拟南芥花和胚胎特异启动子EL5和EL6及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地说，涉及一种拟南芥花和胚胎特异启动子EL5和EL6及其应用。

背景技术

启动子是基因中重要的顺式作用元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处，其核心结构包括TATA-box和CAAT-box，除核心结构外，还包含转录起始位点、组织特异表达元件和其他调控元件，如生物胁迫和非生物胁迫的诱导元件，这对研究基因的表达和功能具有重要的作用，同时受诱导的启动子能够通过诱导控制该基因在特定的时间和特定的空间表达，并发挥特定的功能。

启动子根据转录模式不同可分为三种：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组织或器官特异性启动子的活性是受特定的组织细胞结构和化学、物理信号诱导调节的，即这类启动子的表达具有特定的时空性。在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位或特定的发育时期。组织或器官特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免目标基因在其他组织器官中表达造成的不利影响。

到目前为止，已有大量的组织或器官特异性启动子被分离出来，其中包括花特异启动子和种子特异启动子。如花粉发育有关的组织特异性启动子如TA29、Lat52、Osg6B、Zm13、S1等已有详细研究报道；UBC6启动子(Watts，1994)主要在花中表达；Tsp1是水稻中绒毡层特异启动子(马沁沁，2005)；DefH9是子房特异启动子(Rotino，1997)；PtNIP1是柏树胚胎发育特异性启动子(Vincent，2002)。这些启动子都能特异启动目标基因的表达，改变特异组织器官的发育。但能同时在花和胚胎中特异表达的启动子鲜有报道。

ESD4是拟南芥中的一种去SUMO化酶，它调节植物中的蛋白质SUMO化修饰状态。EL5和EL6(ESD4like 5和6)是拟南芥中ESD4的同源基因，在活性上，EL5和EL6与ESD4具有共同的去SUMO化酶活性，但是生理机制不完全相同。ESD4主要影响植物的开花，EL5和EL6则通过调节花器官、雄配子体、雌配子体及胚胎的发育，从而影响植物的育性。

发明内容

本发明的目的是提供一种从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离出的花和胚胎特异启动子EL5(ESD4Like 5)和EL6(ESD4Like 6)。

本发明的另一目的是提供启动子EL5和EL6在植物花和胚胎发育调节中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种拟南芥花和胚胎特异启动子EL5，其具有：a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或b)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。如在不改变启动子功能的情况下，将第28位的C取代为T，将第222位的C取代为T，将第2369位的G取代为A，将第2473位的T取代为C。

本发明的一种拟南芥花和胚胎特异启动子EL6，其具有：c)SEQID NO.2所示的核苷酸序列；或d)SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由c)衍生的核苷酸序列。如在不改变启动子功能的情况下，第3位后增加了C，将第952位的A取代为T，将第1099位的A取代为G，将第2481位的T取代为C。

本发明还提供了从拟南芥基因组中克隆得到2500bp的EL5序列所用的引物，其包括正向引物5’-CTCCCTTATCGTGTTGACA-3’和反向引物5’-CGCTAGGGAAATCTGAGGAA-3’。

本发明还提供了从拟南芥基因组中克隆得到2501bp的EL6序列所用的引物，其包括正向引物5’-CTGCTGATTATCTCGTTC-3’和反向引物5’-CCAGTATTATTCTGGCGCCG-3’。

本发明还提供了含有启动子EL5和EL6的载体以及含有所述载体的宿主细胞。

本发明还提供了含有启动子EL5和EL6的转化植物细胞。

本发明还提供了启动子EL5和EL6在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GUS基因。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体及质粒。

本发明首次分离了拟南芥花和胚胎特异启动子EL5和EL6，利用启动子EL5和EL6过表达拟南芥、大豆GUS基因，结果表明启动子EL5和EL6可明显促进植物花器官和胚胎中GUS基因的表达量，因而，EL5和EL6启动子在植物花器官和胚胎中具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花和胚胎中特异表达目标基因。

附图说明

图1为质粒pGreen-GW-GUS的结构示意图；

图2为拟南芥EL5-GUS在花器官(雌蕊)中的表达结果；

图3为拟南芥EL5-GUS在花器官(雄蕊、花粉)中的表达结果；

图4为拟南芥EL5-GUS在花器官(花粉)中的表达结果；

图5为拟南芥EL5-GUS在花器官中的表达结果；

图6为拟南芥EL5-GUS在胚胎中的表达结果；

图7为拟南芥EL5-GUS在胚胎中的表达结果；

图8为拟南芥EL5-GUS在胚胎中的表达结果；

图9为拟南芥EL5-GUS在胚胎中的表达结果；

图10为拟南芥EL6-GUS在花器官中的表达结果；

图11为拟南芥EL6-GUS在胚胎中的表达结果；

图12为拟南芥EL6-GUS在胚胎中的表达结果；

图13为拟南芥EL6-GUS在胚胎中的表达结果；

图14为拟南芥EL6-GUS在胚胎中的表达结果；

图15A为拟南芥EL5-GUS在花序中的表达结果，B为拟南芥EL6-GUS在花序中的表达结果；

图16为拟南芥EL5-GUS及EL6-GUS的PCR检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1拟南芥EL5和EL6启动子的克隆

利用正向引物5’-CTCCCTTATCGTGTTGACA-3’和反向引物5’-CGCTAGGGAAATCTGAGGAA-3’从拟南芥基因组中PCR扩增并测序获得长度为2500bp的EL5启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

利用正向引物5’-CTGCTGATTATCTCGTTC-3’和反向引物5’-CCAGTATTATTCTGGCGCCG-3’从拟南芥基因组中PCR扩增克隆并测序获得长度为2501bp的EL6启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

上述PCR扩增体系为：(20μl体系)

LA Taq酶         0.2μl

10x缓冲液        2.0μl

dNTP(各2.5mM)    1.0μl

引物1(10uM)      1.0μl

引物2(10uM)      1.0μl

DNA模板          1.0μl

ddH₂O            13.8μl

总体积           20.0μl

PCR程序：

实施例2拟南芥EL5和EL6启动子调控下游基因GUS的表达

分别将EL5和EL6启动子克隆并与GUS基因融合，然后将获得的融合基因构建表达载体pGreen-GW-GUS(质粒pGreen-GW-GUS的构建过程为：采用GateWay重组克隆的方法(Invitrogen)，先通过BP反应将PCR产物重组到pDONR207，然后通过LR反应重组到含GUS报告基因的目的载体pGreen-GW-GUS上。pGreen-GW-GUS的结构如图1所示)，获得双元表达载体pEL5-GUS和pEL6-GUS；将植物表达载体pEL5-GUS和pEL6-GUS转化至大肠杆菌DH5α中扩繁。大肠杆菌感受态细胞的转化，包括：(1)制备含氨苄青霉素的LB固体培养基；(2)取出贮存于-80℃的感受态细胞，冰浴中融化后，加入2μl质粒轻轻混匀，冰浴中放置30分钟；(3)42℃热激30秒，然后立即置于冰浴中3分钟；加入300μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1小时(160rpm)；(4)取适量培养液均匀涂于选择性培养基上，37℃倒置培养12-20小时，用灭菌牙签挑取5-10个(或更多)菌落，置于200μl选择性液体LB培养基中摇菌培养；(5)PCR检测筛选到的阳性克隆(图16)。通过农杆菌介导转化方法，将pEL5-GUS和pEL6-GUS转入拟南芥，获得转化pEL5-GUS的拟南芥2株和转化pEL6-GUS的拟南芥4株；通过GUS活性分析表明，EL5和EL6启动子在植物的花(图5、10和15)、雌蕊(图2)、花粉(图3和4)和胚胎(图6、7、8、9、11、12、13和14)中特异表达，可用于包括各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在内的各种植物的花和胚胎中特异表达目标基因。

拟南芥GUS染色：

(1)将组织样品加入90％丙酮中，置于冰上20～30分钟；

(2)经丙酮处理后，用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)、2mMK₄Fe[CN]₆及2mM K₃Fe[CN]₆溶液润洗组织；

(3)将样品放在X-Gluc染色液中(50mM磷酸缓冲液(pH7.2)，1mM X-gluc，2mM K₄Fe[CN]₆，2mM K₃Fe[CN]₆)，抽气10分钟，然后37℃染色过夜；

(4)第二天用70％乙醇脱色；

(5)在载玻片上加几滴HCG溶液，将脱色后的样品置于其中；

(6)压片，透明15分钟或者过夜透明(根据组织的发育时期而定)。

GUS染色液配方：

20mM X-gluc(MW＝521.8)

用DMSO或N，N-二甲基甲酰胺溶解，100mg X-gluc需用9.58mlDMSO溶解，终浓度为20mM。

50mM磷酸缓冲液(pH7.0)

A液：NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；

B液：Na₂HPO₄·12H₂O 7.17g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；

取39mlA液与61mlB液混合。

染色液配制：5mM铁氰化钾；5mM亚铁氰化钾；10mM EDTA；50mM磷酸缓冲液；1mM X-gluc。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。