一种鸟枪打靶式珊瑚人工感染法

技术领域

    本发明涉及一种鸟枪打靶式珊瑚人工感染法。

背景技术

扁枝滨珊瑚（Porites andrewsi Vaughan）等枝状珊瑚为热带海域造礁石珊瑚的主要优势种，这些珊瑚常存在白化等多种疾病。近年来，频繁发生的珊瑚疾病导致了珊瑚礁生态系统严重退化，影响了全球珊瑚礁生态系统的平衡，受到了人们的高度重视，国际上诸多重要学者建议尽快建立能有效确定珊瑚病原的方法。不过，由于珊瑚是一类生活在海洋环境中的开放式低等真核动物，由水螅体与单细胞虫黄藻共生，除了光合作用外，水螅体和虫黄藻都与外界水体进行较直接的物质交换，致使水体中的病原细菌等存在侵染水螅体或虫黄藻的可能。又由于水螅体和虫黄藻都是相对较小的个体，无法实现从其体内直接分离病原，因此，无论是以健康珊瑚组织还是发病珊瑚组织为样品，都是同时分离获得多种不同菌落形态的细菌，难以通过基于库克氏原则的人工感染方法来确定珊瑚疾病的细菌性病原。为此，本发明建立一种相对快速地确定珊瑚病原的鸟枪打靶式人工感染方法, 与传统单一菌株人工感染方法相比，该方法具有操作简单、快速准确等优点，可作为国内外珊瑚疾病细菌病原筛选的首选方法。

发明内容

    本发明的目的是提供一种鸟枪打靶式珊瑚人工感染法。

本发明是为了寻找一种简单、方便、有效的方法来快速准确地确定枝状珊瑚的细菌病原。

首先，将从患病珊瑚分离获得的菌株随机分成若干个试验组，利用这些混合菌液平行组同时对健康珊瑚进行“二步法”海区人工感染；然后，再将诱发健康珊瑚患病的试验组菌株分别对健康珊瑚进行“一步法”室内人工感染；最终，确定诱发健康珊瑚患病的细菌病原，从而实现快速、准确的珊瑚细菌病原分离和鉴定过程。

本发明所采用的技术方案是：

运用鸟枪打靶法确定枝状珊瑚细菌病原所要使用的材料，包括：

（1）实验对象：枝状样品珊瑚。

（2）实验材料：1m长直径为1.0cm的304不锈钢钢钎、直径0.3cm的聚酯绑绳、塑料绑带、研钵、24×20×36cm的无色塑料桶、超净工作台、移液器、tip头、1.5ml Eppendorf管、2ml 冻存管、2216E 海水液体培养基、TCBS固体培养基。

使用上述鸟枪打靶法确定枝状珊瑚细菌病原包括下列步骤：

1、样品采集、处理及病原分离、纯化和扩大培养

在超净工作台中采集发病部位珊瑚组织0.5~1.0g，用研钵将其磨成粉末状，将粉末转入带有1ml灭菌海水的离心管中，用移液器吹打5min，室温静置5 min，吸取100μl上清液涂布于固体2216E海水培养基或TCBS培养基平板。室温培养24~48h，依据菌落形态的不同，挑取平板上多个不同形态的单菌落，分别接种于含1ml的液体2216E海水培养基的冻存管中扩大培养，使菌液浓度达10⁹CFU/ml。

2、菌液分组混合及珊瑚人工感染

（1）随机将所有菌株的菌液分成多组，并按组混合后用于人工感染。

（2）在24×20×36cm的无色中装8~10L过滤和消毒过的海水，同时放入3~5枝细菌来源相同的健康珊瑚，暂养3~5d，健康生长的珊瑚用于后续试验。将每组混合菌液分别加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶对应1组混合菌液，形成若干人工感染试验组；在上述含有健康珊瑚的塑料桶中，加入与菌液等体积的2216E液体培养基，形成对照组；浸泡感染12h。

（3）珊瑚固定装置的构建与海区试验：选取与样品珊瑚生长生境相似的平坦海区，垂直于海流方向固定钢钎，间距为8~12m；以保持珊瑚健康生长环境为原则，在两根钢钎间平行拉上两条聚酯绑绳，确保绑绳的合适离地距离、合适间距，构成珊瑚固定装置。将试验组和对照组珊瑚转移到试验海区，用塑料绑带将所有珊瑚按组别固定于聚酯绑绳上。

3、海区感染珊瑚的观察

在珊瑚转入海区后，每1~2天观察并记录试验结果，观察周期为15~20天；当对照组珊瑚正常生长而某一试验组珊瑚出现与细菌分离样品珊瑚相同病症时，确定引发该流行病的病原菌存在于该试验组菌株中。

4、珊瑚的室内人工感染

将海区试验确定的含有病原菌的试验组中所有菌株分别培养成浓度为10⁹CFU/ml的菌液，取1ml分别加入装有8~10L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中进行浸泡感染；在另一个装有8~10L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中，加入1ml 2216E液体培养基，形成对照组；整个试验过程中只补充因蒸发损失的水份。观察并记录试验组和对照组的珊瑚的生长状况，观察周期15~20d。依据“对照组正常生长而试验组能产生与菌株分离样品相同的病症”的原则，最终确定引发该流行病的病原菌菌株。

本发明的优点：

1、针对珊瑚细菌疾病，本发明首次利用鸟枪打靶式人工感染法实现了病原菌的快速分离与确定。

2、降低了珊瑚细菌性疾病的流行病学调查工作强度。由于珊瑚无法实现从体内直接分离细菌病原，样品中除了病原菌外，还存在大量环境菌株。传统流行病学调查方法是将样品中分离的每株细菌分别进行人工感染试验，费时、费力。而本发明则是以一定基数为单位，将从样本中分离的菌株随机分成若干个组按“二步法”先进行第一次感染，确定某组含有病原菌后，再用“一步法”确定病原菌株，与传统方法相比，大大降低了珊瑚细菌性疾病流行病学调查的工作强度。

具体实施方式

实施例1：

一种鸟枪打靶式珊瑚人工感染法，其特征在于：

确定枝状珊瑚细菌病原包括下列步骤：

A. 样品采集、处理及病原分离、纯化和扩大培养

在超净工作台中采集发病部位珊瑚组织0.5g，用研钵将其磨成粉末状，将粉末转入带有1ml灭菌海水的离心管中，用移液器吹打5min，室温静置5分钟，吸取100μl上清液涂布于固体2216E海水培养基或TCBS培养基平板；室温培养24h，依据菌落形态的不同，挑取平板上多个不同形态的单菌落，分别接种于含1ml的液体2216E海水培养基的冻存管中扩大培养，使菌液浓度达10⁹CFU/ml；

B. 菌液分组混合及珊瑚人工感染

（1）随机将所有菌株的菌液分成多组，并按组混合后用于人工感染；

（2）在24×20×36cm的无色中装8L过滤和消毒的海水，同时放入3枝与细菌来源相同的枝状健康珊瑚，暂养3d，健康生长的珊瑚用于后续试验；将每组混合菌液分别加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶对应1组混合菌液，形成若干试验组；在另一个含有健康珊瑚的塑料桶中，加入与菌液等体积的2216E液体培养基，形成对照组；浸泡感染12h；

（3）珊瑚固定装置的构建与海区试验：选取与样品珊瑚生长生境相似的平坦海区，垂直于海流方向固定钢钎，间距为8m；以保持珊瑚健康生长环境为原则，在两根钢钎间平行拉上两条聚酯绑绳，确保绑绳的合适离地距离、合适间距，构成珊瑚固定装置；将试验组和对照组珊瑚转移到试验海区，用塑料绑带将所有珊瑚按组别固定于聚酯绑绳上；

C. 海区感染珊瑚的观察

在珊瑚转入海区后，每1天观察并记录试验结果，观察周期为15天；当对照组珊瑚正常生长而某一试验组珊瑚出现与细菌分离样品珊瑚相同病症时，确定引发该流行病的病原菌存在于该试验组菌株中；

D. 珊瑚的室内人工感染

将海区试验确定的含有病原菌的试验组中所有菌株分别培养成浓度为10⁹CFU/ml的菌液，取1ml 分别加入装有8L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中进行浸泡感染；在另一个装有8L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中，加入1ml 2216E液体培养基，形成对照组；整个试验过程中只补充因蒸发损失的水份；观察并记录试验组和对照组的珊瑚的生长状况，观察周期15d；依据“对照组正常生长而试验组产生与菌株分离样品相同病症”的原则，最终确定引发该流行病的病原菌菌株。

实施例2：

    一种鸟枪打靶式珊瑚人工感染法，其特征在于：

   确定枝状珊瑚细菌病原包括下列步骤：

A. 样品采集、处理及病原分离、纯化和扩大培养

在超净工作台中采集发病部位珊瑚组织0.7g，用研钵将其磨成粉末状，将粉末转入带有1ml灭菌海水的离心管中，用移液器吹打5min，室温静置5分钟，吸取100μl上清液涂布于固体2216E海水培养基或TCBS培养基平板；室温培养35h，依据菌落形态的不同，挑取平板上多个不同形态的单菌落，分别接种于含1ml的液体2216E海水培养基的冻存管中扩大培养，使菌液浓度达10⁹CFU/ml；

B. 菌液分组混合及珊瑚人工感染

（1）随机将所有菌株的菌液分成多组，并按组混合后用于人工感染；

（2）在24×20×36cm的无色中装9L过滤和消毒的海水，同时放入4枝与细菌来源相同的枝状健康珊瑚，暂养4d，健康生长的珊瑚用于后续试验；将每组混合菌液分别加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶对应1组混合菌液，形成若干试验组；在另一个含有健康珊瑚的塑料桶中，加入与菌液等体积的2216E液体培养基，形成对照组；浸泡感染12h；

（3）珊瑚固定装置的构建与海区试验：选取与样品珊瑚生长生境相似的平坦海区，垂直于海流方向固定钢钎，间距为10m；以保持珊瑚健康生长环境为原则，在两根钢钎间平行拉上两条聚酯绑绳，确保绑绳的合适离地距离、合适间距，构成珊瑚固定装置；将试验组和对照组珊瑚转移到试验海区，用塑料绑带将所有珊瑚按组别固定于聚酯绑绳上；

C. 海区感染珊瑚的观察

在珊瑚转入海区后，每1.5天观察并记录试验结果，观察周期为18天；当对照组珊瑚正常生长而某一试验组珊瑚出现与细菌分离样品珊瑚相同病症时，确定引发该流行病的病原菌存在于该试验组菌株中；

D. 珊瑚的室内人工感染

将海区试验确定的含有病原菌的试验组中所有菌株分别培养成浓度为10⁹CFU/ml的菌液，取1ml 分别加入装有9L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中进行浸泡感染；在另一个装有9L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中，加入1ml 2216E液体培养基，形成对照组；整个试验过程中只补充因蒸发损失的水份；观察并记录试验组和对照组的珊瑚的生长状况，观察周期18d；依据“对照组正常生长而试验组产生与菌株分离样品相同病症”的原则，最终确定引发该流行病的病原菌菌株。

实施例3：

    一种鸟枪打靶式珊瑚人工感染法，其特征在于：

   确定枝状珊瑚细菌病原包括下列步骤：

A. 样品采集、处理及病原分离、纯化和扩大培养

在超净工作台中采集发病部位珊瑚组织1.0g，用研钵将其磨成粉末状，将粉末转入带有1ml灭菌海水的离心管中，用移液器吹打5min，室温静置5分钟，吸取100μl上清液涂布于固体2216E海水培养基或TCBS培养基平板；室温培养48h，依据菌落形态的不同，挑取平板上多个不同形态的单菌落，分别接种于含1ml的液体2216E海水培养基的冻存管中扩大培养，使菌液浓度达10⁹CFU/ml；

B. 菌液分组混合及珊瑚人工感染

（1）随机将所有菌株的菌液分成多组，并按组混合后用于人工感染；

（2）在24×20×36cm的无色中装10L过滤和消毒的海水，同时放入5枝与细菌来源相同的枝状健康珊瑚，暂养5d，健康生长的珊瑚用于后续试验；将每组混合菌液分别加入含有健康珊瑚的塑料桶中，每桶对应1组混合菌液，形成若干试验组；在另一个含有健康珊瑚的塑料桶中，加入与菌液等体积的2216E液体培养基，形成对照组；浸泡感染12h；

（3）珊瑚固定装置的构建与海区试验：选取与样品珊瑚生长生境相似的平坦海区，垂直于海流方向固定钢钎，间距为8~12m；以保持珊瑚健康生长环境为原则，在两根钢钎间平行拉上两条聚酯绑绳，确保绑绳的合适离地距离、合适间距，构成珊瑚固定装置；将试验组和对照组珊瑚转移到试验海区，用塑料绑带将所有珊瑚按组别固定于聚酯绑绳上；

C. 海区感染珊瑚的观察

在珊瑚转入海区后，每2天观察并记录试验结果，观察周期为20天；当对照组珊瑚正常生长而某一试验组珊瑚出现与细菌分离样品珊瑚相同病症时，确定引发该流行病的病原菌存在于该试验组菌株中；

D. 珊瑚的室内人工感染

将海区试验确定的含有病原菌的试验组中所有菌株分别培养成浓度为10⁹CFU/ml的菌液，取1ml 分别加入装有10L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中进行浸泡感染；在另一个装有10L海水和3枝健康珊瑚的无色塑料桶中，加入1ml 2216E液体培养基，形成对照组；整个试验过程中只补充因蒸发损失的水份；观察并记录试验组和对照组的珊瑚的生长状况，观察周期15~20d；依据“对照组正常生长而试验组产生与菌株分离样品相同病症”的原则，最终确定引发该流行病的病原菌菌株。