一种基于脂质聚类分析的可可粉掺假检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法，特别是一种通过构建甘油酯指纹 图谱以判定可可粉是否掺假的方法。

背景技术

天然可可脂(cocoa butter或cacao butter，CB)是可可豆经压榨法制得的具有特殊功能的油 脂，盛产于热带(主要在非洲)，常温下为乳黄色固体，外观类似白蜡，具有芳香气味。可可 粉具有浓烈芬芳的独特香味，含有丰富的多酚、蛋白质、碳水化合物、可可脂等多种营养元 素和活性成分，是制造巧克力的重要原料，也用于生产当今世界三大嗜好性饮料之一。上个 世纪90年代中期以来，随着可可制品应用范围的日趋扩大，对外贸易的拓展，我国可可加工 行业发展迅猛，与此同时，国内市场上大量劣质或假冒可可粉充斥市场，不仅严重危害了食 品安全，也影响了我国的国际贸易信誉和正规可可加工厂家的利益。金永生等对可可粉中掺 入大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳等几种外源植物源性成分的PCR检测方法进行了探索研 究，建立的方法准确性易受杂质影响，不能鉴别可可壳粉这种主要的内源性掺假物；另外， 可能添加的外源植物源性成分种类繁多，难以预料，实际操作中不可能对所有可能添加的外 源植物源性成分逐个进行PCR检测，因此该方法有很大局限性，难以推广。为此，本文尝试 从脂质指纹分析角度建立可可粉掺假检测方法，即用索氏提取法提取11批不同来源的可可粉 样品中的可可脂，通过反相高效液相色谱(HPLC)分离-蒸发光散射检测器(ELSD)检测得到可 可粉的脂质色谱指纹图谱，根据其共有特征峰的相对峰面积，应用系统聚类分析(HCA)法,对 模拟分别掺入板栗壳粉与桂圆壳粉且分别掺入代可可脂和棕榈油的可可粉掺假样品进行脂质 指纹分析。

本发明可为我国可可粉的质量检测方法和质量标准的提升及完善提供科学依据与参考， 从而促进我国可可粉产品的质量提高和稳定，更好地规范可可粉市场，维护消费者权益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确可靠且较简便，可推广应用于可可粉的掺假检 测方法。

本发明的技术方案为：

首先，构建可可粉甘油酯标准指纹图谱，包括可可粉脂质的提取、高效液相色谱的指纹 分析及其标准指纹图谱的确定；

然后，根据可可粉甘油酯组成的测定方法，测定模拟掺假样品的脂质甘油酯组成；

最后，根据可可粉样品和模拟掺假样品脂质甘油酯组分的相对峰面积组成的矩阵，进行 聚类分析。

本发明的具体步骤为：

1、可可粉脂质甘油酯指纹图谱的建立方法包括下列步骤：

（1）可可粉脂质的提取：称取2.50g左右可可粉，置于滤纸筒中，放入索氏抽提器的提 取管中，并在提取瓶中加入2/3左右的石油醚，水浴47℃，6h。取出提取瓶，用旋转蒸发 仪，浓缩至干。然后将提取瓶在105℃干燥2h，取出放置于干燥器内冷却，称重，重复此 操作至恒重。准确称取一定量提取得到的脂质，溶解于三氯甲烷，使其浓度为5mg/mL左右。

（2）高效液相色谱分析：色谱柱：symmetry C18(250mm×4.6mm，5μm)。流动相： A为乙腈/氯仿（70：30），B为乙腈/氯仿（30：70）。二元梯度洗脱程序：0min，100%A；5min， 70%A；25min，0%A；25.1~30min，100%A。柱温：40℃。流速：0.8mL/min。ELSD漂移管 温度：85℃，N2流速：2.5L/min。在此条件下分别进样分析，得到可可粉甘油酯的色谱指纹 图谱。以11号峰为参照，计算样品中各峰的相对保留时间。

（3）标准指纹图谱的建立：通过对11个不同产地的可可粉样品中甘油酯高效液相色谱 图进行比较，确定共有特征峰，并将色谱数据导入指纹图谱专用软件得到由其共有特征峰构 成的可可粉甘油酯的标准色谱指纹图谱。待测样品可与标准指纹图谱对比，区别其异同。

共有特征峰有14个，它们的相对保留时间RT(以11号峰POS为参照)的相对标准偏差 RSD均小于1%；即：

1号峰平均RT为0.411，RSD为0.18%;

2号峰平均RT为0.465，RSD为0%;

3号峰平均RT为0.703，RSD为0.15%;

4号峰平均RT为0.743，RSD为0.22%;

5号峰平均RT为0.786，RSD为0.07%;

6号峰平均RT为0.848，RSD为0.12%;

7号峰平均RT为0.878，RSD为0.02%;

8号峰平均RT为0.899，RSD为0%;

9号峰平均RT为0.944，RSD为0.03%;

10号峰平均RT为0.977，RSD为0.06%;

11号峰平均RT为1.000，RSD为0%;

12号峰平均RT为1.107，RSD为0%;

13号峰平均RT为1.183，RSD为0.34%;

14号峰平均RT为1.215，RSD为0.34%;

其中超过总峰面积3%的指纹峰有3个，分别为:8号峰，相对峰面积10.848%~12.403%;11 号峰，相对峰面积51.518%~53.078%;12号峰，相对峰面积30.463%~32.677%。

2、聚类分析

本发明选择Ward法作为聚类方法、Chebychev距离作为测量距离方法，均值为1作为标 准化处理，进行聚类分析。11号共有指纹峰较稳定，峰面积百分比约50%，且与邻近峰分离 较好，保留时间较居中，因此设定11号峰为参照峰。然后，应用14个共有特征峰的相对峰 面积（以11号峰作为参照峰）组成的矩阵进行聚类分析。

本发明建立了可可粉的脂质甘油酯组成的HPLC指纹图谱，其相似度均在0.995以上。 应用可可粉脂质甘油酯组成的HPLC指纹图谱的14个共有特征峰的相对峰面积组成的矩阵， 以系统类聚法对掺假可可粉进行分析，掺入1.2%（占样品质量的百分含量）及以上代可可脂 或棕榈油的掺假可可粉样品可以予以鉴别。本方法稳定可靠，重复性好，可应用于可可粉的 掺假检测。

附图说明

图1：11个产地可可粉脂质甘油酯组成的HPLC指纹图谱；

各峰保留时间(min)分别为：1号峰—7.291；2号峰—8.245；3号峰—12.469；4号峰 —13.184；5号峰—13.943；6号峰—15.038；7号峰—15.571；8号峰—15.947；9号峰—16.745； 10号峰—17.331；11号峰—17.739；12号峰—19.635；13号峰—20.978；14号峰—21.561。

图2：模拟掺假可可粉样品脂质色谱图；

图3：模拟掺入板栗壳及代可可脂的掺假可可粉样品聚类分析树状图；

图4：模拟掺入桂圆壳及棕榈油的掺假可可粉样品聚类分析树状图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而非对本发明的 限制。

实施例1：掺入板栗壳及代可可脂的可可粉的掺假检测方法研究

1、仪器、样品及试剂

1.1样品

11批不同来源的可可粉样品和掺假脂质代可可脂（BS2000）：均由无锡市产品质量监督 检验所局采集；

模拟掺假材料板栗壳粉：由购自无锡市大润发超市的板栗制得；

1.2试剂

石油醚、三氯甲烷：分析纯，（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈：色谱纯，（国药集团 化学试剂有限公司）；

1.3仪器

高效液相色谱仪（包括G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1379A在线脱气机， G1316A柱温箱，Agilent1100化学工作站）：Agilent1100，美国Agilent公司；

蒸发光散射检测器：Alltech2000，美国Agilent公司；

BUCHI索氏抽提器：B-811，瑞士BUCHI Labortechnik AG有限公司；DLSB-低温冷却液 循环泵：DLSB-5/20，郑州长城科工贸有限公司；

旋转蒸发器：RE52-2，上海沪西分析仪器厂有限公司；

循环水多用真空泵：SHZ-3，上海沪西分析仪器厂有限公司。腈、甲醇均为色谱纯。

2、可可粉脂质的提取

称取2.50g左右可可粉，置于滤纸筒中，放入索氏抽提器的提取管中，并在提取瓶中加 入2/3左右的石油醚，水浴47℃，6h。取出提取瓶，用旋转蒸发仪，浓缩至干。然后将提 取瓶在105℃干燥2h，取出放置于干燥器内冷却，称重，重复此操作至恒重。准确称取一 定量提取得到的脂质，溶解于三氯甲烷，使其浓度为5mg/mL左右。

3、高效液相色谱分析

色谱柱：symmetry C18(250mm×4.6mm，5μm)。流动相：A为乙腈/氯仿（70：30）， B为乙腈/氯仿（30：70）。二元梯度洗脱程序：0min，100%A；5min，70%A；25min，0%A； 25.1~30min，100%A。柱温：40℃。流速：0.8mL/min。ELSD漂移管温度：85℃，N2流速： 2.5L/min。

在此条件下分别进样分析，得到可可粉样品脂质甘油酯组成的指纹谱图，见附图1。以 11号峰为参照，计算样品中各峰的相对保留时间。

4、标准指纹图谱的建立及共有指纹峰特征

通过11个不同产地的可可粉样品中的脂质甘油酯组成的高效液相色谱测定，比较其色谱 图，确定共有特征峰14个，共有峰的相对保留时间RT(以11号峰为参照)的相对标准偏差RSD 均小于1%；其中超过总峰面积3%的指纹峰有3个，分别为:8号峰，相对峰面积 10.848%~12.403%；11号峰，相对峰面积51.518%~53.078%：12号峰，相对峰面积 30.463%~32.677%。

5、聚类分析

系统聚类分析源自分类学，是以样本的相似性为基础的。它的基本思想是将待聚类样本 集的各样本各自看成一类，然后规定或定义样本与样本间的距离或相似性量度以及类与类之 间的距离后进行聚类。聚类开始时，每个样本各自形成一类，类与类之间和样本与样本之间 的距离是相同的，选择距离最小的一对即相似性最大的一对样本合并成一个新类；再计算该 新类和其他所有类间的距离；比较各个距离之后，将距离最小的两类又合并成另一个新类。 直到所有样本集中的样本归为一类为止。整个聚类过程，进行了n（样本数目）-1次的合并 新类的操作，得到n-1个并类距离。这n-1个合并过程也可以用树状图来表示。根据给出的 树状图便可得出样本类别的相关信息。

按照2和3的方法测定掺入板栗壳和代可可脂的可可粉的甘油三酯的组成，并选择Ward 法作为聚类方法、Chebychev距离作为测量距离方法，均值为1作为标准化处理，进行聚类 分析。11号共有指纹峰较稳定，峰面积较大，且与邻近峰分离较好，保留时间较居中，因此 设定11号峰为参照峰。然后，以共有特征峰和非共有峰的相对峰面积（以11号峰POS作为 参照峰）组成的矩阵进行聚类分析。

因板栗壳中基本上不含脂质，故当向S11号可可粉中掺入板栗壳时，则可可粉中的可可 脂含量会降低，为使可可脂含量达标，不法厂家通常同时掺入一定量的代可可脂。因此本实 验模拟制备8个掺加不同量代可可脂的样品（掺加代可可脂后总脂含量均达到10%），见表1 （经测定S11号可可粉中原有总脂含量为9.96%，即近似为10%。）。按照步骤2的方法提取 这些样品中的脂质，并按照步骤3进行HPLC指纹分析（图2a）。根据色谱峰的相对峰面积 组成的矩阵进行聚类分析，由所得的聚类分析树状图(图3)可见：样品A1不能从纯正的可可 粉样品（S1～S11）中区别出来，而A2～A8则均可区分于S1～S11，即掺入1.2%及以上代 可可脂的样品可以予以鉴别。

表1：模拟掺入板栗壳及代可可脂的掺假可可粉组成

6、色谱分析精密度

S11号可可粉经索氏提取的可可脂配置成5mg/mL的样品溶液，连续进样5次，对各共 有峰的相对保留时间（以11号峰的保留时间为参照）和相对峰面积进行统计。结果表明，各 共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD）<2%，表明可可粉脂质的色谱 指纹分析精密度试验符合要求。

7、方法重复性

称取S11号可可粉样品5份，分别按1.2和1.3提取脂质并并进行HPLC分析，分别对共 有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，它们的相对标准偏差（RSD）均小于3%。

8、方法稳定性试验

将S11号可可粉经索氏提取的可可脂配置成5mg/mL的样品溶液，在室温下(18℃左右) 保存，分别于0，5，10，15，20，25h进样分析，对各共有峰的相对保留时间（以11号峰 的保留时间为参照）和相对峰面积进行统计。结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰 面积RSD均小于5%。

以上试验显示，上述指纹图谱测定方法精密、稳定、可靠。

实施例2：掺入桂圆壳及棕榈油的可可粉的掺假检测方法研究

1、仪器、样品及试剂

1.1样品

11批不同来源的可可粉样品和掺假脂质棕榈油样品：均由无锡市产品质量监督检验所局 采集；

模拟掺假材料桂圆壳粉：由购自无锡市大润发超市的桂圆制得；

1.2试剂

石油醚、三氯甲烷：分析纯，（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈：色谱纯，（国药集团 化学试剂有限公司）；

1.3仪器

高效液相色谱仪（包括G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1379A在线脱气机， G1316A柱温箱，Agilent1100化学工作站）：Agilent1100，美国Agilent公司；

蒸发光散射检测器：Alltech2000，美国Agilent公司；

BUCHI索氏抽提器：B-811，瑞士BUCHI Labortechnik AG有限公司；DLSB-低温冷却液 循环泵：DLSB-5/20，郑州长城科工贸有限公司；

旋转蒸发器：RE52-2，上海沪西分析仪器厂有限公司；

循环水多用真空泵：SHZ-3，上海沪西分析仪器厂有限公司。腈、甲醇均为色谱纯。

2、可可粉脂质的提取

称取2.50g左右可可粉，置于滤纸筒中，放入索氏抽提器的提取管中，并在提取瓶中加 入2/3左右的石油醚，水浴47℃，6h。取出提取瓶，用旋转蒸发仪，浓缩至干。然后将提 取瓶在105℃干燥2h，取出放置于干燥器内冷却，称重，重复此操作至恒重。准确称取一 定量提取得到的脂质，溶解于三氯甲烷，使其浓度为5mg/mL左右。

3、高效液相色谱分析

色谱柱：symmetry C18(250mm×4.6mm，5μm)。流动相：A为乙腈/氯仿（70：30）， B为乙腈/氯仿（30：70）。二元梯度洗脱程序：0min，100%A；5min，70%A；25min，0%A； 25.1~30min，100%A。柱温：40℃。流速：0.8mL/min。ELSD漂移管温度：85℃，N2流速： 2.5L/min。

在此条件下分别进样分析，得到可可粉样品脂质甘油酯组成的指纹谱图，见附图1。以 11号峰为参照，计算样品中各峰的相对保留时间。

4、标准指纹图谱的建立及共有指纹峰特征

通过11个不同产地的可可粉样品中的脂质甘油酯组成的高效液相色谱测定，比较其色谱 图，确定共有特征峰14个，共有峰的相对保留时间RT(以11号峰为参照)的相对标准偏差RSD 均小于1%；其中超过总峰面积3%的指纹峰有3个，分别为:8号峰，相对峰面积 10.848%~12.403%;11号峰，相对峰面积51.518%~53.078%;12号峰，相对峰面积 30.463%~32.677%。

5、聚类分析

按照2和3的方法测定掺入桂圆壳和棕榈油的可可粉的甘油三酯的组成，，并选择Ward 法作为聚类方法、Chebychev距离作为测量距离方法，均值为1作为标准化处理，进行聚类 分析。11号共有指纹峰较稳定，峰面积较大，且与邻近峰分离较好，保留时间较居中，因此 设定11号峰为参照峰。然后，以共有特征峰和非共有峰的相对峰面积（以11号峰作为参照 峰）组成的矩阵进行聚类分析。

桂圆壳粉中也基本上不含脂质，同理制得8个掺加桂圆壳粉和不同量代可可脂的样品（掺 加代可可脂后总脂含量也均达到10%），见表2。按照步骤2的方法提取这些样品中的脂质， 并按照步骤3进行HPLC指纹分析（图2b）。根据色谱峰的相对峰面积组成的矩阵进行聚类 分析，由所得的聚类分析树状图(图4)可见：样品B1不能从纯正的可可粉样品（S1～S11） 中区别出来，而B2～B8则均可区分于S1～S11，即对于掺加桂圆壳粉的可可粉样品，当掺 入1.2%及以上代可可脂时即可予以鉴别。

表2：模拟掺入桂圆壳及棕榈油的掺假可可粉组成

6、色谱分析精密度

S11号可可粉经索氏提取的可可脂配制成5mg/mL的样品溶液，连续进样5次，对各共 有峰的相对保留时间（以11号峰的保留时间为参照）和相对峰面积进行统计。结果表明，各 共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD）<2%，表明可可粉脂质的色谱 指纹分析精密度试验符合要求。

7、方法重复性

称取S11号可可粉样品5份，分别按1.2和1.3提取脂质并并进行HPLC分析，分别对共 有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，它们的相对标准偏差（RSD）均小于3%。

8、方法稳定性试验

将S11号可可粉经索氏提取的可可脂配置成5mg/mL的样品溶液，在室温下(18℃左右) 保存，分别于0，5，10，15，20，25h进样分析，对各共有峰的相对保留时间（以11号峰 的保留时间为参照）和相对峰面积进行统计。结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰 面积RSD均小于5%。

以上试验显示，上述指纹图谱测定方法精密、稳定、可靠。