应用以及EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制转基因植物 中EIN3蛋白表达水平中的应用。过量表达EBF1基因3’UTR的拟南芥 植物体内EIN3蛋白水平显著下调，具有明显的乙烯不敏感表型。

本发明首次发现了EBF1基因的3’UTR具有负调植物基因表达的 功能，将3’UTR用于负调植物基因表达，具有以下优点：3’UTR为非 编码序列其序列较短易于克隆，且植物过量表达3’UTR后可产生与过 量表达EBF1基因编码序列相同的生物学效应。

附图说明

图1为载体pEGAD的结构示意图。

图2为将EBF1 3’UTR与载体pEGAD连接后的重组基因结构。

图3分别显示了转基因35S：：GFP-EBF1U/Col-0以及转基因35S：： GFP/Col-0拟南芥幼苗的三个部位，子叶、下胚轴、根尖的荧光强度。

图4为转基因植物mRNA及蛋白水平的检测结果。

图5为转基因植物的三重反应。

图6为转基因竹中EIN3蛋白水平的检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。

实施例1  EBF1 mRNA 3’UTR的功能研究

构建一个新的重组基因。按照5’→3’方向从EBF1终止密码子TGA 开始选取了长度为643nt的一段序列，以拟南芥基因组DNA为模板扩 增目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，扩增过程所使用的 PCR反应体系为：

上述体系中所用引物序列如下：

正向引物5’-ATCGAATTCTGATCAACAATTCCACTGTC-3’；

反向引物5’-TGTGGATCCCATGAATAGTCTTAAAGGTG-3’。

PCR反应条件为：

然后利用EcoR I与BamH I两种内切酶分别消化目的片段与载体 pEGAD(如图1所示)，然后使用T4连接酶将目的片段插入到载体中， 最终的重组基因的结构如图2所示。

利用农杆菌侵染拟南芥花序将上述重组基因转移到野生型拟南 芥Col-0中，并最终得到纯和的转基因植物(共3个独立的株系)，即 基因型为35S：：GFP-EBF1U/Col-0的转基因植物。同时，利用相同的 方法将标签蛋白GFP也转入到植物中得到基因型为35S：：GFP/Col-0 的转基因植物(共3个独立的株系)，以此植物作为实验的对照组。

为了检测3’UTR的功能，将得到的转基因植物在荧光显微镜下进 行GFP荧光强度观察，发现35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株荧光 强度明显弱于35S：：GFP/Col-0转基因植株(图3)，这种差别在整个 植物体中是一致的，图3给出了一棵拟南芥幼苗的三个部位：子叶、 下胚轴、根尖。植物活体组织荧光强度检测说明带有EBF1 3’UTR的 基因表达受到抑制。

为了进一步定量确认上述荧光强度观察结果，又利用GFP的抗体 检测了相应转基因植物中GFP蛋白的含量，同时利用RT-PCR检测了 GFP mRNA的含量。结果发现35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株与 35S：：GFP/Col-0转基因植株相比虽然它们的GFP mRNA的水平相当， 但GFP蛋白的水平前者明显低于后者(图4)。这进一步确定了带有 EBF1 3’UTR的GFP基因其表达所受到的抑制是由3’UTR所造成的。

上述实验结果说明EBF1 mRNA 3’UTR作为一个顺式作用元件能 抑制由mRNA到蛋白的翻译过程，同时也暗示EBF1 mRNA的3’UTR 可能在EBF1基因本身的翻译过程中起负调作用。

实施例2  转基因植物三重反应

经典的乙烯反应就是人们所熟知的三重反应，具体表现为当施加 乙烯时黄化苗呈现出下胚轴变短、变粗，根变短，顶端弯钩加剧。在 含有10μM ACC(一种乙烯生物合成的前体)的培养基上生长3天的 黄化苗，35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株与35S：：GFP/Col-0转 基因植株相比具有明显的乙烯不敏感表型，如图5所示。具体分析发 现后者的三重反应表型与野生型植物相同，而35S：： GFP-EBF1U/Col-0转基因植株其下胚轴长度，根长度均明显长于野生 型，并且顶端弯钩消失。这说明35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植 株由于EBF1 3’UTR过量表达变得乙烯不敏感。

实施例3  转基因植物中EIN3蛋白水平检测

由于乙烯信号所引起的反应由两个最关键的转录因子EIN3/EIL1 激活，因此，本发明进一步检测了35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因 植株中转录因子EIN3/EIL1的蛋白水平。研究发现与野生型相比 35S：：GFP-EBF1U/Col-0转基因植株中EIN3/EIL1的蛋白水平明显下 调，如图6所示。之所以EBF1 3’UTR过量表达变得乙烯不敏感，就 是因为EIN3蛋白水平下调。

从上面的结果可以看出，如果在植物中过表达EBF1 3’UTR就会 引起植物对乙烯不敏感，并且与之相一致的是植物内源的EIN3蛋白 水平会下调。

这给出了很好的提示，只需在植物体内过表达EBF1 3’UTR就可 以使得EIN3蛋白水平下调，并且导致乙烯反应减弱。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。