检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒

技术领域

本发明涉及采用基于MGB探针的荧光定量RT-PCR方法检测西部马脑炎病毒的核 苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于TaqMan针对衣壳蛋白编码区的荧光定量RT-PCR 检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒，适用于西部马脑脊髓炎病毒的快速 分子生物学诊断和检测，可用于西部马脑脊髓炎病毒的检测，出入境检疫等，属于动 物检疫领域。

背景技术

西部马脑脊髓炎病毒（western equine encephalomyelitis virus，WEEV）属于 披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Genus Alphavirus）的成员，病毒粒子呈球 形，直径60-65nm。有囊膜，囊膜上有糖蛋白纤突，核衣壳中包裹有单链的基因组 RNA。能感染以马为代表的多种动物宿主，西部马脑炎马对人的致死率为10%左右。我 国于1990年分别从新疆乌苏县的一组赫坎按蚊和博乐县的全沟硬蜱中分离出WEEV。 自然状态下，WEEV在鸟类和蚊子之间交替感染，人和马是该病毒的终末宿主。在马和 人群中呈散发流行。主要发生于仲夏到秋末期间；主要临床症状为发热、厌食和精神 高度沉郁，对于亚临床感染病例，病症相对温和。该病毒也可引起平胸类禽鸟的死亡。

据报道，西方马脑脊髓炎(WEE)在美国西部、加拿大、墨西哥以及中美洲和南美 洲有发生。西方马脑脊髓炎常在广阔地域内发生，如在1000平方英里的范围内都可 见到散发病例。西方马脑脊髓炎(WEE)主要经蚊子传播，偶尔也可经小型野生哺乳 动物传播。美国西海岸温暖潮湿地区常有可传播该病的蚊虫。病毒在蚊虫和野生鸟体 内的相互循环传播导致了该病的持续存在，并呈散发流行。但目前尚未发现由鸟类引 起的人的感染。本病的传播媒介为蚊虫，鸟类仅为贮存宿主。在人发生WEE之前， 一般该地区会有马或野鸟的发病。

本病可引起人和马的发病，人和马是该病毒的终末宿主。病马常呈亚临床感染， 病症相对温和。感染马的致死率低于30％。该病潜伏期5～14天，临床症状包括发热、 厌食和精神高度沉郁。严重时，病马表现为狂躁不安、失明、共济失调、精神极度沉 郁、卧地不起、痉挛，最后可导致死亡。在热带或亚热带炎热潮湿、蚊虫活动猖獗的 夏季，未接种西方马脑脊髓炎的马如果出现特征性的嗜睡症状，可怀疑感染本病，但 确诊需要进行实验室检测。人感染本病毒后，患者表现为高热，头痛，痉挛，呕吐和 嗜睡，有的迅速发展为昏迷状态而死亡。致死率一般为3～4％，明显低于脊髓部马脑 炎病毒感染，儿童和婴儿感染死亡率高于成人。感染儿童中30％可能留有神经后遗症， 如行动迟缓，癫痫和行为紊乱。本病成人感染率为1:1000，1～4岁儿童感染率为 1:58，1岁以下婴儿感染率为1:1。

WEEV为单股正链RNA病毒，全长分别为11.5kb。它们具有甲病毒属特征的4个 保守区，5’端前46nt形成带柄的环状，NSP1编码区内形成带柄环状，由24nt组成 的42S与26S的结合部，位于3’端后和PolyA尾前19nt组成的区域。基因组编码4 种非结构蛋白（NSP1~4）和5种结构蛋白（衣壳蛋白C，包膜糖蛋白E1、E2、E3，6K， 基因排列顺序为5’-C-E3-E2-6K-E1-3’）。

西部马脑脊髓炎为我国一类动物疫病，随着动物国际贸易的日益繁荣，特别是各 大型国际体育赛事的日益频繁，出入境的马匹越来越多，同时由于参赛马匹来自不同 的国家和地区，健康状况参差不齐，疫情非常复杂，这些因素都可能危害我国养马业 的发展和马术运动的正常开展，因此开展西部马脑脊髓炎的检测技术就显得尤为重 要。

目前西部马脑炎主要靠血清学检查（免疫荧光法和ELISA），普通RT-PCR法和流 行病学资料作出诊断，但存在灵敏度低或易于污染的确定，不利于病毒的快速检测。 因此，需要建立更高度敏感、特异和快速的检测方法，用于随时监测该病的流行情况 并加以控制，同时也可应用于马匹等动物的出入境检测，为西部马脑炎的检测提供技 术支持。本研究中基于MGB短探针采用TaqMan荧光RT-PCR  一步法建立了用于 WEEV检测的荧光RT-PCR检测技术，对反应条件进行了优化，使该方法高度敏感、 特异。并通过灵敏度、特异性、重复性试验以及对临床样品的检测，结果进一步证明 了该方法敏感、特异。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测西部马脑脊髓炎病毒 核苷酸序列，包括引物序列和探针序列。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的检测西部马脑脊髓炎病毒的 检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

选择西部马脑脊髓炎病毒特定保守序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上， 进行引物和探针设计。引物长度为23个碱基左右，GC含量为50%-60%，引物内无二 级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于 5℃。探针的长度为18碱基。

一组检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列，如下：

1）5'-CCGMGATCCRAACCCTCCTAG-3'（SEQ ID NO：1）

2）5'-GACCTCCTAAGATCTTCRATTTGAG-3'（SEQ ID NO：2）

3）5’-[FAM]-CCGAAACGGCCTCCAGCG[MGB]-3’（SEQ ID NO：3）

其中R代表A或G；M代表A或C，序列1）和2）分别为检测西部马脑脊髓炎 病毒的正义引物和反义引物，序列3）为检测西部马脑脊髓炎病毒的荧光探针,探针的 5’端标记报告荧光基团FAM（6-carboxy-荧光素），3’端标记淬灭基团MGB。

我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了西部马脑脊髓炎病毒检测方法，对 反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg²⁺使用浓度的优化，引物 探针浓度的优化，得到以下试剂盒。

检测西部马脑脊髓炎病毒检测试剂盒，由以下组分组成：

1）裂解液：购自INVITROGEN公司；

2）RT-PCR反应液，表1为反应液配方；

表1反应液配方

5×RT-缓冲液，25mmol/L MgCl₂购于Promega公司；2.5mM dNTP购自大连宝 生物生物工程有限公司，引物和探针均委托上海基康生物工程有限公司合成，其中5 ×RT-缓冲液组成为375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl₂、50mmol/L DTT、250mmol/L Tris-HCl（pH8.3，25℃）。

3）反转录酶M-MLV，购自Promega公司，200U/μL。

4）RNA酶抑制剂，购自Promega公司，40U/μL。

5）Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司。

6）DEPC水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化， 收取电阻率≥18.0M Ω.cm的水,Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1%，37 ℃搅拌处理12hr，15lbf/in2(1034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

7）阴性对照：西部马脑脊髓炎病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7.2PBS缓 冲盐水制成20％悬液，15lbf/in2(1034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

8）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。回收西部马脑脊髓炎病毒 McMillan株7442-10011nt RT-PCR扩增产物，长度为2569bp，与pMD-T20载体(购 自TAKARA公司)进行连接，转化TOP10感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经 PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pMD-T20-WEEV-7442-10011。以纯化 的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA  Production System-SP6试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的 DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备西部马脑脊髓炎病毒阳性对 照品所需的RNA阳性对照品母液。

西部马脑脊髓炎病毒McMillan株7442-10011nt基因片段如序列表中SEQ ID NO： 4所示。

对合成的引物和探针做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计 测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6－2.0之间，即视为合格引物。对含有10⁴拷贝数 的RNA模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对与探针配合使用，扩增的Ct值相 对较低，且升幅较高。

将筛选好的引物浓度从0.1μmol/L至0.8μmol/L以0.1μmol/L为间距递增，探针浓度 从0.025μmol/L至0.2μmol/L以0.025μmol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了 比较，从多次重复试验中发现：采用表1所列引物浓度和探针浓度时荧光增幅相对较高。

我们针对Roche Light Cycler2.0，Roche480以及ABI 7900HT荧光PCR检测仪，在 42℃/30min，94℃/3min的逆转录后，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度 及时间进行了优化实验。扩增时，采用循环次数分别为40、45和50，比较扩增结果的 Ct值，进而确定扩增的循环次数为40。最终确定采用扩增效果较好的方案为RT-PCR反 应参数：反应条件为42℃/30min，94℃/3min；94℃/15s，56℃/5s，60℃/30s，40个循 环；每次循环的退火延伸时收集荧光。

研究表明，Mg²⁺浓度对荧光PCR扩增结果有一定，故应用筛选好的引物探针，将 Mg²⁺的浓度从0.5mmol/L至5.0mmol/L以0.5mmol/L为间距递增，对不同Mg²⁺浓度条件 下的扩增进行了比较。优化后的Mg²⁺浓度为见表1。

我们选择Promega公司生产的Taq酶，一单位的定义：74℃作用30分钟，能将10nM 的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求：具DNA聚合酶活性及5’→3’ 核酸外切酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃1 小时后仍保持50%活性。从多次重复试验结果中选定1.25U Taq酶作为使用的Taq酶量。

本发明的优点是：本发明选择西部马脑脊髓炎病毒核酸核衣壳蛋白编码基因作为 靶区域，设计引物和探针建立并优化了西部马脑脊髓炎病毒荧光RT-PCR检测方法， 取得了优异的技术效果：

1）快速：该方法对PCR产物进行实时监控，RT-PCR结束即可获得结果。

2）更为灵敏：比常规的PCR方法灵敏度高100倍；对已知拷贝数的体外转录RNA 进行检测。结果显示，灵敏度均可达10拷贝/反应，重复性好。

3）特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法 的特异性高于传统RT-PCR方法；建立的荧光RT-PCR检测方法在检测所收集的其他 病毒以及相关弹状病毒时，结果为阴性，未发现交叉反应。方法研究过程中涉及的病 毒核酸见表2。

表2方法研究中用到的病毒核酸

5）稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；对不同浓度的已知拷 贝数的cRNA进行重复性试验，结果见表3。

表3重复性试验结果

6）不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为西部马脑脊髓炎病毒McMillan株7442-10011nt核酸片段RT-PCR扩增结果。

图2为西部马脑脊髓炎病毒荧光RT-PCR检测方法检测极限测定结果。

图3为西部马脑脊髓炎病毒荧光RT-PCR检测方法的特异性试验结果。

具体实施方式

实施例1、试剂盒的配制和使用

1、试剂盒的配制组成，见表4。

表4试剂盒配制组成

2、试剂盒的使用方法

2.1RNA提取：

取n个1.5ml灭菌离心管（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），作好标 记。首先加入600μL裂解液（裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立 即用大量清水冲洗并擦干），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL（一 份样本换用一个吸头）；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈， 以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。

12,000g离心15min（如有条件，于4℃进行离心）。取与上步中相同数量的1.5ml 灭菌离心管，加入400μL异丙醇（－20℃预冷），作好标记。吸取各管中的上清液相转 移至相应的管中，颠倒混匀。

12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在 吸水纸不同地方沾干）；加入600μL 75%乙醇（－20℃预冷），颠倒洗涤。

12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离 心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干（一份样本换 用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥3min（不宜过于干燥，以免 RNA不溶）。

加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存 备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增）。

2.2扩增试剂准备与配制

从试剂盒中取出RT-PCR反应液、M-MLV、RNA酶抑制剂和Taq酶，在室温下融 化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性 对照），每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液，0.5μL M-MLV，0.25μL RNA 酶抑制剂以及0.25μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混 合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别 加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于800g离心5sec。将PCR管排好放入荧光 PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：反应条件为42℃/30min，94℃/3min；94℃/15s，56℃/5s，60℃/30s， 40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。

2.3结果判定

结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对 照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对 照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如 阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性， 无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无西部马脑脊髓炎病毒；阳性，Ct值≤30.0， 且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在西部马脑脊髓炎病毒。

实施例2、试剂盒的灵敏度试验

1、材料：

方法研究过程中应用到的病毒核酸为本实验室保存的西部马脑脊髓炎病毒 McMillan株核酸。

2、方法

1）将西部马脑脊髓炎病毒McMillan株RNA反转录合成cDNA,应用特异性引物扩 增7442-10011nt 2.5kb的DNA片段,将扩增片段回收后克隆于pMD20-T载体中。将提 纯的质粒用限制性内切酶消化处理,对DNA片段纯化回收，之后将其作为模板按照 Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNAProduction System-SP6试剂盒进行体外 转录。转录产物经无RNase的Dnase(1u/μg样品DNA,Promega)消化除去其中的DNA 模板后,用TRIZOL重新提取RNA，以去除杂蛋白和各种离子。将RNA沉淀溶于1.0mL 的无RNA酶的灭菌水中，分装，20μL/管，冻存于－80℃下，即得到制备好的cRNA片 段。

2）取制备的体外转录RNA用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，测定其A260 吸收值并计算拷贝数。对上述制备的cRNA标准品以10倍梯度稀释后,按最佳条件进行 荧光RT-PCR测定,并用去离子水作为阴性标准。在对不同稀释度标准品的检测中,确 定荧光定量RT-PCR能检出的最低cRNA浓度,并由此得出该方法的检测极限。

3、结果

1）见图1所示，经RT-PCR扩增，获得西部马脑脊髓炎病毒McMillan株约2.5kb 的DNA片段。经体外转录后将获得的cRNA纯品。

2）结果显示，方法的灵敏度均可达10拷贝/反应，检测方法的灵敏度结果见图2。 实施例3、试剂盒的特异性试验

1、材料

表5特异性试验研究过程中应用到的病毒核酸

2、方法

用所建立的西部马脑脊髓炎病毒荧光RT-PCR检测方法对上述病毒核酸进行检 测，以验证方法的特异性。

3、结果

如图3所示，结果表明所建立的方法与其他相关病毒及马病病原无交叉反应，特 异性良好。

实施例4、试剂盒对临床样品检测的实验报告

1、材料

我国进口马血样品共计83份。

2、方法

对83份样品分别用建立的方法和常规RT-PCR方法进行检测比较。在实际样品中 验证方法的敏感性和特异性。

3、结果

检测结果均为阴性，见表6。对83份样品分别用建立的方法和常规RT-PCR方法 进行检测结果显示检测结果全部为阴性，进口马属动物血样中未发现西部马脑脊髓炎 病毒。

表6进口马血样品检测结果

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本 发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本 发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110>  中华人民共和国北京出入境检验检疫局

<120>  检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒

<130> 

<160>  4    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工合成正义引物

<400>  1

ccgmgatccr aaccctccta g                                               21

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工合成反义引物

<400>  2

gacctcctaa gatcttcrat ttgag                                           25

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成荧光探针

<400>  3

ccgaaacggc ctccagcg                                                   18

<210>  4

<211>  2569

<212>  DNA

<213>  西部马脑脊髓炎病毒McMillan株7442-10011nt基因片段

<400>  4

ccctctacgg ctgacctaaa taggtgacgt agtagacacg cacctaccca ccgccaaaat     60

gtttccatac cctcagctga acttcccacc agtttaccct acaaatccga tggcttaccg    120

agatccaaac cctcctaggc gccgctggag gccgtttcgg cccccgctgg ctgctcaaat    180

cgaagatctt aggaggtcga tagccaactt aactttcaaa caacgagcac ctaatccgcc    240

gccaggtcca ccgccaaaga agaagaagag tgctcctgag ccaaaaccta ctcagcctaa    300

aaagaagaag caacaagcca agaagacgaa acgcaagcct aaaccaggga aacgacagcg    360

tatgtgtatg aagttggagt cggacaagac atttccgatc atgctgaacg gccaagtgaa    420

tggatacgct tgcgttgtcg gaggaaggct gatgaaacca ctccacgttg aaggaaaaat    480

cgataatgag caattagcgg ccgtgaaatt gaagaaggct agcatgtacg acctggagta    540

tggcgacgtt ccccagaata tgaaatcaga cacgttgcag tacaccagcg acaaaccacc    600

gggcttctac aactggcacc acggcgcagt ccagtatgag aatgggagat tcaccgtacc    660

gcgaggagtg ggcgggaaag gcgacagtgg aagaccgatc ctggacaaca gaggcagagt    720

tgtggctatt gttctaggag gtgcaaacga gggcacgcgt acggcgcttt cagtggtcac    780

ttggaaccag aaaggggtga ccatcaagga tacccccgaa ggttctgaac cgtggtcact    840

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ctattcactg gcgccagaac gaacactcga cgtgctcgag gagaacgtcg acaatccaaa    960

ttacgacacg ctgctggaga acgtcttgaa atgtccatca cgccggccca aacgaagcat   1020

taccgatgac ttcacactga ccagtcccta cctggggttc tgcccgtatt gcagacactc   1080

agcgccgtgt ttcagcccaa taaaaattga gaacgtgtgg gacgaatctg atgatggatc   1140

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caaattccgt tacatgtctt acgaccacga ccatgacatc aaggaagaca gtatggagaa   1260

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tgccggatac ataaccatgc acaggccagg cccacacgcg tataagtcct atctgaagga   1560

agcgtcaggc gaagtgtaca ttaaaccacc ttctggcaag aacgtcacct acgaatgtaa   1620

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gcatccagtc tacactgtca ttgtgctgtg cggtgtcgct cttgctatcc tggtaggcac   2160

tgcatcgtca gcagcttgta tcgccaaagc aagaagagac tgcctgacgc catacgcgct   2220

tgcaccgaac gcaacggtac ccacagcatt agcagttttg tgctgtattc ggccaaccaa   2280

cgcagaaaca tttggagaaa ctttgaatca tctgtggttt aacaaccaac cgtttctctg   2340

ggcacagttg tgcatccctc tggcagcgct tattattctg ttccgctgct tttcatgctg   2400

catgcctttt ttattggttg caggcgtctg cctggggaag gtagacgcct tcgaacatgc   2460

gaccactgtg ccaaatgttc cggggatccc gtataaggcg ttggtcgaac gtgcaggtta   2520

cgcgccactt aatctggaga ttacggtcgt ctcatcggaa ttaacaccc               2569