蛋白质CTSF在制备诊断胃癌的试剂中的应用及诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物科学领域，更具体地说，涉及一种蛋白质CTSF在制备诊断胃癌疾病的试 剂中的应用及诊断试剂盒。

背景技术

胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤，根据世界卫生组织（WHO）2008年的统计（世界 卫生组织年度统计，2008），在全世界范围，胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年WHO的 统计中显示有接近950,000个新发病例，同时有约700,000人死于这一种疾病。在我国，每 年胃癌新发患者数超过30万，死于胃癌的人数约16万，病死率居恶性肿瘤之首，严重威胁 人民生命健康(陈竺,全国第三次死因回顾抽样调查报告,2008)。为降低死亡率，提高胃癌的 疗效，关键是胃癌的“三早”工作，即早期发现、早期诊断及早期治疗。然而，由于绝大多 数胃癌患者缺乏特异性的临床症状，故早期胃癌诊断率很低，手术率不足10%（吴云林：外 科理论与实践，2005，10:401）；术后病人的生存期也较短。目前，我国胃癌总体5年生存率 为43．4％，术后病理分期(pathological TNM，pTNM)I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的术后5年生存 率分别为75．65％、58．73％、28．01％和8．42％（刘炳亚:中华胃肠外科杂志,2010,13:163）。 因此，提高胃癌的早期诊断率非常重要。而一般体检和影像学检查作用有限，待能够发现和 明确诊断时，往往已到了中、晚期，缺少预警价值。因此，从长远角度看，应致力于发现敏 感性和特异性均较好的肿瘤标志物。此外，胃癌异质性大，预后及对治疗的反应性差别较大， 对于临床评估预后以及对治疗反应性的预测与评价，均需良好的肿瘤标志物。

理想的肿瘤标志物应符合以下条件：（1）敏感性高；（2）特异性高；（3）肿瘤标志物浓 度和肿瘤大小、转移、恶性程度有关，能协助肿瘤分期和判断预后；（4）半衰期短，有效治 疗后浓度很快下降，能较快反映体内肿瘤的实际情况；（5）存在于体液，特别是血液中,易于 检测(刘炳亚:中华胃肠外科杂志,2010,13:163)。

肿瘤血清标志物的研究一直是本领域的研究重点。现已有多种胃癌肿瘤标识物：如癌胚 抗原（CEA），存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中，但对早期胃癌的诊断意义较小，主要用 于胃癌治疗前后的动态观察(Lipkin M:Cancer Research,1988,48:235；Lipkin:JBC  Supplymental,1992,16:1)；CA125、CA19-9、CA50、CA724以及CA242等部分糖抗原在部分 胃癌患者中可升高，但其敏感性仅20～40％（Kodera Y:The American journal of  gastroenterology,1996,91:49；Chou M:Disease Markers,2000,16:105；Lai IR etal: Hepato-gastroenterology,2002,49:115；Edip U et al:Advances in Theray,2008,25:1075）； 还有研究发现肿瘤相关糖蛋白抗原-72（TAG-72）对胃癌的敏感性为69%，特异性为84％（刘 军等：实用医学杂志，1999，15:4）；糖蛋白抗原MG7-Ag在血清中有40％-60％的阳性检出 率，在胃癌组织中有80％-94％的阳性检出率（Ren J:Cancer，2000，88：280）；核小体组 蛋白类抗原(IPO—38)作为胃癌诊断的敏感性为57.4%，特异性超过90%（Hao Y etal:J  Proteome Res,2008，7:3668）以上这些指标均有利于早期胃癌的诊断。某些肿瘤基因，如 DDC、c-myc、c-erb-2、p53以及nm23等对胃癌的发生、转移也有一定意义，但广泛应用于 临床仍受限制（刘倩等，人民卫生出版社，2004）。由于现有的胃癌生物标识物在灵敏度和特 异性上的缺陷，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值， 但目前仍不能用于胃癌的确诊。为了实现对胃癌的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在 分子水平上寻找到更敏感、更特异的胃癌生物标志物。

我们在前期研究中利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了胃癌病人相关 血清101份（胃癌病人37份、高危病人14份、健康人血清50份），在较短时间内比较了患 者和健康人样品中的不同，给出了候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗胃癌。

蛋白质CTSF（Cathepsin F）是组织蛋白酶（Cathepsin）家族的一个成员，组织蛋白酶 是一类在大多数动物组织中都存在的细胞内肽键水解酶。到目前为止，在生物界现已发现20 余种组织蛋白酶，从组织蛋白酶A到组织蛋白酶Z都已有报道。人体中主要存在11种，包括 组织蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X（Turk V etal:EMBO J,2001,20:4629；Turk  V etal：Adixin Enzyme Regul,2002，42：285；Nakanishi H:Aging Res Rev,2003,2:267； Berdowska I，Clin Chim Acta，2004,342:41），它们与人类肿瘤、骨质疏松、关节炎等多种 重大疾病密切相关，是近年来备受关注的一类靶标蛋白酶。组织蛋白酶F是一种溶酶体酸性 蛋白酶，含有484个氨基酸，具有刺激细胞生长，溶解基底膜、细胞外基质及结缔组织的能 力，广泛分布于动物和人体的组织细胞中。近几年来，有关于组织蛋白酶B、D等在消化系统 肿瘤中表达量升高的报道（于波等：中华胃肠外科杂志，2005,8:507；李强等：实用肿瘤学 杂志，2006，20:208；S Dariusz：Hepato-gastroenterology，2008，55:388）。

目前为止，尚未见有关于组织蛋白酶CTSF应用于诊断胃癌的报道。

发明内容

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种蛋白质CTSF在制备诊断胃癌的试 剂中的应用及诊断试剂盒，来定性检测人血清中的抗蛋白质CTSF的IgG抗体的水平，作为辅 助胃癌早期诊断的一种手段，大大提高胃癌早期诊断的敏感性和特异性。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

蛋白质CTSF在制备诊断胃癌的试剂中的应用。

一种制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，该试剂盒采用现在临床广泛使用的ELISA技术， 应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质CTSF的IgG抗体；具体是：用纯化的人蛋白质CTSF 抗原通过包被缓冲液稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；将标准品 与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物 酶（HRP）标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂，形成CTSF-抗体-酶标二抗复合物，经洗 涤液彻底洗涤后加酶底物溶液显色,酶底物溶液反应时间到后加入酸性终止液；所述酶底物 溶液在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，利用颜色的深浅来 检测样品中抗蛋白质CTSF的IgG抗体的水平。

所述纯化的人蛋白质CTSF（带GST标签）是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到， 浓度为50μg/mL。

所述标准品包括0U/mL标准血清1和100U/mL标准血清2，分别为正常人血清以及CTSF 抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。

所述酶标试剂含HRP-二抗0.1-1μg/mL。

所述酶底物溶液包括：显色剂A：500mL溶液中含醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30% 双氧水0.3mL、显色剂B：500mL溶液中含TMB 350mg，DMSO 20mL，柠檬酸·H₂O 5.1g。

所述包被缓冲液为0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1.59g Na₂CO₃，2.93 g NaHCO₃。

所述封闭液为0.5%BSA的0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）溶液，即 1升溶液中含5g牛血清白蛋白（BSA），8g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂0， 0.2g KCl。

所述样品稀释液为0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）。

所述洗涤液为0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，PBST内含0.05%Tween-20， 即1升溶液中含8g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂0，0.2g KCl，0.5mL Tween-20。

所述终止液为2mol/L H₂SO₄溶液。

所述试剂盒中的试剂均可以加入防腐剂，以便于保存。

本发明的有益效果在于：1.提供的血清生物标志物的特异性为92%，敏感性为90%，具 有高特异性和高敏感性的特点。2.提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定 性测定人血清中抗蛋白质CTSF的IgG抗体的水平，有助于辅助早期诊断胃癌。

附图说明

图1是银染鉴定CTSF的表达浓度、纯化状况示意图；

图中：

1表示标准BSA溶液浓度为5μg/mL

2表示标准BSA溶液浓度为10μg/mL

3表示标准BSA溶液浓度为25μg/mL

4表示标准BSA溶液浓度为50μg/mL

5表示标准BSA溶液浓度为100μg/mL

6表示经琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）（国家生化工程技术研究中心）分离纯化后的CTSF 蛋白质样品（含GST标签）。

7表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：170KD，130KD，95KD，72KD， 55KD。

图2是Western-Blotting鉴定CTSF的表达、纯化状况示意图；

图中：

1表示经琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）（国家生化工程技术研究中心）分离纯化后的CTSF 蛋白质样品（含GST标签）。

2表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：130KD，95KD，72KD，55KD。

图3是健康人、高危、胃癌患者血清中抗蛋白质CTSF的IgG抗体的浓度变化。

具体实施方式

本发明结合实施例和附图做进一步的说明。

1.表达、纯化及鉴定CTSF：

蛋白质CTSF是从前期研究中的经过基因工程改造过的酿酒酵母，利用半乳糖诱导过量 表达，琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）分离纯化，并经过Western-Blotting鉴定，分别如图1和 图2所示。为了更清楚的表达，图中采用了带有灰度的背景。

2.血清样品的准备：

全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可立即 检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品 应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有NaN₃，因为NaN₃抑制辣根过氧化物酶（HRP） 的活性。

3.ELISA法各种缓冲液及试剂的配制方法：

（1）包被缓冲液：0.05M pH 9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃

（2）样品稀释液：pH 7.4PBS溶液

（3）洗涤液：pH 7.4的PBST溶液

(4)封闭液：0.5%BSA的pH 7.4PBS溶液

（5）酶底物溶液：显色剂A和显色剂B

(现配现用)

(现配现用)

（6）终止液：2mol/L H₂SO₄溶液

（配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边混匀）

4.ELISA法测定血清中抗蛋白质CTSF的IgG抗体的浓度，以辅助早期诊断胃癌：

具体操作步骤如下：

（1）包被：将纯化的人CTSF蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶 标板中，每孔100μL，37℃包被2小时或4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干；

（2）封闭：加入封闭液200μL，室温保温2小时；洗涤液洗板3次，甩干；

（3）标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品1∶100用样品缓冲液稀释至 100μL，加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡，加样将样品加于梅标板孔底部， 尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板上加盖或覆膜。若待测血清样品较多，建议使用多 管微量加液器加样。标准品及待检测样品临用前15分钟内配制，用完丢弃，下次检测使用新 鲜配制的标准品。

（4）温育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤。

（5）加酶：每孔加辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体100μL，37℃，60 分钟。甩净孔中液体，同上洗板5次拍干。

（6）显色：拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL,再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混 匀，37℃避光显色15分钟。

（7）终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液 的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。

（8）结果判定：

i.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

*A450是450nm处吸光度的缩写。

*目前CTSF抗体尚无国际通行的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。

ii.血清中抗CTSF值的判定

iii.质量控制

每个检测结果必须符合以下标准：

标准血清1的A450：≤0.100

标准血清2的A450：≥0.700

如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。

iv.检验结果的解释

对50例健康人血清、37例胃癌患者血清、14例高危患者血清的ROC分析确立了以上参 考值。

5.特异性和敏感性检测：采用900份胃癌相关患者的血清（胃癌患者300份，高危人群 300份，健康人300份）对本发明进行了特异性和敏感性检测，如图3所示，图中的数值是 健康人、高危、胃癌患者各300份血清样本中的抗蛋白质CTSF的IgG抗体浓度的相对水平。

本发明所提供的辅助早期诊断胃癌的特异性为92%，敏感性为90%，均大大高于现有技术 中胃癌诊断的指标。

以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员 能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。