EDTA在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种EDTA在提高大肠杆菌重组蛋白 胞外分泌量和表达量中的应用。

背景技术

大肠杆菌表达系统是现今实验室应用甚至工业生产应用最早、最为广泛的 表达系统。其本身天然的特点赋予其巨大的应用价值，这些特点包括：(1)其 全基因组测序完成，遗传背景非常详细；(2)基因克隆表达系统成熟完善；(3) 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；(4)细胞本身表达蛋白组分少、 表达量低，易于纯化回收外源重组蛋白；(5)被美国FDA批准为安全的基因工 程受体生物。

大肠杆菌由于其特殊的细胞壁结构所形成的渗透屏障，严重阻碍了它的工 业生产应用，主要的限制因素有：(1)外源重组蛋白只能在胞内表达，无法分 泌到细胞外；(2)外源重组蛋白在胞内表达过程中易形成无活性的包涵体，严 重降低重组蛋白的活性质量；(3)外源重组蛋白表达量总体偏低。因此，实现 大肠杆菌表达系统的胞外分泌同时提高其表达水平具有重要的工业应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种EDTA(乙二胺四 乙酸)在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种EDTA在提高大肠杆菌重组蛋 白胞外分泌量和表达量中的应用，是基于发现EDTA具有提高大肠杆菌重组蛋 白胞外分泌量和表达量的性能所得到的技术方案；

所述的EDTA在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应用，具 体包含以下步骤：用诱导剂对含有重组载体的大肠杆菌进行诱导培养，加入 EDTA或是加入EDTA和溶菌酶继续培养即可；

所述的重组载体优选为将核苷酸序列如下所示的碱性内切葡聚糖酶基因 III-3-a克隆到原核表达载体pET-28a(+)中得到的重组载体pET-28a-III-3-a或是将 核苷酸序列如下所示的淀粉酶基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中得到的重 组载体pET-28a-III-A；

碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a的序列如下所示：

GAAGGAAACACTCGTGAAGACAATTTTAATCATTTATTAGGTAATGACAATGTTAAG CGCCCTTCCGAGGCTGGCGCATTACAATTACAAGAAGTCGATGGACAAATGACATTAGT AGATCAAGATGGAGAAAAAATTCAATTACGTGGAATGAGTACACACGGATTACAATGGT TTCCTGAGATTTTAAATGATAACGCATACAAAGCTCTTACTAACGATTGGGAATCAAATAT GATTCGTCTAGCTATGTATGTCGGTGAAAATGGCTATGCTTCAAATCCAGATTTAATTAAA AGCAGAGTCATTAAAGGAATAGATCTTGCTATTGAAAATGACATGTATGTCATTGTTGAC TGGCATGTACATGCACCTGGTGATCCTAGAGATCCGGTTTAYGCWGGTGCAGAAGATTT CTTTAGAGAAATTGCAGCATTATATCCTAACAATCCACACATTATTTATGAGTTAGCGAAT GAACCAAGTAGTAATAATAATGGTGGAGCAGGGATTCCGAATAATGAAGAAGGTTGGAA TGCAGTAAAAGAATACGCTGATCCAATTGTAGAAATGTTACGTGAAAGTGGTAACGCAG ATGACAATATCATCATTGTGGGGAGTCCTAACTGGAGTCAGCGTCCTGACTTAGCAGCTG ATAATCCAATTGATGACCACCATACAATGTACACAGTTCATTTCTATACAGGTTCACATGC AGCTTCAACGGAGAGTTATCCGCCTGAAACTCCTAACTCTGAAAGAGGAAACGTAATGA GTAACACTCGTTATGCGTTAGAGAACGGAGTAGCGGTATTTGCAACAGAATGGGGAACA AGTCAAGCAAGTGGAGACGGTGGTCCTTACTTTGACGAAGCAGATGTATGGATTGAATT TTTAAATGAAAACAACATTAGCTGGGCTAACTGGTCTTTAACGAATAAAAATGAAGTGTC TGGTGCATTTACACCATTCGAGTTAGGAAAATCTAACGCAACTAATCTTGACCCAGGTCC AGACCATGTTTGGGCACCTGAAGAGTTAAGTCTTTCTGGAGAATATGTACGTGCTCGTAT TAAAGGTGTGAACTATGAGCCAATCGACCGTACTAAATACACGAAAGTACTTTGGGACT TTAATGATGGAACGAAGCAAGGATTTGGAGTGAATGGAGATTCTCCAAATAAAGAGCTT ATTGCAGTTGATAATGAAAACAACACTTTGAAAATTTCGGGGTTAGATGTAAGTAACGAT GTTTCTGATGGCAACTACTGGGCTAATGCTCGTCTTTCAGCCAACGGTTGGGGGAAAAG TGTTGATATATTAGGTGCTGAAAAACTAACTATGGATGTTATTGTTGATGAGCCGACGAC GGTAGCGATTGCTGCAATTCCACAAGGTCCATCAGCAAATTGGATTAATCCAATTTGCGC AGTTAAGGTTGAGCCAACTGATTTCGTGCCGTTTGGAGATAAGTTTAAAGCAGAATTAA CTATAACTACAGCGGACTCTCCAGCGATAGAAGCGATTGCGATGCATGCTGAAAATAACA ATATGAACAACATCATTCTGTTCGTAGGAACTGATGCAGCTGACGTTATTTATTTAGATAA CATTAAAGTAATTGGAACAGAAGTTGAAATTCCAGTTGTTCATAATCCAAAAGGAGAAG CTGTCCTTCCGTCTAATTTTGAAGACGGCACACGTCAAGGTTGGGACTGGGCTGGAGAG TCTGGTGTGAAAACAGCTTTAACCATTGAAGAAGCAAACGGTTCTAACGCGCTATCATG GGAATTTGGATACCCAGAAGTAAAACCTAGTGATAACTGGGCGACAGCTCCACGTTTAG ATTTCTGGAAATCTGACTTGGTTCGCGGTGAGAATGATTATGTAGCTTTTGACTTCTATCT AGATCCAGTTCGTGCAACAGAAGGCGCGATGAATATCAATTTAGTATTTCAGCCACCTAC TAATGGATATTGGGTTCAAGCACCACAAACTTTTACGGTTGACTTTGAAGAGTTAGATCA AGCAAATCAAGTAGACGGTCTATACCATTATGAAGTAAAAATTAATGTAAGAGATATTAC AAACGTTCAAGATGACACTTTACTACGTAATATGATGATTATTTTTGCTGATGTACAAAGT GATTTTGCAGGAAGAGTATTCGTAGATAATGTTCGTTTTGAGGTTGCTGCTACTGGGCCG ATTGAGCCTGAACCAGTTGATCCTGGCGAAGAGGCGCCTCCTGTAGATGAGAAGGAAG CAGCAAAAGAAGAAAGAGAAGCAGCTAGAGGAGCGGAGAAAGAGGAAAGAGAAGCC GTGAAAGCTGAAAGAGAAGTAGCTAGAGAAGCAGCGAAAGAGGAAAGAGAAACCGC AAAAGAAGAAAAGAAAGAGGCTACGAAAAAATAA；

淀粉酶基因的序列如下所示：

GTAAATGGCACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTATACGCCGAACGACGGCCAGCAT TGGAAACGATTGCAGAATGATGCGGAACATTTATCGGATATCGGAATCACTGCCGTCTGG ATTCCTCCCGCATACAAAGGAACGAGCCAATCCGATAACGGATACGGACCTTATGATTTG TATGATTTAGGAGAATTCCAGCAAAAAGGGACGGTCAGAACGAAATACGGCACAAAATC AGAGCTTCAAGATGCGATCGGCTCACTGCATTCCCGGAACGTCCAAGTATACGGAGATG TGGTTTTGAATCATAAGGCTGGTGCTGATGCAACAGAAGATGTAACTGCCGTCGAAGTC AATCCGGCCAATAGAAATCAGGAAACTTCGGGGGAATATCAAATCAAAGCGTGGACGGA TTTTCGTTTTCCGGGCCGTGGAAACACGTACAGTGATTTTAAATGGCATTGGTATCATTTC GACGGAGCGGACTGGGATGAATCCCGGAAGATCAGCCGCATCTTTAAGTTTCGTGGGGA AGGAAAAGCGTGGGATTGGGAAGTATCAAGTGAAAACGGCAACTATGACTATTTAATGT ATGCTGATGTTGACTACGACCACCCTGATGTCGTGGCAGAGACAAAAAAATGGGGTATC TGGTATGCGAATGAACTGTCATTAGACGGCTTCCGTATTGATGCCGCCAAACATATTAAAT TTTCATTTCTGCGTGATTGGGTTCAGGCGGTCAGACAGGCGACGGGAAAAGAAATGTTT ACGGTTGCGGAGTATTGGCAGAATAATGCCGGGAAACTCGAAAACTACTTGAATAAAAC AAGCTTTAATCAATCCGTGTTTGATGTTCCGCTTCATTTCAATTTACAGGCGGCTTCCTCA CAAGGAGGCGGATATGATATGAGGCGTTTGCTGGACGGTACCGTTGTGTCCGAGCATCC GGAAAAGGCGGTTACATTTGTTGAAAATCATGACACACAGCCGGGACAGTCATTGGAAT CGACAGTCCAAACTTGGTTTAAACCGCTTGCATACGCCTTTATTTTGACAAGAGAATCCG GTTATCCTCAGGTGTTCTATGGGGATATGTACGGGACAAAAGGGACATCGCCAAAGGAA ATTCCCTCACTGAAAGATAAGATAGAGCCGATTTTAAAAGCGCGTAAGGAGTACGCATA CGGGCCCCAGCACGATTATATTGACCACCCGGATGTGATCGGATGGACGAGGGAAGGTG ACAGCTCCGCCGCCAAATCAGGTTTGGCCGCTTTAATCACGGACGGACCCGGCGGATCA AAGCGGATGTATGCCGGCCTGAAAAATGCCGGCGAGACATGGTATGACATAACGGGCAA CCGTTCAGATACTGTAAAAATCGGATCTGACGGCTGGGGAGAGTTTCATGTAAACGGAG GGTCCGTCTCCATTTATGTTCAGAAATAA；

所述的大肠杆菌通常指的是基因工程上常用于作为宿主菌的大肠杆菌，优 选为大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)菌株；

所述的诱导剂优选为IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)；

所述的IPTG的使用条件优选为含有重组载体的大肠杆菌处于对数生长期 时加入IPTG，IPTG的终浓度为0.1～1.0mmol/L；

所述的对数生长期指的是细胞在一定的环境下经过了短暂的适应期，进而 快速生长的时期；

所述的IPTG的使用条件更优选为含有重组载体的大肠杆菌的OD₆₀₀为0.6 时加入IPTG，IPTG的终浓度为0.2mmol/L；

所述的诱导培养的条件优选为23～30℃培养；更优选为23℃培养；

所述的EDTA的加入时间为添加诱导剂后；

所述的EDTA和溶菌酶的加入时间为添加诱导剂后；

所述的EDTA在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应用，更 优选包含以下步骤：

(1)将含有重组载体的大肠杆菌培养至OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG于23 ℃、250r/min诱导培养，IPTG的终浓度为0.2mmol/L；

(2)诱导培养至第4～20h时加入EDTA，或是加入EDTA和溶菌酶；EDTA 的终浓度为质量体积比0.2～1％，溶菌酶的终浓度为0.05～0.25mg/L；

(3)继续培养至菌体处于稳定期后期，收集上清；

步骤(2)更优选为：诱导培养至第12h时加入EDTA，或是加入EDTA和 溶菌酶；EDTA的终浓度为质量体积比5％，溶菌酶的终浓度为0.15mg/L；

步骤(3)中所述的稳定期指的是菌体的比生长速度等于零，培养液中菌体 的浓度保持不变的阶段；

步骤(3)更优选为：诱导培养18～25小时，收集培养上清。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发明人发现EDTA具有提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表 达量的性能，而且与EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸)、瓜氨酸、盐酸胍 和Triton X-100相比，EDTA提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量的效果最佳。

(2)本发明所提供的EDTA在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量 中的应用方法，操作简单，成本低廉。

(3)通过实验证明，本发明所提供的应用方法能较好地将分子量较大、分 泌较难的蛋白的胞外分泌量和表达量提高，以碱性内切葡聚糖酶基因III-3-a为 例，其包括2412个核苷酸，理论分子量(MWt)为90kD左右，是分子量较大、 分泌较难的蛋白，根据数据比对可以发现本发明让碱性内切葡聚糖酶的分泌量 从10.9％提升到66.3％，细胞表达重组蛋白总量(表达量)提高了80％以上，在此 方法下，细胞外重组蛋白分泌量高于不用EDTA和溶菌酶的表达重组蛋白总量， 效果十分显著。因此，本发明对其他分子量很大，表达分泌较难的外源蛋白有 很好的参考价值，对分子量更小的蛋白有更好的参照价值。

附图说明

图1是pET-28a(+)表达载体图。

图2是pET-28a(+)表达载体多克隆位点图。

图3是重组质粒的构建凝胶电泳图，其中：

泳道M为DNAmaker；泳道1为Bacillus sp.III-3基因组；泳道2为基因III-3-a； 泳道3为重组质粒pET-28a-III-3-a；泳道4为EcoR I和HindIII双酶切的重组质 粒pET-28a-I-1-a酶切图。

图4是重组大肠杆菌诱导温度对总酶活的影响图。

图5是重组大肠杆菌IPTG浓度对酶活的影响图。

图6是EDTA加入时间对胞外酶活的影响图。

图7是同时加入EDTA和溶菌酶对表达量的影响图。

图8是同时加入EDTA和溶菌酶对重组大肠杆菌生长趋势的影响图。

图9是EDTA和溶菌酶对胞外重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中：

泳道M为protein maker；泳道1为培养E.coli BL21的上清液；泳道2为培 养重组菌E.coli III-3-a的上清液；泳道3为加入0.15mg/mL溶菌酶后培养重组 菌E.coli III-I-1-a的上清液；泳道4为加入0.5％EDTA后培养重组菌E.coli III- I-1-a的上清液；泳道5为加入0.5％EDTA和0.15mg/mL溶菌酶后培养重组菌 E.coli III-I-1-a的上清液。

图10是溶菌酶加入时间对胞外酶活的影响图。

图11是加入EDTA和溶菌酶后不同诱导时间的培养液的SDS-PAGE电泳 图，其中：泳道M为protein maker；泳道1-7分别为诱导培养12、14、16、18、 20、22、24小时加入0.5％EDTA和0.15mg/mL溶菌酶后的上清液。

图12是加入EDTA对淀粉酶分泌量的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1

(一)材料

1、菌株和质粒

芽孢杆菌Bacillus sp.III-3(保藏号：CGMCC No.2138，保藏日：2007年8月 22日，已在专利号：200710030787.6、名称：一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切 葡聚糖酶和应用中公布)作为碱性纤维素酶基因的原始菌，E.coli Top10(Invitrogen  公司)用于质粒的维护和操作，E.coli BL21Star(DE3)(Invitrogen公司)作为表 达宿主菌。表达质粒为pET-28a(+)(Invitrogen公司，其质粒图谱如图1所示，多 克隆位点图如图2所示)。

2、培养基

每升培养基中含有：10g复合蛋白胨，5g酵母粉，5NaCl，pH值为7。

3、仪器

MyCyclerTM thermal cycler PCR仪、DNA及蛋白电泳系统为Bio-rad公司产 品；分光光度计及微量分光光度计为Pharmacia Biotech公司产品；Thermomixer  comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；恒温摇床及恒 温水浴锅为WAGEN公司产品；匀浆机、低温高速离心机为BECKMAN和Sigma 公司产品；Dolphin-DOC成像系统为美国WEALTEC公司产品。

(二)实验方法

1、重组大肠杆菌的构建

芽孢杆菌Bacillus sp.III-3基因组的获得方法参照omega基因提取试剂盒说明 书；DNA限制性酶切、连接、PCR扩增均参照Takera试剂说明书；用于扩增碱 性纤维素酶基因III-3-a的引物(上海生工合成)为：

上游引物(EcoR I)：5’-CCGggatccGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3’

下游引物(HindIII)：5’-CCCacgcgtTTATTTTTTCGTAGCCTCTTTC-3’；

PCR产物和表达质粒pET-28a(+)经双酶切后连接转化E.coli Top10获得重组 质粒pET-28a-III-3-a，转化E.coli BL21Star(DE3)，经菌液PCR和测序，检验获 取重组大肠杆菌E.coli III-3-a。

2、碱性纤维素酶活力的测定

用1mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液(0.01mol/L)制备的1％(质量百分比) CMC-Na溶液，加入100μL经适当稀释的酶液，40℃反应30min，加入1mL DNS (3，5-二硝基水杨酸)溶液(DNS溶液的浓度为0.63％)沸水浴10分钟，再加 入2mL蒸馏水于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每 小时由底物产生1mg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力国际单位，用U/mL表 示，葡糖糖浓度用DNS法测定。

3、SDS-PAGE

SDS-PAGE根据Sambrook等的方法进行。

4、发酵温度对酶活的影响

将过夜培养的菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6时加 入终浓度为1mmol/L的诱导物IPTG，分别置于23℃、30℃、37℃、250r/min培 养，诱导培养0、2、4、8、12、16、20小时后测总酶活。

5、IPTG浓度对酶活的影响

将过夜培养的菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6时加 入终浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.2mmol/L的诱导物IPTG，置于23℃250r/min 培养，诱导培养0、2、4、8、12、16、20小时后测总酶活。

6、诱导时菌体浓度对酶活的影响

将过夜培养的菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.4、0.6、 0.8、1.0时加入终浓度为0.2mmol/L的诱导物IPTG，置于23℃250r/min培养， 诱导培养0、2、4、8、12、16、20小时后测总酶活.

7、不同化合物对酶活的影响

将过夜培养菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6时加入 终浓度为0.2mmol/L的诱导物IPTG，在23℃、250r/min进行诱导培养，诱导培 养12个小时后加入培养基终浓度分别为0、0.2％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％(g/ml) 的EDTA、EGTA、瓜氨酸、盐酸胍、Triton X-100，诱导培养16和20个小时后 用培养基上清液测细胞外酶活。

8、EDTA加入时间对酶活的影响

将过夜培养菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6时加入 终浓度为0.2mmol/L的诱导物IPTG，在23℃、250r/min进行诱导培养，诱导培 养4、8、12、16个小时后加入培养基终浓度分别为0.5％的EDTA，诱导培养20 个小时后用培养基上清液测细胞外酶活。

9、溶菌酶及EDTA和溶菌酶对胞外酶活的影响

将过夜培养菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6时加入 终浓度为0.2mmol/L的诱导物IPTG，在23℃、250r/min进行诱导培养，诱导培 养12个小时后加入培养基终浓度分别为0和0.5％(g/ml)的EDTA，再同时分别 加入培养基终浓度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的溶菌酶，诱导培 养14、16、18、20、22小时后用培养基上清液测细胞外酶活。

10、溶菌酶及EDTA和溶菌酶对重组大肠杆菌生长趋势的影响

将过夜培养菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6时加入 终浓度为0.2mmol/L的诱导物IPTG，在23℃、250r/min进行诱导培养，诱导培 养12个小时后加入培养基终浓度分别为0和0.5％(g/ml)的EDTA，再同时分别加 入培养基终浓度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的溶菌酶，诱导培养 12、14、16、18、20、22小时后取0.5mL菌液稀释5倍于600nm测吸光值。

11、溶菌酶加入时间对酶活的影响

将过夜培养菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6时加入 终浓度为0.2mmol/L的诱导物IPTG，在23℃、250r/min进行诱导培养，诱导培 养12个小时后加入培养基终浓度分别为0和0.5％(g/ml)的EDTA，再分别在诱 导培养12、14、16、18、20小时后加入培养基终浓度为0.15mg/mL的溶菌酶， 诱导培养22小时后用培养基上清液测细胞外酶活。

12、EDTA和溶菌酶对细胞酶活的影响

将过夜培养菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6时加入 终浓度为0.2mmol/L的诱导物IPTG，在23℃、250r/min进行诱导培养，诱导培 养12个小时后加入培养基终浓度分别为0和0.5％的EDTA和0.15mg/mL的溶 菌酶，诱导培养20小时后用培养基上清液测细胞外酶活，同时离心去除上清液， 加pH为9的Tris-HCl缓冲溶液，再检测细胞内酶活。

(三)实验结果

1、重组大肠杆菌的构建

以芽孢杆菌Bacillus sp.III-3基因组为模板PCR获得2412bp碱性纤维素酶基 因III-3-a(核苷酸序列如SEQ ID：NO.1所示)，用EcoR I和HindIII双酶切基因 III-3-a与质粒pET-28a(+)，再连接获得表达质粒，经转化、检测获得重组大肠杆 菌E.coli III-3-a(结果如图3所示)。

2、发酵温度对酶活的影响

经测定，重组大肠杆菌E.coli III-3-a在23℃培养时酶活力最高，结果如图4 所示。

3、IPTG浓度对酶活的影响

经测定，IPTG培养基终浓度为0.2mmol/L时重组大肠杆菌E.coli III-3-a酶活 力最高，结果如图5所示。

4、不同化合物对酶活的影响

分别向培养基中加入适量五种典型的化合物，增强大肠杆菌的膜通透性，使 目的蛋白分泌到培养基。经测定，EDTA在五种化合物中效果最好，在诱导培养 12小时后加入培养基终浓度为0.5％的EDTA能使重组大肠杆菌E.coli III-3-a胞外 原始酶活从2.3U/mL提高到17.4U/mL，结果如表1所示。

表1

6、EDTA加入时间对酶活的影响

在已知EDTA的作用效果最好的条件下，在诱导培养后4、8、12、16、20 小时后加入培养基终浓度为0.5％的EDTA，诱导培养22小时后检测培养基外碱 性纤维素酶酶活，发现在诱导培养12个小时后，重组大肠杆菌E.coli III-3-a细胞 外酶活力最高，为17.4U/mL，结果如图6所示。

7、溶菌酶及EDTA和溶菌酶对重组大肠杆菌生长趋势及其酶活的影响

有研究表明EDTA只对大肠杆菌细胞壁有干扰而对细胞膜肽聚糖层无任何作 用，而溶菌酶正好相反，所以现结合两者同时作用于重组大肠杆菌，希望能让重 组菌细胞通透性获得更大的提升，检测对其生长趋势和产酶的影响。经检测：单 独添加适量溶菌酶的条件下，并不能提高重组大肠杆菌E.coli III-3-a胞外酶活， 但在加有培养基终浓度为0.5％的EDTA的条件下再添加适量溶菌酶，比单独添加 EDTA时细胞胞外酶活更高，能从17.4U/mL提高到26U/mL以上。同时，单独 加溶菌酶对大肠杆菌的生长无影响，培养基终浓度为0.5％的EDTA会降低大肠杆 菌的密度，但不会抑制生长，培养基终浓度为0.5％的EDTA和大于或等于 0.2mg/mL的溶菌酶则会抑制大肠杆菌的生长，所以最佳搭配条件为：培养基终浓 度为0.5％的EDTA和0.15mg/mL的溶菌酶，结果如图7、图8、图9所示。

8、溶菌酶加入时间对酶活的影响

在诱导培养后12小时后加入培养基终浓度为0.5％的EDTA，诱导培养12、 14、16、18、20小时后分别加入培养基终浓度为0.15mg/mL的溶菌酶，诱导培养 22小时后检测培养基外碱性纤维素酶酶活，发现在诱导培养12个小时后，加入 EDTA与溶菌酶细胞外酶活力最高。然后在已知最优条件下分别在诱导培养12、 14、16、18、20、22、24小时取样测胞外酶活，发现在诱导培养22小时后重组 大肠杆菌E.coli III-3-a表达量最高，酶活力达26.5U/mL，结果如图10和图11所 示。

9、EDTA和溶菌酶对细胞总酶活的影响

经检测，在重组大肠杆菌E.coli III-3-a对数生长期中前期(OD660为0.4～1.0) 加入诱导剂IPTG，然后在对生长期中期(OD660为1.0～3.5)加入EDTA和溶 菌酶对细胞向胞外分泌目标蛋白的促进作用最为显著，能从2.3U/mL提高到26.5 U/mL，提高了11倍，胞外目标蛋白分泌量占总目标蛋白量的比例从原来的10.9％ 提升到66.3％。同时，计算细胞内外的目标蛋白总酶活发现能从原始的21.8U/mL 提高到40U/mL，提高了83％，结果如表2所示。

表2

实施例2

(一)实验方法

1、重组大肠杆菌的构建

芽孢杆菌Bacillus subtills.32356(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保 藏号：CICC No.20636，作为淀粉酶基因的原始菌)基因组的获得方法参照Omega 基因提取试剂盒说明书；DNA限制性酶切、连接、PCR扩增均参照Takera试剂 说明书；用于扩增淀粉酶基因的引物(上海生工合成)为：

上游引物(Nde I)：5′-GTCCATATGGTAAATGGCACGCTGATG-3′；

下游引物(BamH I)：5′-CGCGGATCCTTATTTCTGAACATAAATGGAGAC-3′；

PCR产物和表达质粒pET-28a(+)经双酶切后连接转化E.coli Top10获得重组 质粒pET-28a-A，转化E.coli BL21Star(DE3)，经菌液PCR和测序(核苷酸序列 如SEQ ID：NO.2所示)，检验获取重组大肠杆菌E.coli III-A。

2、淀粉酶活力的测定

用1mL pH 6.0的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L)制备的1％(质量百分比) 淀粉溶液，加入100μL经适当稀释的酶液，60℃反应30min，加入1mL DNS(3， 5-二硝基水杨酸)溶液(DNS溶液的浓度为0.63％)沸水浴10分钟，再加入2mL 蒸馏水于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每小时由底 物产生1mg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力国际单位，用U/mL表示，葡糖 糖浓度用DNS法测定。

3、EDTA加入对淀粉酶胞外酶活的影响

将过夜培养菌种500微升加到50毫升LB培养基中，待OD₆₀₀为0.6时加入终 浓度为0.2mmol/L的诱导物IPTG，在23℃、250r/min进行诱导培养，诱导培养 12小时后加入培养基终浓度分别为0、0.2％、0.5％、0.8％、1％的EDTA，诱 导培养20个小时后用培养基上清液测细胞外酶活。

(二)实验结果

为了验证加入EDTA对胞外产淀粉酶的促进作用，本实施例通过加入在诱导培 养12小时加入培养基终浓度分别为0、0.2％、0.5％、0.8％、1％(质量体积比) 的EDTA，并测定胞外淀粉酶活(结果如图12所示)。结果发现，加入EDTA 也可显著提高胞外酶活力，其中，EDTA加入量以终浓度0.5％为佳。这说明EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量中的积极作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例 的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。