一种提高低再生力小麦基因型幼胚组织培养再生率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高低再生力小麦基因型幼胚组织培养再生率的方法。

背景技术

小麦组织离体培养高频率植株再生是开展小麦细胞工程育种和转基因育种的重要 环节之一。目前为止，培养小麦幼胚、幼穗、花药、成熟胚、小孢子等外植体材料先 后获得了再生植株，其中，小麦幼胚被认为是再生率最高的外植体类型。但是，小麦 幼胚培养在不同基因型之间存在显著差异，能够高频率获得再生植株的基因型非常有 限，尤其是一些大面积推广的优良小麦品种，其幼胚的再生能力往往都很低。大面积 推广优良小麦品种的适应性、丰产性和抗病性等已满足生态条件和生产发展的需要， 改良它们的个别缺点后即可在生产上较长时间种植，因而是细胞工程育种和转基因育 种的首选起始材料。研究表明，改良培养基(如SD2培养基)和培养程序(如生长素 间歇处理)等技术策略可以提高具有中等以上培养力小麦品种幼胚的再生率，但对弱 再生力小麦品种幼胚培养的效果不显著。因此，研究用于提高弱再生力小麦品种幼胚 组织培养再生率的培养方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高低再生力小麦幼胚组织培养再生率的方法。

本发明所提供的提高低再生力小麦幼胚组织培养再生率的方法，通过对高、低再 生力小麦品种幼胚间隔接种进行愈伤组织诱导培养和对小麦愈伤组织间隔接种进行分 化培养这两个步骤来提高低再生力小麦幼胚组织培养的再生率，所述方法包括如下步 骤：

1)将高再生力小麦品种的幼胚和低再生力小麦品种的幼胚按行间隔接种于装有愈 伤组织诱导培养基的同一个容器中，在黑暗条件下进行诱导培养，得到高再生力小麦 品种愈伤组织和低再生力小麦品种愈伤组织；

2)将步骤1)得到的低再生力小麦品种愈伤组织和高再生力小麦品种愈伤组织按 行间隔转移到装有分化培养基的同一个培养容器中，即仍然保持步骤1)的间隔接种 方式，在光照条件下进行分化培养，得到低再生力小麦品种再生植株和高再生力小麦 品种再生植株。

该方法对低再生力小麦幼胚组织培养的再生率高于对所述低再生力小麦幼胚进行 单独组织培养的再生率。对所述低再生力小麦幼胚进行单独组织培养的方法除了接种 方式是单独接种(装有愈伤组织诱导培养基的培养容器内只接种所述低再生力小麦幼 胚，并且装有分化培养基的培养容器内只接种所述低再生力小麦品种胚性愈伤组织) 外，其它培养条件均与本发明的方法相同。

所述高再生力小麦品种具体可为新春9号或科农199，所述低再生力小麦品种具 体可为中国春。

本发明的上述方法中，所述步骤1)和2)的同一个培养容器中，接种所述高再生 力小麦品种的幼胚或愈伤组织的行数和接种所述低再生力小麦品种的幼胚或愈伤组织 的行数最好相同，如同一个培养容器中，所述高再生力小麦品种和所述低再生力小麦 品种的行数均为3行，其按行间隔接种方式可为第1、3和5行接种所述低再生力小麦 品种，第2、4和6行接种所述高再生力小麦品种(图1)。

本发明的上述方法中，所述步骤1)的同一个培养容器中，接种的所述高再生力 小麦品种的幼胚的个数具体可为所述低再生力小麦品种的幼胚的个数的1-1.14倍。在 本发明的一个实施例中，所述高再生力小麦品种为新春9号，所述低再生力小麦品种 为中国春，接种的新春9号的幼胚个数是中国春幼胚个数的1-1.01倍；在本发明的另 一个实施例中，所述高再生力小麦品种为科农199，所述低再生力小麦品种为中国春， 接种的科农199的幼胚个数是中国春幼胚个数的1.13-1.14倍；所述步骤2)的同一个 培养容器中，接种的所述高再生力小麦品种的愈伤组织的个数是所述低再生力小麦品 种的愈伤组织的个数的0.85-1.21倍。在本发明的一个实施例中，所述高再生力小麦品 种为新春9号，所述低再生力小麦品种为中国春，接种的新春9号的愈伤组织个数是 中国春愈伤组织个数的0.85-1.10倍；在本发明的另一个实施例中，所述高再生力小麦 品种为科农199，所述低再生力小麦品种为中国春，接种的科农199的愈伤组织个数 是中国春愈伤组织个数的1.12-1.21倍。

本发明的上述方法中，所述步骤1)中的按行间隔接种的行距(相邻两行中心线 的垂直距离)可为0.9-1.1cm，幼胚距(样距)(每行中相邻两个幼胚中心之间的距离) 可为0.5-0.7cm；所述步骤2)中的按行间隔接种的行距(相邻两行中心线的垂直距离) 可为0.9-1.1cm，愈伤组织距(样距)(每行中相邻两个愈伤组织中心之间的距离)可为 0.5-0.7cm。

本发明的上述方法中，所述步骤1)中的愈伤组织诱导培养基具体可为SD2培养 基，所述步骤2)中的分化培养基具体可为FHCK培养基。其中，SD2培养基的组成 为：NH₄NO₃1650mg/L、KNO₃1900mg/L、CaCl₂·2H₂O 440mg/L、MgSO₄·7H₂O370 mg/L、KH₂PO₄1700mg/L、KI0.83mg/L、H₃BO₃6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、 ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，FeSO₄·7H₂O27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L、蔗糖30g/L、维生 素B₁10mg/L、谷氨酰胺150mg/L、2，4-D2.0mg/L、植物凝胶2.4g/L，pH值为6.0。 FHCK培养基的组成为：NH₄NO₃1650mg/L、KNO₃1900mg/L、CaCl₂·2H₂O440mg/L、 MgSO₄·7H₂O370mg/L、KH₂PO₄1700mg/L、KI0.83mg/L、H₃BO₃6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O0.025mg/L、 CoCl₂·6H₂O0.025mg/L，FeSO₄·7H₂O27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L、维生素 B₁1mg/L、维生素B₆0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L、蔗糖 20g/L、植物凝胶2.4g/L，pH值为6.0。

本发明的上述方法中，所述高再生力小麦品种的幼胚和低再生力小麦品种的幼胚 均可为开花授粉后12-14天、大小1.0-1.2mm的幼胚。

本发明的上述方法中，所述步骤1)中的诱导培养温度为24℃-26℃、时间为20-25 天；所述步骤2)中的光照条件为每天以3500Lx的光强光照10小时，所述分化培养 的温度为24℃-26℃、时间为20-25天。

现有的小麦组织培养程序中，将来源同一小麦品种的相同外植体材料接种在一个 培养器皿中培养，先后诱导愈伤组织和分化植株，本发明的小麦组织培养方法，将来 源高、低再生力的2个小麦品种的幼胚按行间隔接种在同一个培养器皿中培养，依次 诱导愈伤组织和分化植株，显著提高了低再生小麦品种的再生率、胚性愈伤组织诱导 率和愈伤组织分化率。实验证明，将小麦中国春(低再生力小麦品种)幼胚和小麦新 春9号(高再生力小麦品种)幼胚按照本发明的的方法进行培养，小麦中国春再生率 为18.59％，小麦新春9号的再生率为49.82％，单独培养的小麦中国春再生率为0.37％， 小麦新春9号的再生率为41.61％(表1)；将小麦中国春(低再生力小麦品种)幼胚 和小麦科农199(高再生力小麦品种)幼胚按照本发明的的方法进行培养，小麦中国 春再生率为67.98％，小麦科农199的再生率为251.94％，单独培养的小麦中国春再生 率为3.03％，小麦科农199的再生率为176.82％(表2)。

本发明通过改进小麦幼胚接种培养方法，显著提高了弱再生力小麦基因型的再生 频率、胚性愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率，对于利用细胞工程技术和基因工程技 术改良大面积推广小麦品种的个别缺点具有重要意义。

附图说明

图1为高再生力小麦品种幼胚、低再生力小麦品种幼胚间隔培养方式图示

图2为小麦中国春幼胚与新春9号幼胚单独培养及间隔培养再生植株效果

A为小麦中国春幼胚单独培养——对照培养方法

B为小麦新春9号幼胚单独培养——对照培养方法

C为小麦中国春幼胚与新春9号幼胚间隔培养-——本发明培养方法

图3为小麦中国春幼胚与科农199幼胚单独培养及间隔培养再生植株效果

A为小麦中国春幼胚单独培养——对照培养方法

B为科农199幼胚单独培养——对照培养方法

C为小麦中国春幼胚与科农199幼胚间隔培养-——本发明培养方法

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明， 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例1和2中所用的小麦如下：

小麦品种中国春(石珍源等，中国农业科学，2011，44(2)：225-232)(中国农 业科学院作物科学研究所)；

小麦品种科农199(石珍源等，中国农业科学，2011，44(2)：225-232)(中国 农业科学院作物科学研究所)；

小麦品种新春9号(丁文静等，作物学报，2007，33(6)：955-960)(中国农业科 学院作物科学研究所)。

下述实施例1和2中所用的SD2培养基和FHCK培养基如下：

SD2培养基组成为：NH₄NO₃1650mg/L、KNO₃1900mg/L、CaCl₂·2H₂O 440mg/L、 MgSO₄·7H₂O₃70mg/L、KH₂PO₄1700mg/L、KI0.83mg/L、H₃BO₃6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O0.025mg/L、 CoCl₂·6H₂O0.025mg/L，FeSO₄·7H₂O27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L、蔗糖30 g/L、维生素B₁10mg/L、谷氨酰胺150mg/L、2，4-D2.0mg/L、Phytagel(植物凝胶) 2.4g/L，pH值为6.0。以上成分采用121℃高压湿热灭菌20分钟。

FHCK培养基组成为：NH₄NO₃1650mg/L、KNO₃1900mg/L、CaCl₂·2H₂O440 mg/L、MgSO₄·7H₂O370mg/L、KH₂PO₄1700mg/L、KI0.83mg/L、H₃BO₃6.2mg/L、 MnSO₄·4H₂O22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O0.025mg/L，FeSO₄·7H₂O27.8mg/L、Na₂-EDTA·2H₂O37.3 mg/L、维生素B₁1mg/L、维生素B₆0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇 100mg/L、蔗糖20g/L、Phytagel(植物凝胶)2.4g/L，pH值为6.0。以上成分采用 121℃高压湿热灭菌20分钟。

下述实施例1和2中所用的培养皿均相同，直径为9.0cm。

下述实施例1和2中的胚性愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率、绿苗获得率(再 生率)的计算公式如下：

胚性愈伤组织诱导率(％)＝(胚性愈伤组织数÷接种幼胚数)×100；

愈伤组织分化率(％)＝(分化愈伤组织数÷接种幼胚数)×100；

绿苗获得率(％)＝(分化绿苗数÷接种幼胚数)×100。

实施例1、利用小麦新春9号提高小麦中国春的幼胚组织培养再生率

本实施例以小麦中国春(低再生力小麦品种)、小麦新春9号(高再生力小麦品种) 为实验对象阐明本发明所保护的提高低再生力小麦幼胚组织培养再生率的方法，具体 如下：

1、小麦幼胚的获得

将小麦中国春和小麦新春9号种植在中国农业科学院作物科学研究所实验农场 (4-5月份小麦生长期间温度15-30℃)，开花授粉后12-14天，收集小麦中国春和小麦 新春9号的幼胚(心形期，大小为1.0-1.2mm)。

2、组织培养

1)诱导培养产生愈伤组织

将上述二种小麦幼胚按行间隔接种在SD2培养基上培养(称为间隔培养)，以二 种小麦幼胚分别单独接种在SD2培养基上培养作为对照。上述培养条件均为25℃、黑 暗条件下培养20天得到愈伤组织。

其中，上述二种小麦幼胚按行间隔接种在SD2培养基上的方法如下：将小麦中国 春幼胚和小麦新春9号幼胚按行间隔接种于同一个培养皿中，每个培养皿中小麦中国 春幼胚和小麦新春9号幼胚各接种三行，第1、3和5行接种小麦中国春幼胚，第2、 4和6行接种小麦新春9号幼胚。行距(相邻两行中心线的垂直距离)为0.9-1.1cm， 样距(或胚距)(每行中相邻两个幼胚中心之间的距离)为0.5-0.7cm。小麦中国春幼 胚和小麦新春9号幼胚按行间隔接种10个培养皿中，总共接种了271个小麦新春9 号幼胚和269个小麦中国春幼胚。其中，第1-第8个培养皿中，每个培养皿中小麦新 春9号幼胚共27个，小麦中国春幼胚共27个，小麦新春9号幼胚的个数是小麦中国 春幼胚的1倍；第9个培养皿中，小麦新春9号幼胚共28个，小麦中国春幼胚27个， 小麦新春9号幼胚的个数是小麦中国春幼胚的1.01倍；第10个培养皿中，小麦新春9 号幼胚共27个，小麦中国春幼胚26个，小麦新春9号幼胚的个数是小麦中国春幼胚 的1.01倍。该间隔培养共得到262个小麦新春9号愈伤组织和248个中国春愈伤组织。

小麦中国春幼胚单独接种在SD2培养基上的方法如下：在一个培养皿中只按行接 种小麦中国春幼胚，样距(或胚距)与行距与上述间隔培养相同。小麦中国春幼胚共 接种5个培养皿，总共接种了267个小麦中国春幼胚。该小麦中国春幼胚单独培养共 得到260个愈伤组织。

小麦新春9号幼胚单独接种在SD2培养基上的方法如下：在一个培养皿中只按行 接种小麦新春9号幼胚，样距(或胚距)与行距与上述间隔培养相同。小麦新春9号 幼胚共接种5个培养皿，总共接种了274个小麦新春9号幼胚。该小麦新春9号幼胚 单独培养共得到259个愈伤组织。

2)分化培养得到小麦再生植株

将步骤1)间隔培养产生的262个小麦新春9号愈伤组织和248个小麦中国春愈 伤组织按行间隔转移到装有FHCK培养基的10个培养皿中，每个培养皿中小麦中国 春愈伤组织和小麦新春9号愈伤组织各接种三行，第1、3和5行接种小麦中国春愈伤 组织，第2、4和6行接种小麦新春9号愈伤组织(图2中C)。行距(相邻两行中心 线的垂直距离)为0.9-1.1cm，样距(每行中相邻两个愈伤组织中心之间的距离)为 0.5-0.7cm。其中，第1-第8个培养皿中，每个培养皿中小麦新春9号愈伤组织共27 个，小麦中国春愈伤组织共25个，小麦新春9号愈伤组织的个数是小麦中国春愈伤组 织的1.08倍；第9个培养皿中，小麦新春9号愈伤组织共23个，小麦中国春愈伤组 织27个，小麦新春9号愈伤组织的个数是小麦中国春愈伤组织的0.85倍；第10个培 养皿中，小麦新春9号愈伤组织共23个，小麦中国春愈伤组织21个，小麦新春9号 愈伤组织的个数是小麦中国春愈伤组织的1.10倍。

同时，将步骤1)小麦中国春幼胚单独接种培养产生的260个愈伤组织转移到装 有FHCK培养基的5个培养皿中，样距与行距与上述间隔培养相同(图2中A)；将 步骤1)小麦新春9号幼胚单独接种培养产生的259个愈伤组织转移到装有FHCK培 养基的5个培养皿中，样距与行距与上述间隔培养相同(图2中B)。

将这些愈伤组织均在如下条件下培养20天，分化得到小麦再生植株：每天以 3500Lx的光强光照10小时，分化培养的温度为25℃。结果表明步骤1)间隔培养产 生的262个小麦新春9号愈伤组织中有121个是胚性愈伤组织，其中有92个胚性愈伤 组织发生分化，共得到135个小麦再生苗；步骤1)间隔培养产生的248个小麦中国 春愈伤组织中有52个是胚性愈伤组织，其中有29个胚性愈伤组织发生分化，共得到 50个小麦再生苗；步骤1)小麦中国春幼胚单独接种培养产生的260个愈伤组织中有 1是个胚性愈伤组织，分化出1个再生苗；步骤1)小麦新春9号幼胚单独接种培养产 生的259个愈伤组织中有90个是胚性愈伤组织，其中有72个胚性愈伤组织发生分化， 共得到114个小麦再生苗。

整个实验结果如表1。小麦中国春幼胚和小麦新春9号幼胚间隔培养情况下，小 麦中国春再生率为18.59％，小麦新春9号的再生率为49.82％；小麦中国春幼胚和小 麦新春9号幼胚单独培养情况下，小麦中国春再生率为0.37％，小麦新春9号的再生 率为41.61％。

表1.小麦新春9号和中国春幼胚单独接种及间隔接种组织培养情况

另外，按照上述培养步骤又进行了两次重复实验，实验结果基本相同，无显著差 异。

实施例2、利用小麦科农199提高小麦中国春的幼胚组织培养再生率

本实施例以小麦中国春(低再生力小麦品种)、小麦科农199(高再生力小麦品种) 为实验对象阐明本发明所保护的提高低再生力小麦幼胚组织培养再生率的方法，具体 方法如下：

1、小麦幼胚的获得

将小麦中国春和小麦科农199种植在中国农业科学院作物科学研究所实验农场 (4-5月份小麦生长期间温度15-30℃)，开花授粉后12-14天，收集小麦中国春和小 麦科农199的幼胚(心形期，大小为1.0-1.2mm)。

2、组织培养

1)诱导培养产生愈伤组织

将上述二种小麦幼胚按行间隔接种在SD2培养基上培养(称为间隔培养)，以二 种小麦幼胚分别单独接种在SD2培养基上培养作为对照。上述培养条件均为25℃、黑 暗条件下培养25天得到愈伤组织。

其中，上述二种小麦幼胚按行间隔接种在SD2培养基上的方法如下：将小麦中国 春幼胚和小麦科农199幼胚按行间隔接种于同一个培养皿中，每个培养皿中小麦中国 春幼胚和小麦科农199幼胚各接种3行，第1、3和5行接种小麦中国春幼胚，第2、 4和6行接种小麦科农199幼胚。行距(相邻两行中心线的垂直距离)为0.9-1.1cm， 胚距(或样距)(每行中相邻两个幼胚中心之间的距离)为0.5-0.7cm。小麦中国春幼 胚和小麦科农199幼胚按行间隔接种10个培养皿中，总共接种了258个小麦科农199 幼胚和228个小麦中国春幼胚。其中，第1个-第8个培养皿中，小麦科农199幼胚 26个/皿，小麦中国春幼胚23个/皿，每个培养皿中小麦科农199幼胚的个数是小麦中 国春幼胚的1.13倍；第9个-第10个培养皿中，小麦科农199幼胚25个/皿，小麦中 国春幼胚22个/皿，每个培养皿中小麦科农199幼胚的个数是小麦中国春幼胚的1.14 倍。该间隔培养共得到258个小麦科农199愈伤组织和228个中国春愈伤组织。

小麦中国春幼胚单独接种在SD2培养基上的方法如下：在一个培养皿中只按行接 种小麦中国春幼胚，样距(或胚距)与行距与上述间隔培养相同。小麦中国春幼胚共 接种6个培养皿，总共接种了330个小麦中国春幼胚。该小麦中国春幼胚单独培养共 得到327个愈伤组织。

小麦科农199幼胚单独接种在SD2培养基上的方法如下：在一个培养皿中只按行 接种小麦科农199幼胚，胚距(或样距)与行距与上述间隔培养相同。小麦科农199 幼胚共接种6个培养皿，总共接种了371个小麦科农199幼胚。该小麦科农199幼胚 单独培养共得到371个愈伤组织。

2)分化培养得到小麦再生植株

将步骤1)间隔培养产生的258个小麦科农199愈伤组织和228个小麦中国春愈 伤组织按行间隔转移到装有FHCK培养基的10个培养皿中，每个培养皿中小麦中国 春愈伤组织和小麦科农199愈伤组织各接种3行，第1、3和5行接种小麦中国春愈伤 组织，第2、4和6行接种小麦科农199愈伤组织(图3中C)。行距(相邻两行中心 线的垂直距离)为0.9-1.1cm，样距(或愈组距)(每行中相邻两个愈伤组织中心之间 的距离)为0.5-0.7cm。其中，第1-第8个培养皿中，每个培养皿中小麦科农199愈伤 组织共27个，小麦中国春愈伤组织共24个，小麦科农199愈伤组织的个数是小麦中 国春愈伤组织的1.125倍；第9个培养皿中，小麦科农199愈伤组织共19个，小麦中 国春愈伤组织17个，小麦科农199的个数是小麦中国春愈伤组织的1.12倍；第10个 培养皿中，小麦科农199愈伤组织共23个，小麦中国春愈伤组织19个，小麦科农199 愈伤组织的个数是小麦中国春愈伤组织的1.21倍。

同时，将步骤1)小麦中国春幼胚单独接种培养产生的327个愈伤组织转移到装 有FHCK培养基的6个培养皿中，样距(或愈组距)与行距与上述间隔培养相同(图 3中A)；将步骤1)小麦科农199幼胚单独接种培养产生的371个愈伤组织转移到装 有FHCK培养基的6个培养皿中，样距(或愈组距)与行距与上述间隔培养相同(图 3中B)。

将这些愈伤组织均在如下条件下培养25天，分化得到小麦再生苗：每天以3500Lx 的光强光照10小时，分化培养的温度为25℃。结果表明步骤1)间隔培养产生的258 个小麦科农199愈伤组织中有202个胚性愈伤组织，其中有153个胚性愈伤组织发生 分化，共得到650个小麦再生苗；步骤1)间隔培养产生的228个小麦中国春愈伤组 织中有119个胚性愈伤组织，其中有49个胚性愈伤组织发生分化，共得到155个小麦 再生苗；步骤1)小麦中国春幼胚单独接种培养产生的327个愈伤组织中有15个胚性 愈伤组织，其中有8个胚性愈伤组织发生分化，共得到10个小麦再生苗；步骤1)小 麦科农199幼胚单独接种培养产生的371个愈伤组织中有277个胚性愈伤组织，其中 有217个胚性愈伤组织发生分化，共得到656个小麦再生苗。

整个实验结果如表2。小麦中国春幼胚和小麦科农199幼胚间隔培养情况下，小 麦中国春再生率为67.98％，小麦科农199的再生率为251.94％；小麦中国春幼胚和小 麦科农199幼胚单独培养情况下，小麦中国春再生率为3.03％，小麦科农199的再生 率为176.82％

表2小麦科农199和中国春幼胚单独接种及间隔接种组织培养情况

另外，按照上述试验步骤又进行了两次重复实验，实验结果基本相同，无显著差 异。