中药材、中药提取物、土壤及含中药提取物的药物组合物的元素检测方法

技术领域

本发明属于药物的分析检测领域，具体涉及一种中药材、中药提取物、土壤及含中药提取物的药物组合物中元素含量和药效作用的检测分析方法。

背景技术

中药鸦胆子为苦木科鸦胆子属植物鸦胆子Brucea javanica(L.)Merr的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采收，除去杂质，晒干。鸦胆子始载于清代赵学敏所著的《本草纲目拾遗》。中华人民共和国药典中收载的功效为清热解毒，截疟，止痢，腐蚀赘疣。用于痢疾，疟疾；外治赘疣，鸡眼。鸦胆子的有机成分中含水溶性成份及植物油两部分，其毒性成分存在于水溶性苦味成分中；而油溶性成分，即鸦胆子油无毒性且治疗效果较好，目前被广泛的应用于临床中，鸦胆子油提取物用于制备药物制剂，比较普遍使用的制剂是鸦胆子油乳注射液和鸦胆子油口服乳液。

关于鸦胆子药材、提取物、制剂中有机物的含量测定和质量控制方法比较多，控制范围也比较全面，但是关于鸦胆子药材、鸦胆子油及其药物组合物中元素含量的测定和质量控制方法的研究却比较少。例如，孙卫民等对14种抗肿瘤中药中元素含量进行了分析，其中包括用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法分析了鸦胆子中的元素，但仅分析测定出包括Be、Na、Mg、Al、K、Ca、V等在内共26种元素。张小林等采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）法测定包括鸦胆子在内的二十六种南药中的大量和微量元素，但仅测定了鸦胆子中的K、Cr、Zn、Cu、Mn和Fe元素。汤学军等在微量元素与健康研究中，采用ICP-AES、原子荧光光谱法（AFS）、火焰原子吸收光谱法（FAAS）等分析了包括鸦胆子在内药材的稀土或非稀土元素，但没有公开具体的样品处理步骤、仪器条件、鸦胆子中元素检测数据等细节内容。韩金土等采用火焰原子吸收光谱法（FAAS）对包括鸦胆子在内的共20种中草药中的11种微量元素进行了测定，仅测定了鸦胆子的Cu、Mg、Mn等元素的含量。

但是目前已知在自然界中存在的92种天然元素中，除惰性气体元素（氦、氖、氩、氪、氙、氡）和锝、钫、锕、镤、砹等以外，其他81种均存在于生物体中，其中已证实的必需元素包括十一种宏量元素和铁、碘、锌、硒、氟、铜、钴、锰、铬、钒、镍、锡、锶、硅、溴、砷、硼等微量元素。目前受样品处理方法和检测条件的限制，通常在进行元素测定时被测样品的取样量比较小，这导致测定过程中样品的检测值很低，一些成分难以检测出来或测定误差很大。但当提高被测样品的取样量时，在消解过程中样品经常会出现糊化、消解不均匀或不充分等问题，导致测定难以进行或误差很大。特别是针对鸦胆子或其提取物或药物组合物，目前现有技术一般只测定了鸦胆子药材或其提取物及含提取物的药物组合物中部分元素的含量，同时缺乏对元素的含量限度进行研究，更缺乏对鸦胆子生长土壤、中药材、提取物和含提取物的药物组合物元素含量的关联性进行相应的研究。

而且目前样品已知的消解方法，如微波消解法、灰化消解、酸消解等，其中灰化消解效率低、精度差，常常导致待测元素（如Pb、Hg、As）挥发。微波消解虽然方便，但是成本太高、样品量小、存在安全隐患，可测定元素范围小。应用最广泛的是酸消解，但传统的酸消解最大的问题是消解不完全，消解液残留过量的酸会影响测定结果，另外，现有技术中缺少对于植物油、乳剂的统一消解方法。因此，需要从中建立一套适用于中药材、中药提取物、土壤及含中药提取物的药物组合物的元素检测方法，其不仅能够提高检测元素的含量限度，而且能够适应药材、提取物和含提取物的药物组合物元素含量等不同相关样品的成套检测方法，尤其是需要建立同时适合鸦胆子生长土壤、鸦胆子药材、鸦胆子油及鸦胆子油制剂（鸦胆子油乳）的消解方法，以大幅度提高这些样品的元素检测水平。

发明内容

本发明旨在通过对中药材、中药提取物、土壤或含中药提取物的药物组合物的元素检测方法进行设计优化，优化后的消解方法主要控制消解的条件和最终稀释定容的条件，通过这些控制可实现样品的多次消解处理，并可以实现在很宽的称样量范围内都可进行消解，并且实现了消解完全均匀、不糊化，达到了检测准确、重现性好的元素测定效果。以这种消解方法得到的样品溶液可以通过仪器测定元素的含量。提供的这种方法可以同时应用于药材生长土壤、中药材、中药提取物及含中药提取物的药物组合物的样品消解。

本发明具体通过对鸦胆子药材、鸦胆子油、土壤或含鸦胆子油的药物组合物元素的检测分析，检测尽可能全面的元素，使其中包含的近40种元素同时准确定量，建立了一套反映中药材、中药提取物及含提取物的药物组合物中所有可测元素的含量并考察各元素的总体特征的分析方法，并发现了药材等物质中各元素的关联性，将各元素的含量及限度以指纹图谱的形式表示出来。

具体而言，本发明的检测方法测定样品选自中药材、中药提取物、土壤或含中药提取物的药物组合物，样品在称量前可进行预先处理，处理方式按照普通元素测定的方法进行处理即可，例如中药材、土壤等固体物可进行粉碎处理，液体制剂中含有较大量的水，要经过预先除去水分的过程。以鸦胆子为例，鸦胆子药材、土壤可进行粉碎处理；鸦胆子提取物为鸦胆子油可不进行额外处理；鸦胆子油乳剂进行脱水处理。这些处理方法都是本领域比较公知的方法，按照本领域通常的操作进行即可。

检测方法包括以下步骤：

称样步骤：称取中药材、中药提取物、土壤或含中药提取物的药物组合物；

任选的预消解步骤：任选将称样步骤的样品，加入消解液浸泡2～20小时；

初次消解步骤：将装有进行初次消解样品的容器，密闭，放入130～210℃的烘箱中保温1～24小时，取出后冷却。将容器敞口，在150～210℃电热板上加热赶酸至微干，冷却，

所述进行初次消解样品是：

a）预消解步骤浸泡后加入消解液获得；或

b）将称样步骤获得的样品，加入消解液获得；

溶解和定容步骤：将装有消解后的样品的容器中加入超纯水，密闭，放入100～120℃烘箱中保温1～12小时，取出后冷却，加水稀释定容后，得待测样品；

将溶解和定容步骤获得的样品进行元素测定。

在上述方法的研究中，发现在初次的消解中密闭环境且控制在130～210℃温度下是十分关键的，这是整个消解反应完全、均匀、不糊化的一个关键性因素。另外在最终的配制过程中，在加入超纯水放入100～120℃烘箱中保温也是十分关键。经过实验证明，在满足这两个条件下，测定的准确性、稳定性以及广谱性非常好。

上述方法中，一般情况下样品称样量约0.1~1g，优选在0.35~1g，最优选0.5g。

另外，在初次消解后本领域技术人员可以根据需要选择进行后续类似的消解处理，实验证明进行二次或三次消解处理基本满足检测要求，这进一步提高了测定的效果。当然在三次消解步骤后，本领域技术人员可以根据需要再进行一次或多次消解。综合考虑成本和效率因素，二至三次消解是比较合适的。

上述方法中在初次消解后，可进一步包括二次消解步骤：将初次消解后样品加入消解液，在150～210℃电热板上加热赶酸至微干，冷却。在二次消解步骤后还可以进一步包括三次消解步骤：将二次消解后的样品中再次加入消解液，在150～210℃电热板上加热赶酸至微干，冷却。

本发明在进行消解步骤时，优选在170～190℃电热板上加热赶酸至微干，更优选在180℃电热板上加热。

本发明的操作方法中，预消解步骤可根据需要进行。对于鸦胆子药材或鸦胆子油或含鸦胆子油的药物组合物的元素测定中，当样品是鸦胆子药材时，优选进行预消解步骤，更优选浸泡10小时；当样品是鸦胆子油、鸦胆子生长的土壤时，可不需要预消解。

进一步地，本发明的鸦胆子药材、鸦胆子油、土壤或含鸦胆子油的药物组合物的样品测定方法包括：

称样步骤：称取鸦胆子药材、鸦胆子油、土壤或含鸦胆子油的药物组合物的样品约0.1~1g，优选0.35g~1g，最优选0.5g；

任选的预消解步骤：任选将称样步骤的样品，加入消解液浸泡2～20小时；其中，当样品是鸦胆子药材时，优选浸泡10小时；

初次消解步骤：将装有进行初次消解样品的容器，密闭，放入130～210℃的烘箱中保温1～24小时，取出后冷却，将容器敞口，在150～210℃电热板上加热赶酸至微干，冷却，

所述进行初次消解样品是：

a）预消解步骤浸泡后加入消解液获得；或

b）将称样步骤获得的样品，加入消解液获得；

溶解和定容步骤：将装有消解后的样品的容器中加入超纯水，密闭，放入100～120℃烘箱中保温1～12小时，取出后冷却，加水稀释定容，摇匀后待测，优选使用塑料瓶定容；

将溶解定容步骤获得的样品进行元素测定。

上述方法中在初次消解后，可进一步包括二次消解步骤：将初次消解后样品加入消解液，在150～210℃电热板上加热赶酸至微干，冷却。在二次消解步骤后还可进一步包括三次消解步骤：将二次消解后的样品中再次加入消解液，在150～210℃电热板上加热赶酸至微干，冷却。在三次消解步骤后可再进行一次或多次消解。

上述方法中每个步骤中加入的消解液是本领域中进行消解的一般试剂，可以选自硝酸、过氧化氢、氢氟酸、高氯酸、盐酸、硫酸、过硫酸钾、过硫酸氢钾、过硫酸钠、过硫酸氢钠、磷酸、氢溴酸，或两种以上物质的任意比组合。

上述方法中，具体针对鸦胆子药材进行预消解步骤时，消解液优选使用过氧化氢浸泡预消解，优选2ml过氧化氢/0.5g鸦胆子药材。

上述方法中，进行初次消解时，鸦胆子油初次消解可以使用硝酸或过氧化氢，优选是硝酸和过氧化氢的组合，每0.5g鸦胆子油使用5ml硝酸和2ml过氧化氢的效果最好；鸦胆子生长土壤初次消解可以使用硝酸或氢氟酸，优选是硝酸和氢氟酸的组合，每0.5g土壤样品3ml硝酸和5ml氢氟酸的效果最好；鸦胆子药材初次消解可根据是否进行预消解步骤调整消解液的使用，例如：如进行预消解步骤则消解液可直接在预消解后的混合物中加入消解液，优选使用硝酸，每0.5g鸦胆子药材使用5ml硝酸的效果最好，如没有进行预消解步骤则可直接添加消解液，优选是硝酸和过氧化氢的组合，每0.5g鸦胆子药材使用5ml硝酸和2ml过氧化氢的效果最好。

上述方法中，二次消解、三次消解步骤以及其他后续的消解步骤中，使用的消解液优选硝酸。每0.5g称样的样品加入消解液1～10ml，更优选1ml消解液。

上述方法中，所述初次消解步骤中烘箱的保温温度为180～200℃，优选190℃；保温时间为10～14小时，优选12小时。

上述方法中，优选所述消解步骤中在电热板上加热赶酸是在170～190℃电热板上加热，更优选在180℃电热板上加热。

上述方法中，所述溶解和定容步骤中烘箱的温度优选105～115℃，更优选110℃；保温时间优选3～10小时，更优选4小时。

元素含量测定

按照本发明的方法对样品进行处理后进行元素测定，所述的测定方法可按照本领域中通常进行元素测定的方法进行。

目前测定元素含量的仪器和方法主要有原子吸收光谱法（AAS）、原子荧光光谱法（AFS）、离子色谱法（IC）、电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-AES、ICP-OES）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、中子活化分析法（INAA）、X射线荧光光谱法（XRF）等。还有测定特定样品和特定元素的微量元素测定仪。在以上这些测定方法中，电感耦合等离子体质谱法具有灵敏度最高、一次可测定多种元素、使用方便等优点，本发明以电感耦合等离子体质谱法作为最优选的方法，其他的仪器和方法或其各种组合作为次优选或补充的方法。

ICP-MS测定元素含量的优选按以下条件进行测定：RF功率： 1200w～1600w之间，优选1300w～1400w，冷却气流速：16L/min，辅助气流速：1.0L/min，雾化气流速：0.8L/min，采样深度：8mm，采样锥孔径：1.0mm，截取锥孔径：0.7mm，样品提升速率：0.4ml/min，雾化温度：2℃。在上述条件下，采用ICP-MS法，对样品中的各元素进行含量测定，每份样品平行测定3次，得到元素含量结果。

绘制元素指纹图谱

将测定的各元素含量值绘制成元素指纹图谱，元素指纹图谱包括2种图谱。

第一种图谱是安全限度指纹图谱，用测定结果中具有安全限度值的元素绘制2条曲线，安全限度曲线和测定曲线。以元素序号为横坐标，以元素限度值的对数值为纵坐标，绘制的曲线为安全限度曲线。以元素序号为横坐标，元素含量的对数值为纵坐标，绘制的曲线为测定曲线（元素含量为0ng/g或者按测定值计算为负值的其对数值为无意义，这种情况下一律计为0）。安全限度图谱可以判断药物中各元素是否超出安全限度，要求测定曲线完全在安全限度标准曲线之下，如果两条曲线之间有重合点或者交叉点即判定有元素超出安全限度，为不合格药物或需要有条件地应用于临床。

第二种图谱是元素含量指纹图谱，用所有测定的元素绘制一条曲线，以元素序号为横坐标，以元素含量的对数值为纵坐标（元素含量为0ng/g或者按测定值计算为负值的其对数值为无意义，这种情况下一律计为0），绘制元素含量曲线。元素含量指纹图谱可以直观判断并且可以根据药物中各元素的含量，鉴别药材真伪优劣、区分药材和代用品、鉴别药材产地、反映生产中药材-提取物-制剂的变化规律等特性的作用。

由于中药色谱指纹图谱和光谱指纹图谱主要反映的是中药中有机化合物的特征，具有辨别药材产地和药材真伪的作用，但由于各个产地各年（各种植周期）的气候、降雨量、湿度、温度、季节交替、日照时间、风向、风速等的不同，反映有机化合物特征的指纹图谱是不完全固定的，而且光谱和色谱指纹图谱均只具有半定量的特点，这是色谱和光谱指纹图谱的一个局限。但是由于药材各产地的地壳中各微量元素的含量处于一个相对稳定的状态，中药鸦胆子药材中各元素整体的指纹图谱特征主要受鸦胆子药材产地的影响，即种植鸦胆子药材的土壤中金属元素的含量的影响，因此，反映各产地药材元素特征的元素指纹图谱可以更准确地归属药材的产地，而且元素指纹图谱中各元素的含量是准确定量的，兼有独立反映每一个元素含量的功能，这是指纹图谱这个概念的本质思路：既反映整体的宏观特征、又体现各元素的微观特征。

将未知药材与已知的各产地药材、道地药材的元素指纹图谱曲线进行相似度比较，可以判断出药材的产地、是否是真品、是否是道地药材。

元素指纹图谱较难判断出药材优品与劣品之间的差异，优品和劣品之间的差异主要在于药物的药效优劣，而与药效直接有关的质量控制一般在于有机物的分析，这时可结合色谱、光谱指纹图谱与元素指纹图谱综合评价药材。

反映生产中药材-提取物-制剂的变化规律等特性

中药材经提取、制备等步骤得到提取物和制剂的过程中，中药材中各元素会出现含量的减低甚至是缺失（检测不到）、也可能由于工艺的原因出现一些元素含量的提高，研究中药材-提取物-制剂之间元素指纹图谱的变化规律可作为准确控制生产工艺稳定均一的手段。

稳定均一的生产工艺必然有稳定的元素指纹图谱变化规律，这为传统的参照质量标准进行的生产过程控制提供重要的参考和补充。也可避免中药生产过程中可能存在的特定元素污染。

本发明的优点是：

1、本发明提供的消解方法，干扰少，消解完全，测定准确度高，适用样品广泛，适用于土壤、药材、提取物及其制剂。该方法实现了样品的多元素同时测定，通过精密度、重复性、准确度实验结果证实了该方法能够准确测定40多种元素的含量。

2、本发明的消解和最终配制方法实现了对中药提取物和制剂的元素准确全面的测定，该方法的运用对于研究中药材-提取物-制剂之间元素指纹图谱的变化规律，准确控制中药生产各环节都有重要作用，是衡量产品工艺是否稳定均一的重要检测方法。

3、本发明将元素的安全隐患以指纹图谱的形式准确全面地表现出来，元素的安全限度来源于各国的药典标准和行业标准，可以直接控制产品质量，保证了临床的用药安全。

4、通过本发明获得的元素指纹图谱的相似度比较，判断出药材的产地、是否是真品、是否是道地药材更准确。

附图说明

图1  鸦胆子药材的安全限度指纹图谱

图2  鸦胆子药材的元素含量指纹图谱

具体实施方式

实施例1

（1）称样：称取约0.5g的鸦胆子药材细粉；

（2）预消解：将细粉加入至高压消解罐的聚四氟乙烯内管中，加入2ml过氧化氢（优级纯），浸泡10小时；

（3）初次消解：将装有上述预消解样品的聚四氟乙烯内管中直接再加入5ml硝酸（高级纯），将聚四氟乙烯内管放入高压消解罐中，将高压消解罐封好旋紧，放入190℃的烘箱中保温12小时，取出后冷却。将聚四氟乙烯内管在180℃电热板上加热赶酸至微干，冷却。

（4）溶解和定容：将装有消解后样品的聚四氟乙烯内管中加入10ml左右超纯水，将聚四氟乙烯内管放入高压消解罐中，将高压消解罐封好旋紧，放入110℃烘箱中保温4小时，取出后冷却，加水稀释至25ml。摇匀后转入专用塑料样品瓶中，编号待测。

同步以标准物质做随行对照，并做全程序空白，用ICP-MS测定，结果见下表：

表1 实施例1元素测定结果

质量分数：ng/g(10^－9)

检测不到：Nd

对比实施例1

步骤（1）、（2）、（4）同实施例1，步骤（3）如下：

（3）初次消解：将未密封的高压消解罐放入190℃的烘箱中保温12小时，取出后冷却。将聚四氟乙烯内管在180℃电热板上加热赶酸至微干，冷却。

实验在进行到步骤（3）时，出现样品糊化、样品大量损失及交叉污染，导致实验无法继续进行。

对比实施例2

步骤（1）、（2）、（4）同实施例1，步骤（3）如下：

（3）初次消解：将高压消解罐封好旋紧，放入240℃的烘箱中保温12小时，取出后冷却。将聚四氟乙烯内管在180℃电热板上加热赶酸至微干，冷却。

同步以标准物质做随行对照，并做全程序空白，用ICP-MS测定，结果见下表：

表2对比实施例2元素测定结果

质量分数：ng/g(10^－9)

检测不到：Nd

对比实施例3

步骤（1）～（3）同实施例1，步骤（4）如下：

（4）溶解和定容：将装有消解后样品的聚四氟乙烯内管中加入10ml左右超纯水，将聚四氟乙烯内管放入高压消解罐中，将高压消解罐封好旋紧，放入80℃烘箱中保温4小时，取出后冷却，加水稀释至25ml。摇匀后转入专用塑料样品瓶中，编号待测。

同步以标准物质做随行对照，并做全程序空白，用ICP-MS测定，结果见下表：

表3对比实施例3元素测定结果

质量分数：ng/g(10^－9)

检测不到：Nd

小结：由上述实验可以看出，本发明使用的初次消解方法，元素基本无损失，测定数据更平行，相对标准偏差（RSD）小，结果准确度高。

消解后的样品溶解和定容过程使测定更加准确稳定。

实施例2

步骤（1）～（3）同实施例1，步骤（4）～（6）如下：

（4）二次消解：将装有初次消解后样品的聚四氟乙烯内管中加入1ml硝酸（高级纯），在180℃电热板上加热赶酸至微干，冷却。

（5）三次消解：将二次消解后的样品中再次加入1ml硝酸（高级纯），在180℃电热板上加热赶酸至微干，冷却；

（6）溶解和定容：将装有消解后样品的聚四氟乙烯内管中加入10ml左右超纯水，将聚四氟乙烯内管放入高压消解罐中，将高压消解罐封好旋紧，放入110℃烘箱中保温4小时，取出后冷却，加水稀释至25ml。摇匀后转入专用塑料样品瓶中，编号待测。

同步以标准物质做随行对照，并做全程序空白，用ICP-MS测定，结果见下表：

表4 实施例2元素测定结果

质量分数：ng/g(10^－9)

检测不到：Nd

小结：由于样品中含有卤族元素，这些卤族元素在消解过程中会形成一定量的氢卤酸，在测定过程中发现氢卤酸对实验仪器有一定的损害，经过二三次消解后，氢卤酸被进一步清除，减小了对仪器的损害。

另外，在实验中还发现，虽然鸦胆子初次消解的待测样品比较澄清，但其他某些中药样品初次消解后待测样品不够澄清或有不均匀的现象，在经过二三次消解后，样品可达到澄清均匀的效果。

实施例3

（1）称样：称取约0.5g的鸦胆子油，加入至高压消解罐的聚四氟乙烯内管

中，加入5ml硝酸（高级纯）、2ml过氧化氢（优级纯）；

（2）初次消解：将装有上述样品的聚四氟乙烯内管放入高压消解罐中，将高压消解罐封好旋紧，放入210℃的烘箱中保温20小时，取出后冷却；将聚四氟乙烯内管在180℃电热板上加热赶酸至微干，冷却。

（3）二次消解：将装有初次消解后的样品的聚四氟乙烯内管中加入1ml硝酸（高级纯），在180℃电热板上加热赶酸至微干，冷却；

（4）三次消解：将二次消解后的样品中再次加入1ml硝酸（高级纯），在180℃电热板上加热赶酸至微干，冷却；

（5）溶解和定容：将装有消解后样品的聚四氟乙烯内管中加入10ml左右超纯水，将聚四氟乙烯内管放入高压消解罐中，将高压消解罐封好旋紧，放入100℃烘箱中保温10小时，取出后冷却，加水稀释至25ml。摇匀后转入专用塑料样品瓶中，编号（或标记名称）后待测。

同步以标准物质做随行对照，并做全程序空白，用ICP-MS测定，结果见下表：

表5 实施例3元素测定结果

质量分数：ng/g(10^－9)

检测不到：Nd

实施例4

取人参多糖（人参是历史悠久的名贵中药之一，现代中药学研究表明，多糖是人参的有效成分，其药理学活性体现在多个方面，如抗肿瘤、降血糖、抗疲劳、抗氧化和免疫调节等。人参多糖是以从人参中提取出的多糖为主要成分的有效部位提取物），按照实施例2的步骤进行元素测定，结果如下：

表6 实施例4元素测定结果

质量分数：ng/g(10^－9)

检测不到：Nd

实施例5

用实施例2中鸦胆子的元素测定结果绘制元素指纹图谱。

安全限度指纹图谱的绘制：用测定结果中具有安全限度值的元素绘制2条曲线，安全限度曲线和测定曲线。以元素序号为横坐标，以元素限度值的对数值为纵坐标，绘制的曲线为安全限度曲线。以元素序号为横坐标，元素含量的对数值为纵坐标，绘制的曲线为测定曲线（元素含量为0ng/g或者按测定值计算为负值的其对数值为无意义，这种情况下一律计为0）。安全限度图谱可以判断药物中各元素是否超出安全限度，要求测定曲线完全在安全限度标准曲线之下，如果两条曲线之间有重合点或者交叉点即判定有元素超出安全限度，为不合格药物或需要有条件地应用于临床。

元素含量指纹图谱的绘制：用所有测定的元素绘制一条曲线，以元素序号为横坐标，以元素含量的对数值为纵坐标（元素含量为0ng/g或者按测定值计算为负值的其对数值为无意义，这种情况下一律计为0），绘制元素含量曲线。元素含量指纹图谱可以直观判断并且可以根据药物中各元素的含量，鉴别药材真伪优劣、区分药材和代用品、鉴别药材产地、反映生产中药材-提取物-制剂的变化规律等特性的作用。