水稻染色质变构因子CHR729在控制水稻发育中的应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。具体涉及一个与细胞分裂相关的水稻染色质变构因子CHR729的分离 克隆、功能验证和应用。所述的基因与控制水稻发育有关。

背景技术

生物体的生长需要细胞的分裂和细胞的生长来完成。而细胞的分裂扮演着尤为重要的角色，一旦其发 生异常会对生物体的生长造成严重的影响，例如人类的大部分癌症都是由于细胞的分裂失控导致细胞不断 增殖的结果，因此生物体会有一套严格的控制细胞分裂的机制。细胞的分裂周期有G1，S，G2以及M这4 个时期，主要由细胞周期蛋白和依赖于细胞周期蛋白的激酶来控制它们的完成，生物体在特定的时期会有 一些检验点，例如在进入S期以前需检验DNA是否完整或者损伤，而S期以后需检验DNA是否复制完成， 在进入M期之前还要再检验一次DNA是否完整损伤，如果这些检验点中的某一个没有通过，细胞周期都会 停滞直到通过为止。从DNA的损伤到细胞周期的停滞这一系列的信号传导在人类中研究的较为清楚，当 DNA损伤以后一些细胞周期的抑制因子会被激活，它们通过抑制细胞周期蛋白或者依赖于细胞周期蛋白的 激酶的活性来抑制细胞周期的进行。

在植物中对于这一信号途径有了一定的研究，与人类相比存在一些相似的地方，但似乎也存在着植物 特有的方式。研究发现许多含SNF2结构域的蛋白参与拟南芥DNA损伤的信号传导，而这些中的许多都参 与表观遗传调控，同时在人类中染色质变构因子如CHD5以及CHD8也是细胞周期中的重要调控因子(Bagc hi A等，CHD5 is a tumor suppressor at human lp36.Cell，2007，128：459-75；Fujita T等，CHD5，a t umor suppressor gene deleted from lp36.3 in neuroblastomas.J Natl CancerInst，2008，100：940-9；及Nis hiyama M等，CHD8 suppresses p53-mediated apoptosis through histone H1 recruitment during early emb ryo genesis.Nat Cell Biol，2009，11：172-82.)，证明表观遗传调控可能在这一信号传导过程中发挥重要 的作用。

真核生物的DNA与组蛋白结合以染色质的形式存在于核中，这种染色质的结构会阻碍转录因子以及转 录酶与DNA的结合从而不利于基因的表达，因此必须改变这种染色质的结构暴露出DNA进行转录使基因得 以表达，这种涉及到染色质结构改变的调控方式也被称作表观遗传调控，它的分子机理现在还没有完全揭 示，但是目前发现了很多与染色质结构相关事件参与基因表达调控例如组蛋白修饰，DNA甲基化，组蛋白 变体以及染色质重塑，有人提出组蛋白修饰或者DNA甲基化可能作为一种密码被其他的蛋白识别继而调控 基因的表达，但这种假设到现在还没有被完全证实。含SNF2结构域的蛋白能够通过水解ATP改变染色质的 结构发生改变，很多此类蛋白除了含有SNF2结构域还含有现在研究发现可以识别并结合特定组蛋白修饰位 点的结构域如Chromodomain和PHD结构域，例如人类CHD1蛋白的Chromodomain可以识别三甲基化H3K4， 而CHD3的PHD结构域可以与三甲基化的H3K36结合，可能这些蛋白正是通过识别这些甲基化的信号来改 变这个区域的染色质的结构从而调控基因的表达，这也部分支持了组蛋白密码的假说(Flanagan J F等， Double chromodomains cooperate to recognize the methylated histone H3 tail.Nature，2005，438：1181-5； Shi X等，ING2 PHD domain links histone H3 lysine4 methylation to active gene repression.Nature，2 006，442：96-9)。

经检索，在ChromDB数据库(http://www.chromdb.org/index.html)中利用一个在拟南芥中被认为可能 参与DNA损伤信号传导的含SNF2结构域的蛋白CHR4在公共数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)的序 列进行对比搜索发现了一个水稻同源的蛋白CHR729，但没有全长cDNA的支持，仅有两个片段分别对应于 5’端和3’端，关于此基因在水稻中的功能还不清楚。

发明内容

本发明的目的是通过RNAi技术使得一个水稻的CHR729基因在体内下降表达来研究该基因在水稻中的 功能，并应用于水稻生长发育的调控。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明在水稻种找到了一个影响水稻细胞分裂的含SNF2结构域的基因CHR729，并进行了全长cDNA 验证，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为6780个bp。该基因的编码区位于所 述序列表SEQ ID NO：1所述序列的232-369位，1552-1911位和6207-6620位碱基处，共编码2259个氨基酸。 在此基因的翻译区内设计一段该基因特异的片段，构建到用于一种抑制表达载体pDS1301(见图1)然后转 化“中花11”，得到转基因水稻植株。转基因阳性植株拥有植株变矮、叶片(剑叶和营养叶)变短变窄、 抽穗期变晚等多种表型，表明CHR729基因对水稻的正常发育起着重要的作用。

具体操作步骤如下：

从ChromDB数据库(http://www.chromdb.org/index.html)得到CHR729基因(LOC_07g31450)的DNA 序列，根据该序列设计引物对，扩增特异的片段区域(见附录：序列1)。其中引物序列如下：dsCHR729-F 5，---GGGACTAGTGGTACCACCTGCCTCTCCTGCAGTTA---3’和dsCHR729-R 5’---GGGGAGCTCGGATC CGACTCCTCGTCGCTGGATA---3’。

(2)构建抑制表达载体pDS1301(见图1)，获得转化载体pDS1301-CHR729；

(3)利用农杆菌介导的转基因方法(Hiei Y等，Efficient transformation ofrice(OryzasativaL.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJ.1994，6：271-282.) )将所述的载体导入水稻受体中花11(来自中国农业科学院作物研究所)，获得转化植株；

(4)借助RT-PCR和Northern Blot方法分析鉴定阳性转基因植株，并观察统计转基因植株表型；

(5)利用石蜡切片技术观察成熟叶片细胞数目在转基因阳性植株中的变化；

(6)通过MMS处理检测在中花11中的CHR729基因表达量的变化；

(7)通过10uM 6-BA处理中花11和转基因阳性植株，检测CHR729基因及OsRR7基因在这两个材料中表 达量的变化；

(8)借助原核表达蛋白和Western Blot进行体外组蛋白结合实验鉴定CHR729基因与组蛋白识别的位点。 更详细的技术发明细节由以下实施例给出，但并不是限制该发明的保护范围。

附图说明

序列表SEQ ID NO 1：是本发明克隆的水稻染色质变构因子CHR729的核苷酸序列和对应的氨基酸序 列。

图1：抑制表达载体pDS1301示意图。

图2：CHR729基因在转基因植株中的表达量检测。图中：A是CHR729基因在T0代RNAi转基因植株 中的表达量检测，以中花11为阴性对照；B是CHR729基因在T1代RNAi转基因植株中表达量与表型的共分 离检测，编号为10-1，10-2，21-2，21-3代表有表型转基因阳性植株，编号为中花11，10-13，21-12代表无表型 转基因阴性植株，以中花11为阴性对照。

图3：CHR729的RNAi转基因植株的表型图。左图为中花11阴性对照，右图为CHR729转基因阳性有效 性植株；英文小写字母a代表中花11的种子，b-d代表CHR729转基因阳性有效性三个家系的种子。

图4：转基因植株叶片的石蜡切片以及电镜扫描分析。中花11代表阴性对照；dsCHR729代表转基因阳 性植株。

图5：MMS处理对CHR729表达的影响。上图为发芽25天左右的中花11为材料，200mM MMS的水培液 中培养为实验组，不含MMS水培液为对照，分别取培养1小时，4小时，8小时和24小时材料地上部分检测 CHR729的RNA水平的相对表达量，actin为内参；下图为发芽25天左右的中花11为材料，在0ppm，25ppm， 50ppm，75ppm，100ppm，150ppm及200ppm浓度的MMS水培液中培养24小时后，取材料地上部分检测 CHR729基因的RNA水平的相对表达量，actin为内参。

图6：中花11及转基因植株中OsRR7对6-BA应答的情况。ZH11为阴性对照材料，10-17-3为CHR729RNAi 转基因的T3代材料，发芽12天，同时用10uM 6-BA水培养培养0小时和1小时，不含6-BA的培养液培养0小 时和1小时为阴性对照，然后取材料地上部分检测CHR729和OsRR7基因在RNA水平的相对表达量，actin为 内参。

图7：体外检测CHR729基因的结构域与组蛋白特异修饰位点的结合。上图为CHR729基因的蛋白质结构 域的预测的示意图，PHD结构域从78位氨基酸到123位氨基酸，Chromo结构域从518位氨基酸到637位氨基 酸，SNF2结构域从658位氨基酸到1164位氨基酸。下图为体外结合的实验，左侧从上至下分别为Western Blot 实验用的一抗分别为H3抗体，三甲基化H3K4抗体，三甲基化H3K9抗体，三甲基化H3K27抗体及三甲基化 H3K36抗体；图上标从左至右为实验所用的蛋白，分别为Histone(小牛组蛋白)为阳性对照，原核表达纯 化的GST蛋白为阴性对照，融合GST标签原核表达的PHD结构域和融合GST标签原核表达的Chromo结构域 为两个实验组。

具体实施方式

实施例1  CHR729基因片段克隆、双元Ti质粒载体的构建及转化及转基因植株的阳性检测：：

对本发明所需要的基因，通过RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培 堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)进行扩增得到CHR729特异的一段 序列，具体步骤是：根据公共数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)公布的CHD1基因的全长cDNA序列， 通过在ChromDB数据库(http://www.chromdb.org/index.html)中比对寻找CHR729特异的序列设计引物，PCR 扩增RNAi抑制片段。扩增产物通过T/A克隆连接到pGEMT-vector(Promega)进行测序验证。用来克隆 CHR729的RNAi抑制片段的引物为：dsCHR729-F 5’---GGGACTAGTGGTACCACCTGCCTCTCCTGCAGTTA---3’和dsCHR729-R 5’---GGGGAGCTCGGATCCGACTCCTCGTCGCTGGATA---3’。其扩增的DNA片段如附录序列1所示。

具体步骤如下：

1)将带有CHR729的RNAi片段的T/A克隆用KpnI和BamHI酶切，回收目标条带，与KpnI和BamHI酶 切的表达载体质粒pDS1301(山东农业大学山东省农业微生物重点实验室储昭辉教授赠送；该质粒的图谱见图 1；文献：Chu等，Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice.Genes Dev，2006，20：1250-1255.)连接(所使用的内切酶均购自宝生物工程大连有限公司，使用方法及 用量按照该公司提供的产品说明书；连接酶为上海英俊生物技术公司产品，用法及用量按照该公司产品说 明书)；

2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说 明书)导入DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，在含有250ppm卡 那霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂， 王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养；

3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm 卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克 和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述抽提质粒，用KpnI和BamHI酶切并电泳检测，根 据插入片段的大小获得阳性的超表达双元Ti质粒载体：pDS1301-CHR729-1；

4)将带CHR729干涉片段的TA克隆用SpeI和SacI酶切，回收目标条带，与SpeI和SacI酶切的质粒 pDS1301-CHR729-1连接，依据2)、3)步得到抑制表达载体：pDS1301-CHR729-2；

5)把新构建的抑制表达载体pDS1301-CHR729-2通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数如上所 述)导入农杆菌EHA105(购自澳大利亚CAMBIA实验室)菌株中。转化后的菌株命名为TR-CHR729。

6)将TR-CHR729向水稻受体品种“中花11”转化，转化方法参照Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J，1994，6：271-282.)进行。所获得的T0代转基因植株命名为ER-n，其中n＝1，2，3…代表转基因 的不同家系。

7)为了检测转基因植株中目标基因的表达量，申请人采用Northern-blot的方法对转基因T0植株进行了表 达分析。实验所用的总RNA来自分蘖期的水稻叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂 盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；Northern转膜上样量为15-20μg，探针标记采用随机引物标记的方法， 所使用的同位素标记物为α-32P-Dctp，膜在杂交管中先预杂交3个小时左右，然后加入同位素标记的探针， 继续杂交12个小时；杂交结束后，用2×SSC，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)常温下将杂交膜漂洗10分钟， 然后用同样的洗膜液在65℃漂洗，每次两分钟，直到信号值合适为止；洗完膜以后将膜置于干净的滤纸晾 干，用保鲜膜包好，然后用磷屏(Phosphorimage，FUJI，日本)压片4-6小时最后用FUJIFILMFLA5100扫 描读取结果。

在本实施例中，遗传转化(转基因植株获得)采用农杆菌介导的遗传转化方法(文献参见：Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J，1994，6：271-282)报道的主要步骤，培养基以及使用的试剂主要参照华中农业大学授权 专利(专利号ZL200710053552.9，发明的名称：水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用；专利公开日：2008 年6月18日；公开号：CN101200725；专利授权日：2010年04月21日)，本发明实施例的步骤与上述文献的 不同之处在于：愈伤组织洗涤和选择培养(抗性筛选)方法上。本发明该阶段的操作步骤是：

(1)用无菌水洗涤水稻愈伤组织至看不见农杆菌。

(2)将愈伤组织浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的无菌水中30分钟。

(3)将该愈伤组织转移至灭菌好的滤纸上，使该愈伤组织不带水。

(4)转移愈伤组织至选择培养基上选择2-3次，每次2周(第一次潮霉素的浓度为400毫克/升，第二次及 以后潮霉素的浓度为250毫克/升)。

最终本发明总共获得独立转基因水稻RNAi材料T0代21株。

实施例2  T1代性状调查和表达分析：

1)将本发明T0代阳性植株(即CHR729表达下降的植株)收种子(T1代)种入大田进行表型鉴定。结 果发现转基因阳性植株均有不同程度的表型，具体表现为植株变矮，叶片(包括营养叶和剑叶)变窄变短， 茎杆变细，抽穗期推迟、种子变窄以及二次枝梗变少等。统计T2代9-2、T3代17-3-3和21-3-3三个家系 各20株以及中花11对照20株，三个家系分别与中花11对照进行单因素数据显著性性分析，结果如附录 表1，其中^*代表差异显著，P＜0.05；^**代表差极异显著，P＜0.01。

2)为了确定T1代转基因的表型是否与CHR729的表达量共分离(即相对于野生型有表型的转基因单株 CHR729的表达量下降而没有表型的单株CHR729的表达没有变化)，申请人采用RT-PCR方法对两个T1 代转基因家系取有表型和没有表型的单株进行了表达分析。实施例所用的总RNA来自分蘖期的叶片，RNA 抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；RT-PCR中反转录合 成cDNA第一链的步骤如下：①配混合液1：总RNA 2μg，DNAseI 2u，10xDNAseI buffer 1μl，加DEPC (焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％焦碳酸二乙酯(DEPC)到10μl，混匀后将混合 液1在37℃放置20分钟以除去DNA；②20分钟后将混合液1置于70℃水浴中温浴10分钟以去除DNAseI 活性，然后置于冰上5分钟；③向混合液1中加入1μl500μg/ml的oligo(dT)，④将冷却的混合液1立即 置于70℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟；⑥反应结束后将混合液2置于 90℃干浴3分钟⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；RT-PCR用

表1  转基因植株性状调查

RT-PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6 μl，2.5mM Mg²⁺ 1.5μl，左、右引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCRbuffer、dNTP、 Mg²⁺、rTAQ酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃2分钟，②94℃1分钟，③5 8℃1分钟，④72℃2分钟，⑤从②-④循环30次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝 胶上电泳检测。通过RT-PCR检测CHR729基因的相对表达量，actin为内参。CHR729表达量检测引物为CH R729(RT)F：5’---ATCTCTTGGTCGAGGTAAGCG---3’和CHR729(RT)R：TGCAGTTGATTCACCGAGAC--- 3’；actin表达量检测引物为Actin-F：5’---TATGGTCAAGGCTGGGTTCG---3’和Actin-R：5’---CCATGCTCG ATGGGGTACTT---3’。结果发现两个转基因家系，有表型的单株CHR729的表达量均下降，而没有表型的 单株CHR729的表达量与野生型没有明显差异，证明转基因的表型确实由CHR729的表达下降所引起。

实施例3  对转基因植株的叶片进行石蜡切片分析

将需要切片的组织样品取样后放入FAA固定液(配方：50％乙醇，5％冰乙酸，3.7％甲醛)中，组织样 品大小为5mm左右的长度，在4℃固定24小时以上；然后通过以下浓度梯度的乙醇进行脱水：50％3小时， 70％3小时，85％3小时，95％1小时，100％1小时两次；再进入以下浓度梯度的氯仿进行透明：20％(氯 仿/乙醇)2小时，40％2小时，60％2小时，80％2小时，100％2小时；然后在向氯仿中加入碎蜡过夜浸蜡， 待碎蜡完全溶了以后，经过50％蜡(氯仿)2小时，100％蜡2小时，最终包埋在100％的石蜡中；然后进行 切片，切片的厚度为8μm左右，经过42℃展片以后放置与37℃烘片两三天；烘好后将切片放置于二甲苯中 脱蜡，并在固绿中染色，最后用加拿大树胶进行封片。

结果表明叶片中各种细胞包括维管束，泡状细胞以及叶肉细胞的数目均减少，证明转基因植株的细胞 分裂受到影响，即CHR729的功能可能与水稻的细胞分裂有关。

实施例4  MMS处理对CHR729的表达影响分析

将发芽两周的ZH11的全苗在水培液中用200ppmMMS处理，并且用没有加入MMS的水培液做对照，分 别在0小时、4小时、8小时以及24小时取样，然后抽取RNA进行反转录(见实施例2)，反转录产物用定量P CR进行检测，其反应的体系为25μl，其中含有1.5μl反转录产物、0.25M的左右引物和13μl的SYBR Gree n混合物(上海大连宝生物有限公司)。反应在7500real-time定量PCR仪(宝生物工程上海有限公司)上进行， 反应程序按照宝生物工程上海有限公司提供的操作手册进行，以水稻actin基因作为反应中的内参。反应40 个循环，每个样设置三个重复，以actin表达量进行平衡化处理。结果显示相对于对照CHR729的表达量在M MS处理以后4小时即开始下降，8小时以后即下降到最低。

将发芽两周的ZH11全苗在水培液中用不同浓度的MMS(0ppm，25ppm，50ppm，75ppm，100ppm，150p pm和200ppm)处理24hr以后取叶片抽提RNA进行反转录(详细步骤见实施例2)，反转录产物用定量PCR 进行检测(方法见实施例1)，用于CHR729定量PCR检测的引物为CHR729(RQ)F：5’---GATCCCACCATTTA TGCCGA---3，CHR729(RQ)R：5’---CCGTCCGAAAAACCATGAAG---3’和用于actin定量PCR检测引物为A ctinQF：5’---TGTATGCCAGTGGTCGTACCA---3’，ActinQR：5’---CCAGCAAGGTCGAGACGAA---3’结 果显示的表达量在25ppm的MMS处理以后就有所下降，在50ppm的MMS处理以后达到最低，再增加MMS 的浓度对CHR729的表达没有影响。

以上结果表明的表达在MMS处理以后(4hr)立刻下降表达，而且很少量的MMS(25ppm)即能影响 CHR729的表达量，证明CHR729在DNA损伤信号传导中发挥作用。

实施例5  6-BA处理对“中花11”及转基因阳性植株对的OsRR7表达影响分析

将发芽12天的“中花11”及转基因阳性植株的全苗在水培液中用10uM 6-BA(6-苄氨基嘌呤)处理， 分别在0小时、1小时取样，然后抽取RNA进行反转录(见实施例2)，反转录产物用定量PCR进行检测(见 实施例4)，用于OsRR7基因定量PCR检测的引物为OsRR7(RQ)F：5’---TTCTCAAGAAGATCAAGGAATC G---3’，OsRR7(RQ)R：5’---GGCACGTTCTCTGACGACATTAT---3’，用于CHR729基因定量PCR检测的引 物为CHR729(RQ)F：5’---GATCCCACCATTTATGCCGA---3，CHR729(RQ)R：5’---CCGTCCGAAAAACCA TGAAG---3’以及用于actin基因定量PCR检测的引物为ActinQF：5’---TGTATGCCAGTGGTCGTACCA--- 3’，ActinQR：5’---CCAGCAAGGTCGAGACGAA---3’。结果显示相对于对照CHR729的表达量在T3代植 株10-17-3这个家系对比“中花11”明显要低，说明材料的正确性。而10uM 6-BA处理，T3代植株10-17-3 这个家系比“中花11”对照OsRR7基因诱导上升的倍数及量明显要低，说明CHR729在细胞分裂素应当方 面可能起着重要的作用。

实施例6  CHR729体外组蛋白结合实验分析

1)构建体外表达载体。将CHR729的PHD结构域(见附录序列2)和两个chromo结构域(见附录序列3) 的DNA设计引物进行PCR扩增，引物分别为CHR729(PHD)-F：5’---GGATCCGGACATGACGGGTACTTCT ACG---3’，CHR729(PHD)-R：5’---GTCGACGGTGTCAGCATCAGCATTGTC---3’和CHR729(2CD)-F：5’--- GGATCCCACCCTGAGAATGCTGTTCAT---3’；CHR729(2CD)-R：5’---GTCGACGGCTGCTCAACCAGC ATATT---3’。然后利用BamHI和SalI两个酶切位点将这两个DNA片段构建到pGEX4T-1载体上，详细构建 方法见实施例1。

2)原核表达蛋白进行体外组蛋白结合实验。将1)中构建的载体通过电转化的方法导入到BL21(DE3) 菌株中，将转化后的菌株在18℃进行诱导过夜，收集菌体用组蛋白结合buffer重悬浮，用超声波将菌液裂 解，然后加入GST beads在常温下轻轻摇半个小时，用组蛋白结合buffer对上面的beads清洗3次，加入小牛 组蛋白4℃摇过夜(12小时以上)，再用组蛋白结合buffer清洗5次，最后用用洗脱液将组蛋白复合物洗脱 下来，用western blot的方法进行检测。Western blot转膜使用Bio-Rad公司的Mini Trans-Blot Cell转印槽系统， 按照其说明书，将组蛋白转至Amersham公司的Hybond-PPVDF膜上，用配好的含2％(质量体积比)小牛血清 蛋白(BSA)的PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L，pH7.5) 对膜封闭两小时以上，然后以体积比为1∶10000加入不同的抗体室温孵育两小时左右。所用抗体为：Upstate 公司购买的抗H3K4me3，H3K9me3，H3K27me3和H3K36me3以及Abcam公司购买的抗H3(ab1791)抗体(括 号内为货号)。倒掉一抗后，用PBS缓冲液洗膜三次，每次15分钟，再加入按体积比为1∶10000稀释的HRP 标记的羊抗兔二抗(购自Southern Biotech公司)，室温孵育1-2小时，然后用PBS洗膜三次，每次15分钟， 使用Super Singnal Pico(购自Pierce公司)的试剂盒并按试剂盒的说明书介绍的操作方法进行X光片显影， 经扫描仪扫描X光片后分析结果。

结果表明，本发明的CHR729因子的PHD结构域专一性的与H3K27me3结合，而两个串联的chromo结构 域可以与H3结合但是没有特异修饰位点的结合活性，证明本发明的CHR729因子主要是依靠PHD结构域识 别并结合组蛋白，而chromo结构域可能具有巩固这种结合的作用。

附录

序列1：

ACCTGCCTCTCCTGCAGTTATTAAAAGCAGTGATACCCCCTCGCTCAACTTGAACTCACCATCTTCAT CATCAGCTGGCAGTCGGGGGCAGGATGCGTCAACCCCTTCCACTTTTGAAGAACCAGAAAGAACCA TGGAAGTTTCAGAACCTGCTTCTGTCGCTGCTGCCACTTGCCCGTCCAGGCCAGAGCCTCCTGAGAC TGGTACTCACAGAATCGAGTTCTCCGCGGTAGATGACATGGATACTGGATCTTGTAGATCACCTGTG AGGGATACTCCTGACCCTGACAATCAGAAGAGCGAATTGTCTGGATCAGGTAATACACCTACTGAA CTTTCTGTATTACCGTTGGTTGATGCACCTGGGACGAGCAGCGAACCTGCTGTAGTGCCCGTATCCA GCGACGAGGAGTC

序列2：

GAGTGTGTAGAATGTGATCTCGGTGGCAATTTGCTGTGCTGTGATAGCTGTCCACGAACATACCACT TGGAATGTCTTAATCCTCCTCTCAAGCGTGCACCACCTGGAAATTGGCAATGCCCAAGATGTCGTAC AAAA

序列3：

ATACAAGAAACTGAATTGAAGGAGCACGACGGAACTACTTATGAGTTTTTAGTTAAATGGGTTGGC AAATCGAATATCCATAACAGCTGGATTTCTGAATCTGAGCTGAAAGCATTAGCAAAAAGGAAACTA GAAAACTACAAAGCAAAGTACGGAACAGGTTTGATAAACATCTGCAAAGAACAATGGTGCCAACCG CAACGAGTTATTGCTCTGCGCACTTCTTTAGATGAAATAGAAGAGGCTTTGATCAAATGGTGTGCCC TTCCATATGACGAATGCACGTGGGAAAGATTAGATGAACCTACAATGGTGAAGTATGCACATTTGGT CACTCAGTTCAAAAAATTT。