HPLC法同时测定荜茇中胡椒碱和荜茇明宁碱含量的方法

技术领域

本发明涉及同时对荜茇中胡椒碱和荜茇明宁碱两种成分的含量测定方法。

背景技术

荜茇为胡椒科Piperaceae胡椒属Piper植物荜茇(Piper longum L.)的干燥未成熟的果穗，是中、蒙、藏、维医的习惯用药，具有温中散寒，行气止痛的功能，收载于《中国药典》(2010年版一部)及《中华人民共和国药典卫生部药品标准维吾尔药分册》。对于荜茇的化学成分研究表明，荜茇中主要的成分是生物碱及酰胺类成分，此外还含有萜类、挥发油等其他类成分。现代药理学研究表明，荜茇具有广泛的药理活性如抗胃肠道疾病、抗菌消炎、抗氧化等。2010版药典及有关文献选用活性成分胡椒碱为指标成分对荜茇药材进行质量控制。但中药中所含成分复杂，临床疗效为多种成分的综合作用，所以确立某一种成分作为中医用药的唯一有效成分有一定的局限性。而同时选用多个有效成分作为重要的定量指标才能更加真实的反映重要的内在质量。根据多个有效成分的含量高低来控制药物质量的模式，是现阶段对中药及其复方的质量控制方法研究的热点之一。荜茇明宁碱也是荜茇中的有效成分，具有抗血小板聚集等作用。近年来，荜茇明宁碱由于其明确的药理作用受到人们越来越多的关注。因此，将荜茇中胡椒碱和荜茇明宁碱两种成分同时作为荜茇的质量控制的指标显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时测定植物中胡椒碱和荜茇明宁碱含量的方法。

本发明提供的方法是将被检测样品通过高效液相色谱法进行测定的，所述高效液相色谱法的流动相为甲醇和(0.2-0.3)％(体积百分含量)的甲酸水溶液组成的混合液，所述甲酸水溶液和所述甲醇的体积比为(32-37)∶(62-67)。

上述甲酸水溶液和甲醇的体积比可为35∶65；所述甲酸水溶液中甲酸的体积百分含量具体可为0.25％。

上述高效液相色谱法采用的色谱柱为C18；流动相的流速为(0.8-1.2)mL·min^-1，优选为1.0mL·min^-1；检测波长为343nm；柱温为38-42℃，优选为40℃；进样量为8-12ul，优选为10ul。

进一步，上述植物为荜茇，所述被检测样品为荜茇提取液。

上述荜茇提取液是通过如下步骤获得的：将荜茇用提取液超声提取，所述提取液优选为甲醇。

上述提取液与荜茇的比例可为(25-250)ml∶(0.05-0.15)g；优选为(25-250)ml∶(0.09-0.11)；更优选为100ml∶0.1g。

上述超声提取的提取时间可为8-30分钟，优选是10-30分钟，更优选为10分钟；所述超声提取的功率是40-50kHz，优选是45kHz。

上述荜茇是经过粉碎处理的，所述粉碎处理是将荜茇粉碎为过80目筛的荜茇粉。

上述高效液相色谱法中计算标准曲线所用的荜茇明宁碱对照品的制备方法包括如下步骤：

1)将荜茇药材用乙醇提取，收集滤液，去除乙醇，得到总提取物；

2)将所述总提取物用二氯甲烷萃取，收集萃取相，去除二氯甲烷，得到二氯甲烷萃取物；

3)将所述二氯甲烷萃取物用体积比为1∶1的二氯甲烷-甲醇溶解，用100-200目硅胶拌样，经硅胶柱色谱，用二氯甲烷洗脱得到0-2000ml的洗脱液作为第一组分和2000-2500ml的洗脱液作为第二组分，收集第二组分，去除二氯甲烷，干燥后得到干燥物；

4)将步骤3)的干燥物溶于甲醇中，在C18柱上用体积比为5∶5甲醇-水洗脱得到组分1-组分10共十个组分，再用体积比为5.5∶4.5甲醇-水洗脱得到组分11-组分18共八个组分，然后用体积比为6∶4甲醇-水洗脱得到组分19-组分23，步骤4)中每个组分200ml，收集组分23，去除甲醇和水，得到荜茇明宁碱对照品。

步骤1)中，所述乙醇提取的次数为2次；乙醇是体积百分比为85％的乙醇水溶液；所述荜茇药材与所述乙醇水溶液的配比是(2-4)kg∶(12-15)L，优选是3kg∶(12-15)L。

步骤2)中，所述二氯甲烷萃取的次数为3次，所述二氯甲烷与所述总提取物的体积比为5∶1。

步骤3)中，硅胶柱中的硅胶高60cm，硅胶柱内径4.0cm。

步骤4)中，所述C18柱是经体积比为5∶5的甲醇-水预平衡的；C18柱中硅胶高80cm，柱内径1.5cm。

上述的方法在鉴定或控制荜茇药材质量中的应用也属于本发明的保护范围。

上述鉴定或控制荜茇药材质量优选是通过同时测定胡椒碱和荜茇明宁碱含量实现。

上述的方法在制备荜茇明宁碱中的应用也属于本发明的保护范围。

上述的方法在同时测定胡椒碱和荜茇明宁碱含量中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明：超声法对药材中胡椒碱和荜茇明宁碱的提取率最高，且操作时间相对较短，较为简单方便，故选择超声法为供试品溶液制备的最佳提取方法(表1)。超声提取10min可将荜茇药材中的胡椒碱和荜茇明宁碱较完全地提取出，为考虑节省成本，故最终选择以甲醇超声提取10min为供试品溶液制备最佳提取方法(表2)。100mL甲醇可将荜茇药材中的胡椒碱和荜茇明宁碱较完全地提取出，为考虑节省成本，故最终选择以100mL甲醇超声提取为供试品溶液制备最佳提取方法(表3)。采用本发明的HPLC条件以及上述的提取条件后，胡椒碱和荜茇明宁碱日间精密度的RSD分别为1.0％和0.5％，均小于3.0％，表明精密度良好(表6、7)；胡椒碱和荜茇明宁碱的RSD分别为1.4％和1.2％，均小于3％。结果表明供试品溶液至少在72h内稳定(表8)；胡椒碱和荜茇明宁碱质量分数RSD值均为2.9％，重复性很好(表10)；胡椒碱的平均回收率和RSD分别为100.4％和2.5％，荜茇明宁碱的平均回收率和RSD分别为102.1％和2.0％，说明加样回收率符合要求(表11、12)。

因此本实验首次建立HPLC法同时测定荜茇中胡椒碱和荜茇明宁碱的含量，进一步完善了荜茇的质量控制方法，并对不同批号的荜茇进行了含量测定。与以往的胡椒碱外标法的方法学考察模型相比，更符合祖国传统医学中“多成分”、“多靶点”的思维模式因而更加客观、科学。

附图说明

图1荜茇明宁碱¹H-NMR图谱1。

图2荜茇明宁碱¹H-NMR图谱2。

图3荜茇明宁碱¹³C-NMR图谱。

图4胡椒碱标准曲线。

图5荜茇明宁碱标准曲线。

图6胡椒碱和荜茇明宁碱标准品液相色谱图。

图7荜茇药材供试品溶液(批号：200805)高效液相色谱图。

图8荜茇药材供试品溶液(批号：200905)高效液相色谱图。

图9荜茇药材供试品溶液(批号：201005)高效液相色谱图。

图10荜茇药材供试品溶液(批号：200810)高效液相色谱图。

图11荜茇药材供试品溶液(批号：201003)高效液相色谱图。

图12荜茇药材供试品溶液(批号：201008)高效液相色谱图。

图13荜茇药材供试品溶液(批号：201102)高效液相色谱图。

图14荜茇药材供试品溶液(批号：201103)高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

Agilent1100型高效液相色谱仪系列，包括：G1365D DAD(检测器)，G1311A QuatPump(四元梯度泵)，G1332A(在线真空脱气机)，G1329A ALS(自动进样器)，G1316AColcom(柱温箱)，Agilent Chemstation system(工作站)(Agilent Technologies，美国)；ME235S十万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，KQ5200DV型数控超声波清洗器(40kHz，昆山市超声仪器有限公司)；Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)(Agilent Technologies公司，美国)胡椒碱标准品(中检所，批号0775-200203，纯度＞99％)，荜茇明宁碱标准品(首都医科大学中医药学院自制，见实施例1步骤一和二，纯度＞99％)，不同批号的荜茇药材8批。本发明中的荜茇药材粉(末)是将荜茇药材粉碎成过80目筛的荜茇粉。

实施例1

一、荜茇中提取物的制备

荜茇药材3kg粉碎后加入15L 85％(体积百分比)乙醇水溶液，加热回流1.5h，过滤保留滤液，滤渣加入12L 85％(体积百分比)的乙醇水溶液回流1.5h，过滤，合并两次滤液，浓缩得到无醇的浓缩液为1950mL。

用浓缩液5倍体积的二氯甲烷萃取三次，回收溶剂后得到二氯甲烷萃取物干燥浸膏约43g。

二、荜茇明宁碱对照品的制备(梯度洗脱)

浸膏用二氯甲烷∶甲醇(1∶1)充分溶解，用100-200目硅胶拌样，经硅胶柱(硅胶高60cm，柱内径4.0cm)色谱，以二氯甲烷-甲醇(体积比为10∶0～9∶1～8∶2)梯度洗脱。分为Fr.1～8八个部分，其中以二氯甲烷-甲醇10∶0洗脱得到Fr1(洗脱体积2000ml)、Fr2(洗脱体积500ml)、Fr3(洗脱体积1000ml)、Fr4(洗脱体积1000ml)；以二氯甲烷-甲醇9∶1洗脱得到Fr5(洗脱体积500ml)、Fr6(洗脱体积1000ml)、Fr7(洗脱体积750ml)；以二氯甲烷-甲醇8∶2洗脱得到Fr8(洗脱体积1250ml)，回收溶剂，对其中的Fr.2干燥称重为2.6g。

将Fr.2溶于少量甲醇中，C18硅胶色谱柱(硅胶高80cm，柱内径1.5cm)经甲醇-水(5∶5)400mL平衡，湿法加样，以甲醇-水(体积比为5∶5～5.5∶4.5～6∶4～6.5∶3.5)梯度洗脱，收集各浓度梯度洗脱液。按每份200mL接收洗脱流份，分别得流份Fr.1～38，其中以甲醇-水5∶5洗脱得到Fr1-Fr10、以甲醇-水5.5∶4.5洗脱得到Fr11-Fr18、以甲醇-水6∶4洗脱得到Fr19-Fr24，以甲醇-水6.5∶3.5洗脱得到Fr28-Fr38，各流份减压蒸干溶剂后用少量甲醇溶解。其中Fr.23为白色固体粉末，经检测为纯的单一化合物，对其进行核磁波谱测定。

波谱数据如下：¹H-NMR(MeOD，600MHz)：δ6.11(1H，d，J＝14.74Hz)，7.27(1H，m)，6.79(1H，m)，6.82(1H，m)，7.07(1H，d，J＝1.35Hz)，6.80(1H，d，J＝8.03Hz)，0.93(3H，d，J＝6.70Hz)，5.96(2H，s)，3.09(2H，t，J＝6.48Hz)，1.82(1H，m)，0.93(3H，d，J＝6.70Hz)，6.95(1H，dd，J＝1.34,8.03Hz)。¹³C NMR(MeOD，150MHz)6：169.3，123.9，142.3，126.2，140.3，132.6，106.9，150.0，109.6，1244，102.9，20.7，30.0，20.7，48.3。见图1～3。与文献对照确定该化合物为荜茇明宁碱。经HPLC检测其纯度为99％，即为荜茇明宁碱对照品。

三、荜茇药材提取方法的考察

1.提取方法的选择

设置以下三组实验来确定最佳的提取方法：

1)超声提取法：取荜茇药材粉末约0.1g，精密称定，置100mL容量瓶中，加入甲醇100mL，密塞，超声(45kHz)提取30min，放冷，用甲醇补足至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2)回流提取法：取荜茇药材粉末约0.1g，精密称定，置于100mL圆底烧瓶中，加入甲醇100mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

3)索氏提取法：取荜茇药材粉末约0.1g，精密称定，置于100mL锥形瓶中，加入甲醇100mL，冷浸24h后，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

将上述三种不同提取方法所得的供试品进行HPLC检测。以上供试品溶液各进样10μL，测定各峰面积值，以峰面积代表其中胡椒碱和荜茇明宁碱含量。检测条件是：色谱柱：Agilent Technologies公司，Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-体积比0.25％甲酸水溶液(65∶35)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：343nm；柱温：40℃。

表1不同提取方法考察结果

结果如表1所示，超声法对药材中胡椒碱和荜茇明宁碱的提取率最高，且操作时间相对较短，较为简单方便，故选择超声法为供试品溶液制备的最佳提取方法。

2、提取时间的选择

在步骤1的基础上，设置不同提取时间的实验：

精密称取3份荜茇药材粉末，各0.1g，分置100mL容量瓶中，加入甲醇100mL，密塞，分别超声(45kHz)处理10min、20min、30min，放冷，用甲醇补足至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得不同提取时间的供试品溶液，均各进样10μL，采用HPLC(检测条件与步骤1相同)测定各峰面积值，以峰面积代表其中胡椒碱和荜茇明宁碱含量。

表2不同提取时间考察结果

结果如表2所示，超声提取10min可将荜茇药材中的胡椒碱和荜茇明宁碱较完全地提取出，为考虑节省成本，故最终选择以甲醇超声提取10min为供试品溶液制备最佳提取方法。

3.提取溶剂体积

在步骤1、2的基础上，设置不同提取溶剂体积的实验：

精密称取4份荜茇药材粉末，各0.1g，分别放置25mL，50mL，100mL，250mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，密塞，分别超声(45kHz)处理10min，放冷，用甲醇补足至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得不同提取时间的供试品溶液，均各进样10μL，采用HPLC(检测条件与步骤1相同)测定各峰面积值，以峰面积代表其中胡椒碱和荜茇明宁碱含量。

表3不同提取溶剂考察结果

结果如表3所示，100mL甲醇可将荜茇药材中的胡椒碱和荜茇明宁碱较完全地提取出，为考虑节省成本，故最终选择以100mL甲醇超声提取为供试品溶液制备最佳提取方法。

四、荜茇中同时测定胡椒碱和荜茇明宁碱含量测定方法的建立及其检测

1、胡椒碱和荜茇明宁碱标准曲线的制备

精密称取胡椒碱4.04mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为胡椒碱储备液，依次精密吸取1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，6mL，7mL，8mL分别置于10mL容量瓶中，加甲醇定容后，即得系列胡椒碱对照品溶液；精密称取上述的荜茇明宁碱标准品1.02mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇定容配置成0.0408mg·mL^-1的荜茇明宁碱储备液，依次稀释配成0.001671mg·mL^-1、0.002089mg·mL^-1、0.002611mg·mL^-1、0.003264、0.00408mg·mL^-1、0.00612mg·mL^-1、0.00816mg·mL^-1的标准品溶液。上述对照品溶液分别进样10μL，采用HPLC测定各峰面积值(结果见表4，表5)，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(见图4，图5)。得胡椒碱的回归方程为Y＝63629X-11.219，r＝0.9999，表明胡椒碱在0.00808-0.06464mg·mL^-1的范围内呈良好的线性关系；荜茇明宁碱回归方程为Y＝61187X-19.452，r＝0.9999，表明荜茇明宁碱在0.00167-0.00816mg·mL^-1的范围内呈良好的线性关系。胡椒碱和荜茇明宁碱液相色谱图见图6。

表4胡椒碱的标准曲线测定数据

表5荜茇明宁碱标准曲线测定数据

2.供试品溶液的配置

称取荜茇药材粉末0.1g，置于100mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，密塞，分别超声(45kHz)处理10min，放冷，用甲醇补足至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得荜茇药材的供试品溶液。

3.精密度实验

吸取上述浓度为0.03232mg·mL^-1的胡椒碱标准品溶液和上述0.02089mg·mL^-1荜茇明宁碱标准品溶液，在步骤三1的色谱条件下，于同一天内重复进样5次，记录胡椒碱和荜茇明宁碱的峰面积为日内精密度(见表6)。胡椒碱和荜茇明宁碱的日内精密度RSD分别为0.6％和0.3％；将上述供试品溶液连续进样3天，每份样品进样3针，记录峰面积为日间精密度(见表7)。胡椒碱和荜茇明宁碱日间精密度的RSD分别为1.0％和0.5％，均小于3.0％，表明精密度良好。

表6日内精密度测定结果(n＝5)

表7日间精密度测定结果(n＝5)

4.稳定性实验

取荜茇样品0.1g，按照步骤四2中方法制备供试品溶液荜茇供试品溶液，室温放置72h，分别在0，2，4，6，8，10h，12h，24h，48h，72h利用步骤三1的色谱条件下进行HPLC检识，并记录峰面积，见表8、表9。胡椒碱和荜茇明宁碱的RSD分别为1.4％和1.2％，均小于3％。结果表明供试品溶液至少在72h内稳定。

表8胡椒碱稳定性实验数据

表9荜茇明宁碱稳定性实验数据

5.重复性实验

精密称取荜茇药材粉末0.1g，按照步骤四2中方法制备5份荜茇供试品溶液，在步骤三1的色谱条件下进行HPLC检识，所得的胡椒碱和荜茇明宁碱的峰面积见表10。胡椒碱和荜茇明宁碱质量分数RSD值分别为2.9％和2.9％。

表10重复性实验测定结果(n＝5)

6.加样回收率实验

称取的荜茇药材粉末6份，每份0.1g，分别加入胡椒碱标准品适量，按供试品溶液制备方法操作，并按步骤三1色谱条件测定，测定结果见表11；称取的荜茇药材粉末6份，每份0.2g，分别加入荜茇明宁碱标准品适量，按供试品溶液制备方法操作，并按上述色谱条件测定，测定结果见表12。胡椒碱的平均回收率和RSD分别为100.4％和2.5％，荜茇明宁碱的平均回收率和RSD分别为102.1％和2.0％。

表11胡椒碱加样回收率测定结果

表12荜茇明宁碱加样回收率测定结果

7.荜茇药材的含量测定

分别称取8批来源不同的荜茇药材粉末0.1g，按照步骤四2中方法制备8份供试品溶液，按步骤三1的色谱条件进行测定。结果见表13，图7～图14。

表13不同批号中荜茇药材中胡椒碱和荜茇明宁碱的质量分数(n＝3)

由于中药成分的复杂性和多样性，目前在中药的质量控制方面，倾向于多成分、多指标控制。而以往对于荜茇的质量控制只采用胡椒碱为单一指标成分。本实验突破了以往仅采用胡椒碱为指标成分的单指标质量控制方法，同时测定荜茇中胡椒碱和荜茇明宁碱的含量，为荜茇药材多指标质量控制标准的建立提供了依据，也为含此类酰胺类生物碱类成分的其它药材定量分析提供了参考。

为了提高分析对象的提取率，减少杂质的干扰，本研究以甲醇为提取溶剂，以胡椒碱和荜茇明宁碱的提取率为指标，分别比较了冷浸提取法、加热回流提取法及超声提取法。结果表明，回流提取法与超声的提取率相当，均优于冷浸法。考虑到超声提取法操作简单方便、提取时间较短、各操作参数可控、提取过程重现性好，有助于实现图谱的高重现性，因此选择超声提取法。并且分别考察了提取时间、提取溶剂体积对提取率的影响，结果表明液料比100mL∶0.1g，超声提取10min能够完全提取出分析对象。