一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法

技术领域

本发明涉及一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原表征方法，特别涉及牛源性生物骨材料中α-Gal抗原清除率表征方法的建立。

背景技术

牛源性生物骨是由牛骨材料经一系列脱细胞、脱脂、冷冻处理后制成的骨修复材料，它保留了一定量的胶原蛋白成分。牛源性生物骨由于具有来源广泛、易于保存等优点，越来越多的应用于临床骨移植修复手术中，例如：用于骨科、口腔科及整形外科等需要进行的骨缺损及各种凹陷修复等。但作为动物源性组织，牛源生物骨具有较强的抗原性，移植后可能引起宿主产生免疫排斥反应。

α-Gal抗原是存在于牛骨细胞膜上的糖蛋白和糖脂抗原，是和MHC-I/II分子一样存在于异种移植物上的特征性抗原。常用的去除牛骨材料中α-Gal抗原的方法有物理方法，包括低温深冻、反复冻融、锻烧、辐照等，化学方法，包括交联、脱蛋白等或酶处理多种方法联合运用，但不同处理方法都会造成一定量的α-Gal抗原残留。而当人体接受含有一定残留量的α-Gal抗原的牛骨材料时可能发生超急性免疫排斥反应及慢性免疫毒性反应。因此，需要建立特定的方法对牛骨材料中残留α-Gal抗原的含量进行检测和控制。

牛骨材料中α-Gal抗原现存的检测方法有以下几种。

常用的α-Gal抗原检测法主要为用植物凝集素IB4(lectin Bandeiraea simplicifolia IB4)进行免疫组织染色或进行流式分析，该方法虽然操作简便，但在检测α-Gal抗原表位含量较少的细胞组织时，因为植物凝集素IB4与α-Gal抗原表位之间的特异性结合力不足，导致该方法的敏感性较低。M86抗体是可以与天然或合成的糖蛋白和糖脂中含有α-Gal抗原表位(Gal alpha1-3,beta1-4GlcNAc-R)的碳水化合物链结合的特异性单克隆抗体。基于M86抗体的免疫组化方法可以定性检测到α-Gal抗原在牛骨材料中的定位与分布。同时，利用M86抗体与 α-Gal抗原之间反应的特异性，采用ELISA法可以简单、快速检测出牛骨组织中的α-Gal抗原含量，但因为缺乏已知抗原含量的标准品，该方法存在难以准确定量检测出样品中α-Gal抗原的缺点。

近年来，国外很多研究致力建立一种抑制ELISA法，如Galili U等通过利用含已知数量α-Gal抗原的小鼠骨髓瘤细胞和兔血红细胞，通过反向抑制法来计算待测样品中α-Gal抗原含量。该方法同样存在无法准确定量对照品中α-Gal抗原数量等缺点。

在国内外前期研究的基础上，我们通过将牛骨材料样品和过量特异性M86抗体共同孵育。分离剩余的M86抗体并将其与预先包被在固相载体上的过量α-Gal抗原结合，加底物显色。将最终显色结果与未经去α-Gal抗原处理的牛骨材料样品测定结果相比，得到了待测牛骨材料样品中α-Gal抗原的清除率，而用清除率来评价牛骨材料中α-Gal抗原清除过程有效性的方法少见报道。

发明内容

本发明旨在用高效的方法对牛源性生物骨材料进行处理，利用抑制ELISA法测定生物骨材料中α-Gal抗原清除率，并用清除率来评价α-Gal抗原清除过程的有效性。此方法样品制备和处理简单，成本低，可准确判定酶解生物骨材料中α-Gal抗原的清除效果。

本发明的技术方案是：一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法，其特征是，利用高速低温匀质法对经酶解法处理后的牛源性生物骨材料进行研磨处理后加入BSA溶液，得到一定浓度的匀浆液；然后通过抑制ELISA法检测并计算该浓度下牛源性生物骨材料中α-Gal抗原对应M86抗体结合抑制率的IC₅₀值及阳性对照品(未经酶解的牛源性生物骨材料)的IC₅₀(50％结合抑制率对应的浓度)值，得出待测牛源性生物骨材料中α-Gal抗原的清除率，以清除率表征酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原。

本发明的具体步骤如下：

(1)牛源性生物骨材料试验样品的处理

取酶解牛源性生物骨材料样品置于匀质仪器中，在转速6500-8000r/min下，采用液氮冷却研磨至样品粒径为≤90μm，加入1％BSA溶液；取匀浆液进行倍比梯度稀释，至少4个梯 度，备用；取未经酶解的牛源性生物骨材料按同样的方法制成同样浓度的匀浆液，进行同样的倍比梯度稀释后，备用；

优选的样品处理方法：取100mg酶解牛源性生物骨材料样品于Bertin Precellys 24匀质仪器的1.5mL研磨瓶中，加8粒3mm和1粒5mm陶瓷磁珠，转速为6800r/min，30s/次，液氮冷却研磨5次(间隔时间30s)，至样品全部粉碎，置于冰上备用；取试验样品放入离心管中，加入1％BSA溶液；取匀浆液进行倍比梯度稀释，至少4个梯度，分别取40μL备用；

(2)最佳M86抗体稀释度的测定

在预先包被有α-Gal抗原的每个微孔板中分别加入等体积倍比稀释(一般是5-10个稀释度，稀释度在1:25与1:3200之间)的M86抗体溶液，混匀，室温振荡孵育后洗板；加入HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育后洗板；显色后，用酶标仪读取吸光度值，绘制吸光度值与对应M86稀释度的反应曲线，取反应曲线刚进入平台区稀释度的两倍稀释度值作为最佳稀释度。

优选的方法为：在预先包被有α-Gal抗原(100μL/孔)的每个微孔板中分别加入100μL倍比稀释的M86抗体溶液；混匀，室温振荡孵育1.5h，用洗液洗板3次；加入HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育1h后，用洗液洗板3次。显色后，用酶标仪在450nm波长处读取吸光度值，绘制吸光度值与对应M86稀释度的反应曲线，取反应曲线刚进入平台区稀释度的两倍稀释度值作为最佳稀释度。

(3)间接抑制ELISA法检测上清溶液中剩余M86抗体

在每个稀释度的待测样品中分别加入最佳稀释度的M86抗体溶液；混匀，4℃震荡孵育过夜，离心后取上清液备用；在96孔板的相应孔中加入过量的α-Gal抗原溶液，4℃孵育过夜后洗板；分别取已制备的上清液加入相应α-Gal抗原包被的96孔板中，37℃振荡孵育后洗板；加入HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育后洗板；显色后，用酶标仪读取吸光度值，得到各个稀释度下待测样品的吸光度值；用同样的方法得到溶剂对照(不进行倍比稀释)的吸光度值及各个稀释度下的阳性对照的吸光度值；

优选方法：在每个稀释度的待测样品(40μL)中分别加入最佳稀释度的M86抗体溶液 (160μL)；混匀，4℃震荡孵育过夜，10000g离心5min后取上清液备用；在96孔板的相应孔中加入过量的α-Gal抗原溶液，4℃孵育过夜，用洗液洗板3次；分别取已制备的上清液加入相应抗原包被的96孔板中，37℃振荡孵育2h后，用洗液洗板3次；加入HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育1h后，用洗液洗板3次；显色后，用酶标仪在450nm波长处读取吸光度值，得到各个稀释度下待测样品的吸光度值。

(4)数据分析

①根据各个稀释度下待测样品及阳性对照的吸光度值以及溶剂对照的吸光度值，按公式(1)计算各个稀释度下待测样品及阳性对照的M86结合抑制率；

M86结合抑制率，$\%=\frac{a}{b}\times 100\%...\left(1\right)$

式中：

a—待测样品及阳性对照的吸光度OD值；

b—溶剂对照的吸光度的OD值；

②根据各个稀释度下阳性对照的抑制率及其初始浓度，用改良寇式法计算得出阳性对照的IC₅₀；

③根据各个稀释度下待测样品的抑制率及其初始浓度，用改良寇式法计算得出待测样品的IC₅₀，然后按公式(2)计算酶解牛源性生物骨材料中α-Gal抗原的清除率：

α-Gal抗原的清除率，$\%=(1-\frac{x}{y})\times 100\%...\left(2\right)$

式中：

x—待测样品的IC₅₀(50％结合抑制率对应的浓度)；

y—阳性对照的IC₅₀。

本发明的有益效果为：

(1)在牛源性生物骨的样品处理过程中，我们采用高速低温匀质处理法，该方法一方面能使生物骨样品充分研磨粉碎，骨中α-Gal抗原充分暴露，另一方面，选用特定的研磨参数能有效保证暴露的α-Gal抗原被破坏的程度最小。这在一定程度上保证了试验方法的准确性。

(2)试验中采用SP2/0细胞作为试验系统对照品，每个SP2/0细胞上约含10⁶个α-Gal 抗原，用SP2/0对试验体系的合理性进行验证，保证了试验方法体系的可行性。

(3)采用α-Gal抗原标准品测定M86抗体的最佳稀释度，验证M86抗体滴度在不同批次之间的稳定性。有效避免试验中因生物骨中α-Gal抗原浓度太高，M86效价太低难以检测，或抗原包被过量形成多层吸附，在操作过程中脱落而降低试验方法的敏感性和可重复性。

(4)本测定采用间接抑制ELISA法，测定不同浓度牛源性生物骨样品中α-Gal抗原对应M86结合抑制率的IC₅₀值，利用IC₅₀对应的样品浓度计算待测样品中α-Gal抗原的清除率，有效避免了定量检测过程中的试验误差。操作简单，成本低，为准确的，低成本地评价牛源性生物骨中α-Gal抗原的清除效果提供了技术支持。

附图说明

图1为激光衍射粒度分析仪检测研磨(30s/次×5次)后样品状态及粒径分布；

图2不同M86抗体稀释度对应的OD值，其中横坐标为稀释比例，纵坐标为吸光度；

图3为各组样品α-Gal抗原的清除率。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

1、仪器与样品 

1.1仪器：Bertin Precellys 24匀质仪。

1.2样品：未经酶解的生物骨材料(牛骨阳性对照)；酶解生物骨材料(生物骨)；不含α-Gal抗原的羟基磷灰石材料(阴性对照)。

2方法与结果 

在样品前处理和方法的优化中，选取牛源性生物骨为实验样品。

2.1酶解牛源性生物骨材料的制备

在室温下无菌解冻牛骨(5cm×1cm)，将牛骨放入含30％聚乙二醇和400mg/L先锋霉素Ⅴ的重组α-半乳糖苷酶柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，在室温条件下孵育12h。然后用PBS充分冲洗牛骨并将其放入含0.1％戊二醛的PBS中，在4℃条件下浸泡孵育12h。再用PBS充分冲洗牛骨并将其放入含0.1M氨基乙酸的PBS中，在4℃条件下浸泡孵育24h用于封闭剩余戊二醛分子的活性基团。最后将牛骨放入含30％丙二醇和0.1M甘氨酸的PBS中，-80℃保 存，射线灭菌(18kGy)后备用。

2.2样品的前处理优化：影响本方法的关键因素之一是样品处理过程中应确保α-Gal抗原的充分暴露，同时宜避免其被过度破坏。我们采取了低温高速研磨，选用最佳研磨参数来进行样品处理。具体方法：

取100mg样品于Bertin Precellys 24匀质仪器的1.5mL研磨瓶中，加8粒3mm和1粒5mm陶瓷磁珠，转速为6800r/min，30s/次，液氮冷却研磨5次(间隔时间30s)，至样品全部粉碎，置于冰上备用。取适量试验样品，精确称重并记录，放入0.5mL离心管中，加入1％BSA溶液0.1mL。取匀浆液进行倍比梯度稀释，4个梯度(1、1/2、1/4和1/8)。分别取40μL放在0.5mL离心管中备用。

研磨后粒径大小经激光衍射粒度分析仪测试，见图1。同时将M86(稀释度1：200)与不同参数研磨的样品振荡过夜共孵育来验证最佳的研磨参数，见表1。从表1可以看出：研磨5次(间隔时间30s)为最佳的研磨次数；从图1可以看出：采用此最佳研磨参数下的样品粒径为：90％的粒径分布范围为0μm～90μm。

表1不同研磨参数的样品的对应OD值

通过实验验证，发现用实验选用的参数进行样品处理方法可行。不同型号匀质仪可采用该方法进行最佳样品处理条件确认。

2.3最佳M86抗体稀释度的测定

不同批次M86抗体的效价可能有一定的差异，宜确定每批次M86抗体的最佳稀释度。

α-Gal抗原标准品制备：取α-Gal-BSA溶于pH9.6的包被液，加入微孔板中，100μL/孔，4℃条件下包被过夜，用1％BSA封闭后备用。

试验系统对照品小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞制备：采用SP2/0细胞(含约10⁶个α-Gal抗原/细胞)对试验体系的合理性进行验证。SP2/0(CRL-1581^TM)细胞用RPMI1640完全培养基培养至生长状态良好，调整细胞浓度至1×10⁷个细胞/mL备用。

试验方法：在预先包被有α-Gal抗原(100μL/孔)的每个微孔板中分别加入100μL倍比稀释的M86抗体溶液，M86稀释度选用1:12.5、1:25、1:50、1:100、1:200、1：400、1：800、1：1600。混匀，室温振荡孵育1.5h，用洗液洗板3次。加入HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育1h后，用洗液洗板3次。显色后，用酶标仪读取吸光度值，绘制吸光度值与对应M86稀释度的反应曲线，取反应曲线刚进入平台区稀释度的两倍稀释度值作为最佳稀释度。

结果表明： 

首先，我们用一定量α-Gal抗原来确定不同稀释度M86的最佳稀释度，从表2和图2的结果可以看出，随着M86稀释度增加，吸光度值逐渐降低，当M86稀释度为1:100时，反应曲线进入相对平缓期，后续试验M86稀释度以此点作为参照。

表2不同M86抗体稀释度对应的OD值

同时，因为不同稀释度M86对应的吸光度值差异较大，可能原因是α-Gal标准品浓度太低，因而考虑采取提升α-Gal抗原标准品初始浓度，并采取不同浓度α-Gal抗原进行试验。

进一步的试验结果表明，当采用α-Gal抗原标准品初始浓度25μg/mL为最高浓度进行梯度稀释，同时M86稀释度选用1:100、1:200、1：400，α-Gal抗原标准品在三个稀释度下测得的OD值都随着抗原浓度的降低而增加，表现出一定的抑制关系，见表3。同时采用试验体系参照品SP2/0细胞来进一步验证，以确定本体系的可靠性，见表4。

表3不同M86稀释度(1:100、1:200、1：400)，α-Gal标准品的OD值

表4不同M86稀释度(1:100、1:200、1:400)时，SP2/0细胞的OD值

表4数据表明，当M86稀释度选取1:100、1:200、1:400时，SP2/0在细胞浓度逐渐减小的情况下测得的OD值逐渐升高，表现出明显的抑制关系。

进一步计算不同浓度α-Gal标准品的结合抑制率(方法见2.4)，结果见表5。

表5不同M86稀释度(1:100、1:200、1:400)时，α-Gal标准品的结合抑制率

从表5的数据来看，当选用α-Gal抗原标准品最大浓度为25μg/mL进行梯度稀释，α-Gal 抗原标准品的结合率在不同的M86稀释度(1:100、1:200、1:400)时都表现出了明显的抑制关系。

2.4间接抑制ELISA测定M86的结合率

根据实验方法，计算不同组样品的结合抑制率，测定方法为：在每个对照品(经2.2前处理后的牛骨阳性对照和阴性对照，40μL)和初始浓度相同(1.750mg/mL)的各试验管(经2.1-2.2处理后的样品，40μL)中分别加入160μL稀释比例1：200的M86抗体溶液，即每个反应管的总体积为200μL。混匀，4℃震荡孵育过夜，离心管在10000g离心5min后取上清液备用。在96孔板的相应孔中加入过量的α-Gal抗原溶液(2×10^-3mg/mL)，100μL/孔，4℃孵育过夜，用洗液洗板3次。分别取已制备的100μL上清液加入相应抗原包被的96孔板中，37℃振荡孵育2h后，用洗液洗板3次。加入HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育1h后，用洗液洗板3次。显色后，用酶标仪在450nm波长处读取吸光度值。对试验体系对照品和试验样品进行3次重复测定，取3次测定的平均吸光度值，溶剂对照的OD值结果见表6。然后按上述公式(1)计算M86结合抑制率。结合抑制率结果如表7所示。

表6不同M86稀释度(1:100、1:200、1:400)时，溶剂对照的OD值

表7最佳M86稀释度(1:200)时，各组的结合抑制率

2.5试验样品中α-Gal抗原清除率的计算

根据表7的数据，用下述公式(3)所示的改良寇式法计算，得出生物骨1、生物骨2、 羟基磷灰石对照和牛骨阳性对照的IC₅₀，见表8。

lgIC₅₀＝Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm………………………(3)

Xm:lg最大剂量； 

I:lg(最大剂量/相临剂量)；

P:阳性反应率之和；

Pm:最大阳性反应率；

Pn:最小阳性反应率。

表8 50％结合抑制率对应各组样品浓度

根据表8的数据和上述公式(2)计算得出样品组的α-Gal抗原的清除率样品组的α-Gal抗原的清除率，清除率结果如图3所示。