棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC-FISH方法

技术领域

本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及棉属AD或ADE背景下同时鉴别各 亚组全套染色体的BAC-FISH方法。

背景技术

荧光原位杂交(FISH)技术能够将DNA序列定位于染色质、染色体或DNA纤维 上，是一种有效而精确的分子细胞遗传学方法。植物基因组测序是进行功能基因组 研究的需要，遗传距离和物理距离之间的分歧，限制了连锁图在指导基因组序列装 配、图位克隆等方面的应用。而细胞遗传学图谱代表的是DNA序列在染色体上的实 际位置，是基因组物理图谱的类型之一，因此也是基因组测序及序列装配的基础。 通过BAC-FISH将DNA克隆直接定位到染色体上是当前构建覆盖整条染色体或整 个基因组的物理图谱主要方法之一。

在植物细胞遗传学定位中应用了多种DNA探针，其中以单拷贝DNA序列筛选 基因组BAC文库，获得的BAC克隆作为原位杂交探针的BAC-FISH技术，由于其 DNA插入片段在100kb以上，用作探针与靶DNA杂交时，增加了与靶序列相遇的 机会，信号强度与检出率大大提高，促进了该技术在植物基因组研究中的应用。

FISH技术的发展，使得越来越多的FISH标记被开发出来，如各种rDAN、染色 体特异BAC克隆等，应用于染色体识别、核型分析、系统进化及亲缘关系分析、异 源染色质鉴定和转基因鉴定、基因定位和物理图谱构建等研究领域。

棉属多倍体属于异源起源，在AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体， 传统细胞学方法是依照核型图像染色体的长短确定，随着FISH技术的逐渐发展，以 其供体gDNA为探针的GISH技术可以实现亚基因组组成的识别。棉属富含酚类、 多糖等高分子次生化合物，对取材、材料存放及提取操作要求严格，因此gDNA提 取与纯化较其它物种复杂很多。尤其是ADE背景的异源多倍体，涉及3个基因组来 源，需要2-3个gDNA双色或多色探针方能实现亚组染色体的识别，工作量、技术 要求、试剂成本相应提高。而BAC-DNA的提取与纯化规避了上述障碍，可以作为 理想的FISH标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种在棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体 的方法。

本发明首先筛选到鉴别棉花AD基因组及A、D亚基因组染色体的FISH探针。 该探针是通过SSR引物Gh216对阿非利加棉BAC文库进行筛选，得到的阳性BAC 克隆。引物序列信息：

Forward Primer:TCCACATTCCCATGCACTACTC

Reverse Primer:CTAAAACCTTATACATACAAAATGCAGC

该引物PCR扩增的片段长度约为90bp，序列为： TCCACATTCCCATGCACTACTCAATTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CTTTCTTGCTGCATTTTGTATGTATAAGGTTTTAG。扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝 胶电泳检测结果如图1所示。

对该BAC克隆进行质粒DNA提取，以BAC-DNA作为探针，对不同棉种体细胞中 期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，结果表明：该探针在5个四倍体棉种的A亚 组全套染色体除两近端部以外的染色体大部分区域有明显信号，在D亚组全套染色体 近中部一小部分有信号；当该探针对陆地棉((AD)₁)与司笃克氏棉(E₁)的6倍体杂种 (AADDEE)根尖制片进行杂交时，清楚地把AADD染色体从6倍体染色体中区分开 来，实现了A、D、E三套亚组染色体的同时鉴别(图2)。

根据本发明的具体实施方式，所述BAC-FISH方法包括以下步骤：

1)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的沙土中，然后 在光照培养箱里28-30℃培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用25ppm放线菌酮 25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗，用卡诺固定液固定24h以上，备用；

2)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗数次，混合酶液(2％纤维素酶+1％ 果胶酶)处理，37℃，45min；

3)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃冷冻4h以上；取出 后，迅速揭掉盖片，80℃烤干，4℃保存备用；

4)标记探针：探针的标记采用Dig-Nick Translation Mix系统标记，首先碱裂解 法提取特异BAC克隆的质粒DNA，参考Roche公司的说明，BAC-DNA 1μg左右，加4 μL Dig-Nick Translation Mix,ddH₂O定容至20μL，混匀，短暂离心。标记程序为15℃ 90min，65℃10min，1％琼脂糖检测探针长度(200-500bp)，-20℃保存备用。

5)荧光原位杂交：参照王春英等(2001)介绍的方法。地高辛标记的探针在荧 光显微镜下观察显示红色；染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色。

6)荧光显微镜观察：用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统 软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。

BAC-FISH技术是一种很好的研究染色体结构和染色体之间进化与亲缘关系的 方法，本发明可以作为种属间基因组水平的遗传标记，这对研究棉花种内或种间的 分化以及棉花基因组进化具有重要作用，同时对于棉花的遗传进化研究和棉花育种 也具有重要意义，本发明也可以用于涉及AD基因组的棉花远缘杂交育种的基因组 检测。

附图说明

图1扩增产物8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，其中，条带显示的即是基于 Gh216-90bp SSR标记筛选阿非利加棉BAC文库得到的能够扩增出目的片段的阳性克 隆57I23；

图2以BAC克隆57I23为探针(红色)，分别在a:陆地棉(AD)₁、b:海岛棉(AD)₂、 c:毛棉(AD)₃、d:黄褐棉(AD)₄、e:达尔文氏棉(AD)₅，f:六倍体杂种(AADDEE)及g: 二倍体A组草棉A₁、h:D组瑟伯氏棉D₁体细胞中期染色体制片进行FISH的结果，以BAC 克隆57I23为探针(红色)，与陆地棉(a)、海岛棉(b)、毛棉(c)、黄褐棉(d)、达尔 文氏棉(e)，六倍体杂种(AADDEE)(f)及二倍体草棉A₁(g)、瑟伯氏棉D₁(h)体细胞中 期染色体进行FISH的杂交图片，染色体为蓝色，BAC克隆57I23为红色信号，Bar＝5 μm。

具体实施方式

实施例1以BAC克隆57I23为探针，分别与棉属两个二倍体、5个四倍体、 一个六倍体杂交种体细胞中期染色体进行杂交。

1材料和方法

1.1实验材料

实验材料草棉、雷蒙德氏棉、陆地棉中棉所-12、海岛棉海-7124、毛棉、黄褐棉、 达尔文氏棉、六倍体杂种(AADDEE)均来自于中国农业科学院棉花研究所；所筛选的 BAC文库为阿非利加棉BAC文库。

实验试剂纤维素酶Onazuka R-10和果胶酶Pectolyase购自Solarbio公司，生物 素探针标记试剂盒购自Roche公司，其他均为国产分析纯试剂。

1.2实验方法

1)BAC文库的筛选：对BAC文库进行一级混合池(板池)构建，以SSR引物 对所有混合池进行菌液PCR，经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，所得阳性混合池进行 行池构建，同样进行菌液PCR、电泳检测，得到阳性行池，接下来对阳性行池进行 单孔菌液PCR、电泳检测，选择含有目的片段(SSR引物Gh216的PCR产物-90bp 片段)的克隆，从而获得BAC克隆57I23。

2)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的沙土中，然后 在光照培养箱里28-30℃培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用25ppm放线菌酮 25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗，用卡诺固定液固定24h以上，备用；

3)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗数次，混合酶液(2％纤维素酶+1％ 果胶酶)处理，37℃，45min；

4)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃冷冻4h以上；-80℃ 取出，迅速揭掉盖片，80℃烤干，4℃保存备用；

5)标记探针：探针的标记采用Dig-Nick Translation Mix系统标记，参考Roche公 司的说明进行标记。标记体系为BAC-DNA 1μg左右，加4μL Dig-Nick Translation  Mix，ddH₂O定容至20μL，混匀，短暂离心。标记程序为15℃90min，65℃10min， 1％琼脂糖检测探针长度(200-500bp)，-20℃保存备用。

6)荧光原位杂交：地高辛标记的探针在荧光显微镜下观察显示红色；染色体用 DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色。

7)荧光显微镜观察：用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统 软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。

2、实验结果

基于基因组原位杂交(GISH)技术对于四倍体棉中A亚组与D亚组染色体的核型 参数的研究，根据13对具GISH信号和13对不具信号染色体相对臂长，推断出13 对较大的染色体，应该是陆地棉A亚组的染色体；染色体较小的13对应该是D亚 组染色体。

如图2所示，实验结果显示，BAC-57I23标记的探针，在5个四倍体中，A亚 组的13对染色体在近端部以外的大部分区域具红色信号，D亚组的13对染色体上 仅在染色体近中部具明显信号(图2，a-e)；六倍体杂种棉的39对条染色体中，其中 26对具红色信号，信号模式与四倍体类似，分别为A、D亚组染色体，无红色信号 的DAPI衬染的蓝色染色体为E亚组染色体(图2，f)；在二倍体A组中13对染色 体大部分区域为信号覆盖(图2g)，D组13对染色体中，只有1对染色体具弱的红色 信号(图2,h)。

由此可见，特异BAC 57I23在棉属AD背景下可以把A、D亚组染色体同时鉴 别出来，而且，在棉属ADE背景下把四倍体来源的染色体(AADD)鉴别出来，实现 A、D、E亚组全套染色体的同时区分。在棉花多倍化过程中，会发生A亚组序列向 D亚组的扩张，或D亚组序列向A亚组的扩张(Luo et al.,2012)，因此会产生D组与 D亚组信号差异。由此进一步说明四倍体中信号覆盖度高的染色体为A亚组染色体。