对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶及其编码基因和应用。

背景技术

植物细胞壁多糖主要包括纤维素和半纤维素，它的来源丰富、可再生，是生产可再生生物燃料的理想原料。将植物细胞壁多糖完全降解为可发酵的简单单糖需要包括纤维素酶和半纤维素酶在内的一系列酶的协同作用。革兰氏阳性菌Caldicellulosiruptor属成员的基因组编码了多个嗜热的、高活性的降解植物细胞壁多糖的糖苷水解酶，在降解植物细胞壁多糖上具有重要的应用价值。

在Caldicellulosiruptor属Caldicellulosiruptorbescii种细菌的基因组中，存在一个基因簇编码三个多结构域糖苷水解酶。这三个蛋白拥有几乎相同的C端序列，包括两个串联的CBM3b和一个极C端的GH48外切葡聚糖酶。三个蛋白的区别主要在于N端：CbCel9A/Cel48A的N端为一个GH9家族蛋白，CbXyn10C/Cel48B的N端为一个GH10家族蛋白，而CbXgl74A/Cel48C的N端为一个GH74家族蛋白。

许多已发现的木聚糖酶均属于CAZy家族(Carbohydrate-Active Enzymes,http://www.cazy.org)的第10和11家族(即GH10和GH11)。GH11家族的酶具有严格的底物特异性，只能水解木聚糖；而与之相反的是，GH10家族的酶则具有较宽泛的底物特异性，有的GH10木聚糖酶除能水解木聚糖外，还能水解番茄碱、大麦木聚糖或人工纤维素底物如对硝基酚-β-纤维二糖(pNPC)或羧甲基纤维素钠(CMC)。

Caldicellulosiruptorbescii菌的CbXyn10C/Cel48B的N端GH10蛋白(CbXyn10C)既能降解具有β-1,4-木糖苷键的木聚糖，又能降解含有β-1,4-葡萄糖苷键的大麦葡聚糖(还含有β-1,3-葡萄糖苷键)和微晶纤维素，因此为一种双功能酶。因为可以同时降解植物细胞壁多糖最重要的两个成分纤维素和木聚糖，因此双功能木聚糖酶/纤维素酶在工业上有重要的应用价值。但和其具有的木聚糖酶活性相比，CbXyn10C的纤维素酶活性相对较低。因此，需要对该酶进行分子工程改造，使其获得更好的针对纤维素的降解能力。

发明内容

本发明的目的是提供对纤维素底物特异性提高的双功能木聚糖酶/纤维素酶突变体。

本发明的再一目的是提供上述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶的编码基因的重组质粒。

本发明的再一目的是提供包含上述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶的编码基因重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种生产上述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶的方法。

本发明的再一目的是提供获得所述双功能木聚糖酶/纤维素酶突变体的方法，是通过设计引物对编码双功能木聚糖酶/纤维素酶的基因野生型(SEQ ID NO.2)进行定点突变后在大肠杆菌中表达制备而得。

根据本发明，所述突变体是在氨基酸序列SEQ ID NO.1所示的双功能木聚糖酶/纤维素酶CbXyn10C野生型的基础上进行突变，将第94位的谷氨酰胺(Q)和第306位的亮氨酸(L)同时点突变为丙氨酸(A)。

所述构建方法为，设计突变引物，以编码双功能木聚糖酶/纤维素酶的基因野生型的质粒pET46-cbXyn10C为模板依次进行两次PCR扩增。纯化得到含有突变密码子的质粒，并将其转化进大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)进行表达，得到重组突变体蛋白。

所述的pET46-cbXyn10C的构建方法为，以Caldicellulosiruptor bescii的基因组DNA为模板，以引物CbXyn10C-F和CbXyn10C-R对cbXyn10C基因进行扩增。电泳纯化PCR产物中的目的条带并按照pET-46Ek/LIC试剂盒说明书将cbXyn10C基因克隆至pET-46得到pET46-cbXyn10C重组质粒。

所述构建pET46-cbXyn10C的引物是：

CbXyn10C-F：5'-GACGACGACAAGATGCCTGACTGGAACATTCCAAGTTTATATG-3'(SEQ NO.3)

CbXyn10C-R：5'-GAGGAGAAGCCCGGTTATGATGTCCCTGATGCTTCTATTACTGC-3'(SEQ NO.4)

所设计的用于定点突变的引物为：

Q94A-F：5'-CTTTAGTGTGGCACAGCGCGACGCCTGATTGG-3'(SEQ NO.5)

Q94A-R：5'-CCAATCAGGCGTCGCGCTGTGCCACACTAAAG-3'(SEQ NO.6)

L306A-F：5'-CCACAGGACGCACTTCAGAAGCAAGC-3'(SEQ NO.7)

L306A-R：5'-TTCTGAAGTGCGTCCTGTGGGGGTG-3'(SEQ NO.8)

将含有突变双功能木聚糖酶/纤维素酶基因的重组菌活化培养后接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基进行预培养，于37℃，250rpm培养6小时；再将预培养细菌转接至含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，仍于37℃，250rpm培养至菌体OD₆₀₀＝0.3，加入IPTG进行诱导，同时将温度调整为25℃，继续培养16h。

所述活化培养是将在甘油中于低温保存的含编码双功能木聚糖酶/纤维素酶突变体的pET46-cbXyn10C的BL21(DE3)划线至含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，培养温度37℃，静置过夜培养。

所述活化培养基组成：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，琼脂粉15g/l，pH7.0；所述预培养和诱导所用的LB培养基为酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，pH7.0。

本发明通过定点突变获得一个对纤维素底物特异性提高的双功能木聚糖酶/纤维素酶突变体。该突变体对纤维素底物的选择特异性，均较野生型有显著提高。以(对纤维素底物CMC的k_cat/K_m)/(对木聚糖底物的k_cat/K_m)作为底物选择性参数，Q94A/L306A突变体较野生型提高了2.76倍；Q94A/L306A降解滤纸的能力较野生型提高了1.15倍。

具体实施方式

实施例1

一、克隆

以Caldicellulosiruptor bescii的基因组DNA为模板，以引物CbXyn10C-F(5'‐GACGACGACAAGATGCCTGACTGGAACATTCCAAGTTTATATG‐3')和CbXyn10C-R

(5'‐GAGGAGAAGCCCGGTTATGATGTCCCTGATGCTTCTATTACTGC‐3')对cbXyn10C基因进行扩增。PCR体系为：

PCR反应条件为：分钟->分钟，分钟，,分钟，35个循环->分钟->结束反应。在1％琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化并按照pET‐46Ek/LIC试剂盒(购自Novagen公司)说明书将cbXyn10C基因克隆至pET‐46得到pET46‐cbXyn10C重组质粒。

二、突变

以pET46-cbXyn10C质粒为模板，以Q94A-F/Q94A-R为引物对进行PCR以获得Q94A突变体质粒。再以含Q94A突变体质粒作为模板，以L306A-F/L306A-R为引物对进行PCR以获得Q94A/L306A突变体质粒。

将PCR产物在1％琼脂糖胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带，纯化并转化至Trans1感受态细胞，在含有100μg/ml的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上筛选获得阳性转化子。挑克隆至3ml含有100μg/ml的氨苄青霉素的液体LB培养基上过夜培养，提取质粒，测序验证获得编码Q94A/L306A的突变pET46-cbXyn10C质粒。

三、转化

将pET46-cbXyn10C野生型质粒和含编码Q94A/L306A的突变的pET46-cbXyn10C质粒分别转化BL21(DE3)感受态细胞(购自北京全式金公司)，在含有100μg/ml的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上筛选获得阳性转化子。

分别挑取5-10个阳性转化子接种至5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养6小时，此为预培养；将此预培养转接至500ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养2-3小时，此OD₆₀₀约为0.3。将500mM IPTG储液加入到此培养物中，使IPTG终浓度达到0.1mM，同时将培养温度降低至25℃，维持摇床的转速不变，继续诱导16小时。

4000g离心15分钟，弃上清并收集细菌。用25ml Tris缓冲液(20mM Tris-HCl,150mMNaCl,pH7.5)重选菌体，用超声波破碎细菌菌体，12000g离心15分钟，上清液中含有重组的CbXyn10C野生型和突变体蛋白。将上清液和1ml Ni-NTA金属螯合层析琼脂混合，4℃轻柔振荡混匀1小时使蛋白结合。4000g离心1分钟，用25ml Tris缓冲液(20mM Tris-HCl,150mMNaCl,pH7.5)洗涤3次含有重组蛋白的Ni-NTA金属螯合层析琼脂，再用含不同浓度(100mM-400mM)咪唑的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,150mMNaCl,pH7.5)将重组蛋白从琼脂上洗脱下来。SDS-PAGE验证蛋白的纯度，合并最纯部分的蛋白，并将重组蛋白对Tris缓冲液(20mM Tris-HCl,150mMNaCl,pH7.5)透析以更换缓冲液。

四、性质检测

1、底物特异性

CbXyn10C对榉木木聚糖底物动力学参数的测定：将10μM CbXyn10C的野生型和Q94A/L306A分别和1–20mg/ml榉木木聚糖混合，在85℃孵育5分钟，用DNS法测定所释放还原糖的浓度。将木聚糖浓度作为横坐标，酶反应速率作为纵坐标，用GraphPad Prism软件计算出野生型、Q94A、L306A和Q94A/L306A的最大酶反应速率(V_max)和K_m。将V_max除以酶的浓度，得到酶的转换常数k_cat(turn over number)。

CbXyn10C对羧甲基纤维素钠(CMC)底物动力学参数的测定：将10μMCbXyn10C的野生型和Q94A/L306A分别和1–20mg/ml CMC混合，在85℃孵育10分钟，用DNS法测定所释放还原糖的浓度。将CMC浓度作为横坐标，酶反应速率作为纵坐标，用GraphPadPrism软件计算出野生型和Q94A/L306A的V_max和K_m。将V_max除以酶的浓度，得到酶的转换常数k_cat。

CbXyn10C的底物选择性：对CbXyn10C的野生型和Q94A/L306A，分别将用CMC作底物时得到的k_cat/K_m除以用榉木木聚糖作底物时得到的k_cat/K_m，得到的数值反映了CbXyn10C对底物的选择性(表1)。

表1.CbXyn10C野生型和Q94A/L306A对纤维素和木聚糖的底物选择性比较

以(对纤维素底物CMC的k_cat/K_m)/(对木聚糖底物的k_cat/K_m)作为底物选择性参数，从表1可看出，Q94A/L306A突变体对纤维素底物的选择性较野生型提高了2.76倍((6.31×10^-3)/(2.39×10^-3)＝2.76倍)。

2、酶活

CbXyn10C对滤纸底物的酶活测定：将CbXyn10C的野生型和Q94A/L306A分别和1cm X 6cm新华一号滤纸在80℃混合孵育90分钟，用DNS法测定释放的还原糖浓度，计算野生型和各突变体对滤纸的特异酶活。

表2.CbXyn10C野生型和Q94A/L306A对滤纸的特异酶活比较

从表2可以看出，Q94A/L306A突变体对微晶纤维素底物的特异酶活较野生型提高了1.15倍((6.15U/μmol enzyme)/(5.36U/μmol enzyme)＝1.15倍)。