中华绒螯蟹促性腺释放激素类似物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体为中华绒螯蟹促性腺释放激素 类似物及其制备方法和应用。

背景技术

脊椎动物的促性腺释放激素(GnRH)是下丘脑分泌、由十个氨基酸组成的 神经多肽激素，GnRH作为下丘脑-垂体-性腺轴关键信息分子，通过与脑垂体中 的GnRH特异受体相结合，从而刺激促性腺激素(GSH)、卵泡刺激素(FSH)、 黄体生成素(LH)的产生与释放，刺激排卵、提高怀孕率及抑制卵巢发育障碍， 起着调节生殖活动的作用。二十世纪七十年代研究人员开始GnRH的研究，1971 年Schally等从猪的下丘脑中提纯出一种激素可以促进LH释放，经过6年的研究确 定该激素是氨基酸序列为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂的十 肽，命名为促黄体释放激素(LHRH)(SCHALLY，ARIMURA，KASTIN，et al. Gonadotropin-releasing hormone：one polypeptide regulates secretion of luteinizing  and follicle-stimulating hormones[J].Science，1971，173(4001)：1036-1038.)。在之后 的几十年研究中又陆续发现多种GnRH类似物，同时证实其具有促进FSH释放功 能，最终将这类多肽命名为GnRH。

迄今为止，在脊椎动物中已经发现14种GnRH类型(O.Kah，C.Lethimonier， G.Somoza，L.G.Guilgur，C.Vaillant，J.J.Lareyre，GnRH and GnRH receptors in  metazoa：a historical，comparative，and evolutive perspective，Gen.Comp.Endocrinol. 153(2007)346-364.)，采用首次发现物种对其命名。这些不同类型分别为哺乳类 (mGnRH)、豚鼠(gpGnRH)、鸡(cGnRH-I)、鸡(cGnRH-II)、牛蛙(rGnRH)、 鲷鱼(sbGnRH)、鲑鱼(sGnRH)、白鲑(wfGnRH)、青鳉(mdGnRH或pjGnRH)、 鲶鱼(cfGnRH)、鲱鱼(hrGnRH)、鲨鱼(dfGnRH)、七鳃鳗(lGnRH-I)、七 鳃鳗(lGnRH-II)、七鳃鳗(lGnRH-III)。根据生理、结构、分布的不同，将脊 椎动物GnRH分为四类：GnRH-I在位于前脑的视前叶位置神经元中合成，转运 到中间隆起位置，最后在下丘脑部位释放，通过刺激FSH与LH的合成与释放， 对下丘脑-垂体-性腺轴进行最终调控；GnRH-II在中脑合成，推测其作用作为神 经递质(Tsai，P.-S.，2006.Gonadotropin-releasing hormone in invertebrates：structure， function，and evolution.Gen.Comp.Endocrinol.148，48-53.)；GnRH-III在端脑合 成，参与调控交配等生殖过程(Fernald，R.D.，White，R.B.，1999. Gonadotropin-releasing hormone genes：phylogeny，structure，and functions.Front. Neuroendocrin.20，224-240.)；GNRH-IV的代表类型为lGnRH-I和lGnRH-III， 由间脑和脑室部位合成(Silver，M.R.，Kawauchi，H.，Nozaki，M.，Sower，S.A.，2004. Cloning andanalysis of the lamprey GnRH-III cDNA from eight species of lamprey  representing the three families of Petromyzoniformes.Gen.Comp.Endocrinol.139， 85-94.)，在下丘脑部位释放，其功能还有待研究。

GnRH作为一种关键性生殖调控因子，其氨基酸序列组成上具有高度保守 性，其中1、4、9、10位氨基酸序列完全相同，在2及3位氨基酸除了gpGnRH 与lGnRH-I之外的类似物均一样。第1～3位是与效应细胞上的受体结合点，并 经过细胞膜的Ca²⁺通道进入细胞，第4-10位氨基酸残基参与受体结合。由第2 和第6位氨基酸作为主要活性基团决定其功能，同时，在促性腺激素合成及释放 中，第8位氨基酸为调控的关键位点(P.S.Tsai，L.Zhang，The emergence and loss  of gonadotropin-releasing hormone in protostomes：orthology，phylogeny，structure， and function，Biol.Reprod.79(2008)798-805.)。通过改造GnRH多肽结构，现在 已经开发出超过2000种GnRH类似物，例如，在动物繁殖控制中GnRH-A已经 开始商品化广泛应用。在鱼类水产养殖中，应用GnRH诱导鱼类产卵成为了鱼 类人工繁育中普遍采用的方法，为水产养殖业带来了巨大经济效益。

GnRH是一种古老的多肽家族，在尾索动物亚门的被囊类中已发现9种 GnRH类似物，这些GnRH类似物同样为十肽结构并且与脊椎动物具有相同的氨 基酸保守位置。免疫鉴定研究表明在头索动物、半索动物、棘皮动物、节肢动物、 扁形动物、软体动物等非脊椎动物中都存在GnRH类似物(方永强，黄威权，陈 蕾.GnRH在文昌鱼脑和哈氏窝的分布[J].动物学报，1999，45(1)：106-11； RASTOGI R K，DI FIORE M M，D ANIELLO A，et al.GnRH in the invertebrates：on overview[J].Prog Brain Res，2002，141，19-29；ANCTIL M，TEKAYA S. Gonadotropin-releasing hormone-like immunoreactivity in the planarian delloura  candida(Platyhelminthes，Tricladida)[J].Invert Bio，2005，1 124：11-17.)。

与脊椎动物GnRH相似，非脊椎动物GnRH类似物也具有调控生殖的作用。 在田螺(Helisoma trivolvls)中证实合成的mGnRH能刺激产卵量增加(YOUNG， CHANG，GOLDBERG.Gonadotropin-releasing hormone neuronal system of the  freshwater snails Helisoma trivolvis and Lymnaea stagnalis：possible involvement in  reproduction[J].J Comp Neurol，1999，404(4)：427-437.)，被囊类(Ciona inte stinalis) 的性腺进行离体培养时加入mGnRH和cGnRH-I能够促进性腺类固醇激素的释 放，tGnRH-II可以刺激半索动物(Saccoglossus bromophenolosus)配子释放(Di  FIORE，RASTOGI，CECILIANI，et al.Mammalian and chicken I forms of  gonadotropin-releasing hormone in the gonads of a protochordate，Ciona  intestinalis[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(5)：2343-2348.)。在斑节对虾中注 射LHRH、sGnRH、lGnRH-I后具有明显促进卵巢成熟作用，推测甲壳类动物 卵巢发育也是通过GnRH类似物进行调控(NGERNSOUNGNERN， NGERNSOUNGNERN，WEERACHATYANUKUL，et al.The existence of  gonadotropin-releasing hormone(GnRH)immunoreactivity in the ovary and the  effects of GnRHs on the ovarian maturation in the black tiger shrimp Penaeus  monodon[J].Aquaculture，2008，279(1-4)：197-203.)。

迄今在章鱼(Octopus vulgaris)、海兔(Aplysia californica)、海胆 (Strongylocentrotus purpuratus)、帽贝(Lottia gigantea)、海蠕虫(Capitella teleta)、 水蛭(Helobdella robusta)以及3种被囊类(Chelyosoma productum、Ciona  intestinalis、Ciona savignyi)中共发现15种非脊椎动物GnRH类似物(ROCH， BUSBY，SHERWOOD.Evolution of GnRH：diving deeper[J].Gen Comp Endocrinol， 2011，171(1)：1-16.)。虽然在非脊椎动物发现多种GnRH类似物，但是大多并未实 际分离出多肽，仅是在mRNA水平获得相应序列进行推断氨基酸序列，只有在 章鱼(Octopus vulgaris)应用反向高压液相色谱(RP-HPLC)技术首次分离出无 脊椎动物GnRH类似物octGnRH，经N-端及C-端氨基酸测序表明该类似物为十 二个氨基酸短肽，氨基酸序列为：pGlu-Asn-Tyr-His-Phe-Ser-Asn-Gly-Trp-His- Pro-Gly-NH₂，与脊椎动物GnRH具有相似氨基酸保守位点，人工合成的octGnRH 可以促进鹌鹑细胞LH释放，具有脊椎动物GnRH功能特征(IWAKOSHIE， TAKUWA-KURODAK，FUJISAWAY，et al.Isolation and characterization of a  GnRH-like peptide from Octopus vulgaris[J].Biochem Biophys Res Commun，2002， 291：1 187-1193.)。

近期国外学者在多种十足类甲壳动物应用免疫组化定位实验中证实有 GnRH类似物存在。在斑节对虾中央神经系统(CNS)中发现有GNRH类似物存 在证据，实验表明，很可能存在oct-GnRH、lGnRH-III类似物 (NGERNSOUNGNERN，NGERNSOUNGNERN，KAVANAUGH，et al.The  presence and distribution of gonadotropin-releasing hormone-liked factor in the  central nervous system of the black tiger shrimp，Penaeus monodon[J].Gen Comp Endocrinol，2008，155(3)：613-622.)。在罗氏沼虾的CNS中存在两种GnRH类似物， 分别与lGnRH-III与oct-GnRH相类似(NGERNSOUNGNERN， NGERNSOUNGNERN，KAVANAUGH，et al.The identification and distribution of  gonadotropin-releasing hormone-like peptides in the central nervous system and  ovary of the giant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii[J].Invert Neurosci， 2008，8(1)：49-57.)。在日本囊对虾中将RP-HPLC、时间分辨荧光分析法(TR-FIA) 以及免疫组织化学法相结合，结果也证实存在GnRH类似物(AMANO， OKUMURA，OKUBO，et al.Biochemical analysis and immunohistochemical  examination of a GnRH-like immunoreactive peptide in the central nervous system of  a decapod crustacean，the kuruma prawn(Marsupenaeus japonicus)[J].Zoolog Sci， 2009，26(12)：840-845.)，但是至今在甲壳动物还没有相关GnRH分离纯化的报道。

发明内容

本发明旨在提供一种促性腺释放激素(GnRH)类似物，是中华绒螯蟹的促 性腺释放激素类似物。

本发明还提供上述中华绒螯蟹的促性腺释放激素类似物的制备方法和应用。

中华绒螯蟹的促性腺释放激素类似物，氨基酸序列分别为QSYHFSHGWKP 与QAYHFSHGWKP。

这种中华绒螯蟹的促性腺释放激素类似物可用于人工催熟蟹类卵母细胞。

本发明首次以反向高效液相色谱法(RP-HPLC)为分离手段，从中华绒螯 蟹(Eriocheir sinensis)脑组织中提取促性腺释放激素类似物(GnRH)，使用章 鱼促性腺释放激素抗体(anti-octGnRH)对分离组分进行免疫斑点印迹实验鉴定， 获得了免疫反应呈阳性分离组分。使用基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质 谱(MALDI-TOF/TOF MS)对分离组分进行分析，发现2种亚型GnRH类似物， 氨基酸序列分别为QSYHFSHGWKP与QAYHFSHGWKP(如序列表SEQ ID No.1 和No.2所示)。

从中华绒螯蟹脑组织中提取制备上述GnRH类似物的方法包括以下步骤：

(1)取中华绒螯蟹的脑组织粗提液，用RP-HPLC法分级分离，采用二元 流动相梯度洗脱法洗脱，其中流动相A为1wt‰三氟乙酸水溶液；流动相B为1 wt‰三氟乙酸乙腈溶液，且0～45分钟内流动相B在流动相中体积含量从5％线 性增加至35％；RP-HPLC流量1ml/ml，柱温25℃；收集章鱼GnRH免疫反应呈 阳性的组分；优选收集第17～22min分离组分；

(2)取步骤(1)产物，用RP-HPLC法进行第二次分级分离，采用二元 流动相梯度洗脱法洗脱，其中流动相A为1wt‰三氟乙酸水溶液；流动相B为1 wt‰三氟乙酸乙腈溶液，且0～50分钟内流动相B在流动相中体积含量从1％线 性增加至10％；RP-HPLC流量1ml/ml，柱温25℃；收集章鱼GnRH免疫反应呈 阳性的组分；优选收集第28～29.5min分离组分；

(3)取步骤(2)产物，用RP-HPLC法进行第三次分级分离，采用二元 流动相梯度洗脱法洗脱，其中流动相A为1wt‰三氟乙酸水溶液；流动相B为1 wt‰三氟乙酸乙腈溶液，且0～50分钟内流动相B在流动相中体积含量从0％线 性增加至10％；RP-HPLC流量1ml/ml，柱温25℃；收集章鱼GnRH免疫反应呈 阳性的组分；优选收集第33～35min分离组分。

中华绒螯蟹的脑组织粗提液制备方法包括如下步骤：

取雌性性成熟健康中华绒螯蟹脑组织，加入1wt‰三氟乙酸水溶液0～4℃匀 浆，12000～18000rpm离心2015～20min，取上清液。

分离得到的这两种中华绒螯蟹的促性腺释放激素类似物与其他物种GnRH 进行进行氨基酸序列比对，结果显示，具有相似的氨基酸保守位点，序列结构与 无脊椎动物GnRH相类似。

这两种中华绒螯蟹的促性腺释放激素类似物也可以人工合成。

根据该类似物氨基酸序列人工合成两种GnRH类似物多肽，通过活体注射 实验验证其生物学功能。结果表明，两种类似物都可以显著刺激中华绒螯蟹卵母 细胞生发泡破裂(GVBD)、对卵母细胞的成熟具有明显的促进作用。虽然无脊 椎动物不存在脑垂体，但以上结果提示，无脊椎动物GnRH作为一种调控因子 在性腺发育、配子释放过程中也起到重要作用，可能作为一种上游调控因子，调 控下游激素释放。中华绒螯蟹GnRH类似物的获得及其生理功能的验证，为该 物质应用于蟹类人工催熟奠定基础。

本发明利用RP-HPLC技术结合免疫学方法分离鉴定了中华绒螯蟹(Eriocheir  sinensis)脑组织中GnRH类似物，是继章鱼之后第二个在蛋白质水平分离鉴定的 无脊椎动物GnRH类似物，同时也是甲壳类动物中首次获得的GnRH多肽，为该 类似物进一步应用于蟹类人工催熟奠定基础。

本研究建立中华绒螯蟹GnRH类似物的分离制备方法，首次分离鉴定了中 华绒螯蟹GnRH类似物，测定了其氨基酸序列，发现了两种亚型的GnRH，活体 注射实验实验结果表明，两种亚型的GnRH都具有与脊椎动物的GnRH相似的 功能，可以刺激卵母细胞生发泡破裂，对蟹卵母细胞最终成熟有显著促进作用， 对于中华绒螯蟹人工催熟具有重要应用价值。

附图说明

图1为中华绒螯蟹脑组织粗提液经RP-HPLC分离的色谱图；1-9为主要分离峰； 方框内的7号峰，经免疫鉴定呈阳性分离组分，保留时间为19-20min。

图2为中华绒螯蟹脑组织粗提液经RP-HPLC分离后第7号峰(保留时间： 19-20min)的免疫斑点印迹实验。

图3为RP-HPLC制备含有GnRH类似物(保留时间：17-22min)的分离产物。

图4中华绒螯蟹脑组织粗提液初次分离后所得第7号峰(保留时间：19-20min) 再经RP-HPLC分离的色谱图；1-11为主要分离峰；方框内是免疫鉴定呈阳性分 离组分，保留时间为29-30min。

图5为第二次分离中三个分离组分(保留时间分别为：28-28.5min、28.5-29min、 29-29.5min)免疫反应呈阳性的实验结果(免疫斑点印记实验)。

图6第二次分离中三个分离组分(保留时间：28-28.5min、28.5-29min、 29-29.5min)的RP-HPLC分离谱图，1-5为主要分离峰。方框内为免疫鉴定呈阳 性分离组分，保留时间为33-34min。

图7免疫斑点印迹实验结果表明第三次分离中两个分离组分(保留时间： 33-33.5min、33.5-34min)免疫反应呈阳性。

图8为RP-HPLC检测GnRH类似物的结果。

图9为一级质谱检测RP-HPLC分离样品中GnRH类似物的分子量。

图10分子量为1373.63Da的GnRH类似物二级质谱图。

图11分子量为1356.63DaGnRH类似物二级质谱图。

图12实验获得与人工合成标GNRH类似物准物质保留时间对比，具有相同保留 时间；其中，1-实验获得GNRH类似物，2-氨基酸序列为QSYHFSHGWKP 人工合成多肽，3-氨基酸序列为QAYHFSHGWKP人工合成多肽。

图13中华绒螯蟹GnRH类似物氨基酸序列与其他物种GnRH氨基酸序列对比图 黑色和灰色部分分别表示完全相同和相似的氨基酸残基。

图14为未成熟和成熟的卵母细胞，a：未成熟卵母细胞，生发泡未发生破裂，可 以明显观察到细胞核(N：细胞核)；b：成熟卵母细胞，生发泡发生破裂，观察 不到细胞核。

图15在第一阶段30天实验周期内中华绒螯蟹GnRH类似物注射后实验组(左 侧柱状图为GnRH类似物-I型，右侧柱状图为GnRH类似物-II型)、阴性对照组 (PBS组)、空白对照组GVBD个体比例之间比较；其中，纵坐标：GVBD比例％， 横坐标：实验分组(^*p＜0.05，^**p＜0.01)。

图16为第二阶段30天实验周期内中华绒螯蟹GnRH类似物注射后实验组、阴 性对照组(PBS组)、空白对照组GVBD个体比例之间比较，进一步证实GnRH 类似物可以显著促进卵母细胞生发泡破裂；纵坐标：GVBD比例％，横坐标：组 分，(^*p＜0.05)。

具体实施方式

实施例1  中华绒螯蟹GnRH类似物分级分离、免疫鉴定及串联质谱分析

1材料与方法

1.1实验材料

多肽分离实验：中华绒螯蟹购于上海本地养殖场，选取四肢健全、活力较强， 体重100-150g的雌性性成熟个体暂养于上海海洋大学农业部水产种质资源与利 用重点开放实验室，养殖箱(50cm×60cm)内构建遮蔽物，24小时充氧，隔天 换水，每日投喂饲料两次。

1.2实验方法

1.2.1蟹脑粗提液制备

选取雌性性成熟健康个体，冰上迅速解剖脑组织，每50只蟹脑组织加入 1wt‰三氟乙酸水溶液10ml，冰上匀浆，4℃15000rpm离心20min，取上清液， 浓缩后-80℃保存备用

1.22RP-HPLC分离实验

应用日本岛津(SHIMADZU)Prominence高效液相系统对蟹脑组织粗提液 进行分级分离，采用二元流动相梯度洗脱法进行洗脱，即流动相A：1wt‰三氟 乙酸水溶液；流动相B：1wt‰三氟乙酸乙腈溶液。所用流动相均预先超声处理， 系统流速：1ml/min；色谱柱：岛津VP-ODS(150L×4.6)C-18色谱柱，柱温： 25℃，进样量：150μl。使用自动组分收集器分别收集每分钟分离组分，收集组 分浓缩后-40℃保存。

1.2.3免疫斑点印迹实验

将硝酸纤维素膜(NC膜)浸泡于EBM缓冲液(2.5×10-2mol/L三羟甲基氨 基甲烷，0.2mol/L甘氨酸，5.0mol/L甲醇)中15min，室温晾干约5min后，将1 μl样品依次水平点在NC膜上，样点相距1cm左右，每个样品设3个平行实验； 放置室温干燥60min，浸入小牛血清(1∶10)封闭60min，弃去血清，用TTBS (0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷，0.15mol/L氯化钠，2.8×10-4mol/L吐温80，用 盐酸溶液调节pH至7.5)漂洗3次，每次8min；随后浸入含有章鱼GnRH抗体 (由美国科罗拉多大学Tsai Pei-San教授赠送)的TTBS缓冲液中孵育，放置于 水平摇床，室温低速摇晃过夜；次日用TTBS漂洗3次，每次8min，加入含有 HRP标记二抗，室温孵育60min；TTBS漂洗3次，每次8min，最后用DAB-H₂O₂显色。阴性对照组使用正常兔血清代替一抗(章鱼GnRH抗体)，空白对照组不 使用任何血清。

2实验结果

2.1中华绒螯蟹脑组织GnRH类似物初步分离及免疫鉴定

为了获得蟹脑组织粗提液中的GnRH类似物，本实验采用RP-HPLC方法对 其进行分级分离。对RP-HPLC的梯度洗脱条件进行优化(表1)，最终确定参数 为50min内流动相B在洗脱相中的体积含量从5％到35％按线性关系增长时获 得分离效果最佳。RP-HPLC色谱图显示粗提液分离后主要分为9个峰(如图1， 中华绒螯蟹脑组织粗提液经RP-HPLC分离的色谱图，1-9为主要分离峰)，使用 自动组分收集器收集每分钟RP-HPLC分离产物。对每一收集组分进行免疫斑点 印迹鉴定，结果表明只有19-20min收集组分免疫反应呈阳性(免疫斑点印迹实 验结果如图2，A：免疫斑点印迹实验组；B：空白对照实验组；C：阴性对照实 验组)，其余分离组分免疫反应均呈阴性，空白对照组与阴性对照组免疫反应也 均为阴性。实验中19-20min分离组分对应色谱图中方框内的第7号峰，这表明 该分离峰内含有GnRH类似物。

表1：RP-HPLC实验参数

2.2初次获得GnRH类似物RP-HPLC分离及免疫鉴定

根据初步分离实验条件下获得数据，通过液相系统制备保留时间为17-22min 的分离产物(HPLC如图3)，通过优化RP-HPLC分离条件(表2)将收集到的， 分离组分进行分离，洗脱梯度调整为45min内流动相B浓度由1％上升至10％ 时分离效果最好(如图4，中华绒螯蟹脑组织粗提液初次分离后所得保留时间为 19-20min第7号峰再经RP-HPLC分离的色谱图)，收集保留时间25-40min的分 离产物，每30秒收集一管，收集组分浓缩至100微升后进行免疫斑点印迹实验 检测，实验结果表明28-28.5min、28.5-29min、29-29.5min三个分离组分(即方 框内的3～5号峰)免疫反应呈阳性(免疫印迹实验结果图5)，可能含有GnRH 类似物。

表2：RP-HPLC实验参数

2.3蟹脑组织GnRH类似物获得及免疫鉴定

将获得第二次分离中获得28-28.5min、28.5-29min、29-29.5min三个分离组 分浓缩后根据优化实验条件(表3)进行再次RP-HPLC分离(分离谱图如图6， 1-5为主要分离峰)，收集30-45min区间内的分离组分，每30秒收集一管，每管 分离产物浓缩至100微升进行免疫斑点印迹实验，实验结果表明在33-33.5min 及33.5-34min分离组分(图6方框内的分离组分)免疫反应呈阳性，如图7。

表3：RP-HPLC实验参数

2.4中华绒螯蟹GnRH类似类制备及串联质谱鉴定氨基酸结构

根据分级分离实验条件下获得数据，制备GnRH类似物组分，该组分制备 完成后进行RP-HPLC检测(图8)，结果显示为明显单一峰值，没有其他杂峰， 并且保留时间与免疫阳性组分相一致。

2.5中华绒螯蟹GnRH类似物MALDI-TOF/TOF MS测定氨基酸序列及结构验 证

MALDI-TOF/TOF MS测定RP-HPLC分离样品中多肽分子量范围(图9)， 一级质谱检测结果显示分离组分主要由3种小分子多肽组成，分子量分别为： 1356.63Da、1373.63Da、1801Da，选择1356.63Da、1373.63Da两个峰进行串联 质谱检测，通过软件分析获得二级质谱图(图10、图11)后获得氨基酸序列分 别为QAYHFSHGWKP与QSYHFSHGWKP。根据获得氨基酸序列人工合成多肽， RP-HPLC检测(图12)表明获得GnRH类似物与人工合成多肽具有相同保留时 间，说明两者氨基酸结构相一致。

2.6中华绒螯蟹GnRH类似物氨基酸序列比对

将获得到的氨基酸序列与其他物种GnRH类似物相对比，结果如下：

各序列氨基酸差异的对比如图13所示。

结果表明，该类似物具有无脊椎动物GnRH的典型结构，与脊椎动物中类 似物相比在第一位氨基酸后同样多出两个氨基酸(图13，其中黑色和灰色部分 分别表示完全相同和相似的氨基酸残基)。同时，该类似物具有与脊椎动物GnRH 家族相同保守氨基酸位点，其中Q¹、H⁴、F⁵、S⁶、G⁸、P¹¹与脊椎动物GnRH完 全相同。其中一种类型与海蠕虫的氨基酸结构极为相似，仅在第十位氨基酸上有 差别，分别为K¹⁰与F¹⁰。鉴于此，可以判断分离获得的多肽是蟹GnRH类似物。

脊椎动物中GnRH序列中部分氨基酸位点对于多肽活性起到至关重要作用， 现有研究结果表明，Q¹是与GnRH穿过细胞膜的关键因子，该位点的变化直接 影响到肽段的活性，本实验中获得序列均具有该位点。在受体结合位点中H⁴和 G⁸氨基酸作为主要活性基团决定肽段的功能，本实验获得多肽在H⁴、F⁵、S⁶、 G⁸四个位置的氨基酸与脊椎动物相一致，这一结果表明中华绒螯蟹GnRH类似 物很可能具有相似的生理作用，对蟹卵巢发育有调控作用。

实施例2  中华绒螯蟹促性腺释放激素类似物的功能

1第一阶段实验验证GnRH类似物活性

1.1材料与方法

11.1实验材料

中华绒螯蟹购于上海本地养殖场，选取四肢健全、活力较强，体重均一的雌 性性成熟个体养殖于上海海洋大学水产与生命学院养殖中心，采用循环水养殖系 统进行养殖，每个养殖箱(70cm×50cm×40cm)内构建遮蔽物，每日投喂饲料 两次，24小时充氧，定期更换养殖系统中循环水，保持水体清洁。

1.1.2人工合成多肽

委托上海吉尔生化有限公司根据中华绒螯蟹GnRH类似物氨基酸序列人工 合成GnRH，高效液相法测定纯度大于99.5％，质谱测定分子量与理论分子量相 吻合。中华绒螯蟹GnRH类似物-I型氨基酸序列为QAYHFSHGWKP，中华绒 螯蟹GnRH类似物-II型氨基酸序列为QSYHFSHGWKP。

11.3实验第一阶段多肽注射溶液配制

多肽原液：合成多肽使用PBS(氯化钠：8mg/ml，氯化钾：0.2mg/ml，氯化 钾：0.2mg/ml，磷酸氢二钠1.44mg/ml，磷酸氢二钾0.24mg/ml)溶液溶解，配制 浓度为1mg/ml，溶液配制好后-20℃保存。

实验中对原液进行稀释，配制成不同浓度注射液。实验设计为三个浓度： 10ng/g、50ng/g、500ng/g，溶液配制方式见表4。

表4注射用多肽配制表

1.2分组实验

中华绒螯蟹暂养30天后选取个体大小相近，处于同一发育阶段的雌性性成 熟个体进行分组实验。实验分为八组，每个实验组15只中华绒螯蟹，注射剂量 见配制表，实验组于实验第1、10、20天注射多肽，每只动物注射100微升注射 部位为第5步足基节。阴性对照组(PBS组)注射100微升其余步骤同实验组。 空白对照组(不注射任何物质)于实验第一天观察生发泡情况，采用蟹类卵细胞 透明液(甲醛∶无水乙醇∶冰乙酸比例为30∶30∶1)观察卵母细胞成熟度。以生发泡 (细胞核)破裂(GVBD)作为卵母细胞成熟标志，未成熟卵母细胞有明显细胞 核，生发泡未发生破裂(图14a)，成熟卵母细胞生发泡发生破裂(图14b)，观 察不到细胞核。

1.3观察与统计

从实验第15天开始观察实验组、PBS组、空白对照组生发泡情况，每个组 每5天随机取3只个体进行观察，至第30天第一阶段实验结束。实验结束后对 实验组、PBS组、空白对照组中所有个体进行取样观察生发泡破裂情况。实验数 据记录后，采用SPSS Statistics软件分析。

1.4实验结果

实验前检查卵母细胞成熟度，选择生发泡发生偏移个体注射多肽。在整个实 验过程中，空白对照组生化泡位置逐步向边缘迁移，但是并未发生GVBD，该实 验结果反映本实验条件下卵母细胞自然成熟过程，同时表明实验过程中采用的养 殖系统及养殖方式是适宜的。PBS组与GnRH类似物注射实验组相比一共有19 只个体的生发泡发生破裂，其中GnRH类似物-I型的500ng/g实验组与其他实 验组相比效果更明显，GVBD个体占实验组个体比例较高，而PBS组仅有1只 个体生发泡发生破裂，空白对照组中没有个体发生生发泡破裂(图15)，使用 SPSS Statistics软件进行两两比较检验分析，结果表明实验组与空白对照组之间 的GVBD比例具有显著的差异(p＜0.05)，其中GnRH类似物-I型的500ng/g 实验组与对照组之间的GVBD比例具有极显著的差异(p＜0.01)，表明中华绒 螯蟹GnRH类似物可以显著促进卵母细胞最终成熟。

2第二阶段试验进一步验证GnRH类似物活性

第一阶段获得实验数据表明，当注射浓度为500ng/g时获得的效果比明显。 因此在第二阶段实验中对该注射浓度进行进一步验证。同时将两种多肽进行混合 注射，研究两种多肽共同作用下对生发泡的影响。

2.1第二阶段实验多肽注射溶液配制

多肽原液：合成多肽使用PBS溶液溶解，配制浓度为1mg/ml，溶液配制 好后-20℃保存。实验中分为GnRH类似物-I型、GnRH类似物-II型及两种亚 型混合注射组，溶液配制方式见表5。

表5注射用多肽配制表

2.2实验分组

中华绒螯蟹暂养30天后选取个体大小相近，处于同一发育阶段的雌性性成 熟个体进行分组实验。实验分为五组，每个实验组10只中华绒螯蟹，注射剂量 见配制表，实验组于实验第1、10、20天注射多肽，每只动物注射100微升注射 部位为第5步足基节。PBS组注射100微升其余步骤同实验组。

2.3观察与统计

从实验第10天开始观察实验组，PBS组、阴性对照组生发泡情况，每个组 每10天随机取3只个体进行观察，至第30天第二阶段实验结束。实验结束后对 实验组、PBS组、阴性对照组中所有个体进行取样观察生发泡破裂情况。实验数 据记录后，采用SPSS Statistics软件分析。

2.4实验结果

在第二阶段实验中，各个实验组中均有GVBD个体出现，GVBD比例分别 为20％、20％、30％，PBS组与空白对照组均未有GVBD个体出现。空白对照 组在整个实验过程中没有GVBD个体出现。实验数据使用SPSS软件进行两两比 较检验分析，结果表明实验组与PBS组(阴性对照组)、空白对照组之间GVBD 比例存在显著性差异(p＜0.05)(图16)。I+II型混合注射组的GVBD比例高 于其他两个实验组，虽然实验组之间并没有显著性差异，但是I+II型混合注射 组在实验第10天出现首个GVBD个体，其它实验组在第30天实验结束时才有 GVBD个体出现，这个结果进一步证实中华绒螯蟹GnRH类似物可以明显缩短 卵母细胞成熟时间。结合两阶段60天实验结果，我们证实中华绒螯蟹GnRH类 似物可以显著促进GVBD发生(即生发泡破裂)，明显加快卵母细胞成熟。