表达和纯化同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种同时缺失外显子3和5 的α突触核蛋白选择性剪切体蛋白在E.coli体内的表达和纯化方法。

背景技术

帕金森氏病是仅次于阿尔茨海默症的第二大常见神经退变性疾病，典型的病理学特征为中脑多巴胺能神经元进行性变性以及路易小体的出现。作为帕金森病发病中具有关键性作用的蛋白--α突触核蛋白（α-syn），其异常聚集体不仅是路易小体的主要成分，而且与神经退变相关的几个细胞进程息息相关。研究证实，由α突触核蛋白基因选择性剪切介导的基因多态性变化在散发性的PD致病中发挥着重要的作用。α突触核蛋白由140个氨基酸构成，在突触前膜广泛表达，基因主要由 6 个外显子组成，起始密码子ATG位于外显子 2内，而终止密码TAA则位于外显子6内。α突触核蛋白存在由外显子3和5选择性剪切导致的四种剪切异构体：全长、缺失外显子3、缺失外显子5和同时缺失外显子3和5。作为α突触核蛋白剪切体家族中的新成员同时缺失外显子3和5 的异构体蛋白，被证实在阿尔茨阿海默症患者和路易体痴呆症患者脑部广泛表达，最新研究证实，在帕金森氏患者的小脑中也存在这种蛋白的过表达现象，同时我们的研究显示，过表达同时缺失外显子3 和5的α突触核蛋白异构体的多巴胺能神经细胞具有明显的细胞毒性及聚集倾向。提示我们，这种蛋白在帕金森氏症发病机制中可能扮演着重要的角色。因此体外获取重组的同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体蛋白，进一步研究其性能，将可为帕金森氏症的致病机制研究提供新的策略。

现有技术中，关于蛋白的纯化方法大致可以总结为以下几种：第一，粗蛋白经过硫酸铵或是盐沉淀后，采用离子交换层析和尺寸排阻色谱联合的方法进行纯化，亲和层析对样品的要求很高，粗蛋白需经过一系列的处理之后才可以上柱，层析的条件需要不断摸索优化，是一个耗时耗资的过程；第二，基于目前已经商业化的IMPACT层析系统，此系统虽然操作简单，但是intein标签的去除易受到目的蛋白序列的影响；第三种，目前常用的融合蛋白构建系统，通过特异性的标签如GST、His tag进行蛋白的识别从而进行纯化，最后特异性位点切割去除标签达到目的蛋白的释放。关于GST融合蛋白的纯化大部分的研究采用Glutathione –Sepharose4B 填料的亲和层析方法进行。此时蛋白表达若为包涵体形式，则后期还需要进行复性过程才能得到具有活性的蛋白成分；若为可溶性表达，则粗蛋中的成分对层析柱填料有一定的损害，同时也会大大降低蛋白的纯度，因此一般要联合离子交换层析的方法对粗样品进行处理后才能上Glutathione -Sepharose4B 亲和层析柱。

总之，综合目前的蛋白纯化方法，现有的纯化方法必须借助昂贵的纯化设备才能进行，同时对样品有严格的要求，纯化的条件也需要进行大量的摸索，存在耗时耗资的弊端，因此需要建立一套高效的表达系统及快捷低成本的纯化方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有的蛋白纯化存在耗时耗资的弊端，提供一种高效快捷的纯化和表达同时缺失外显子3和5 的α突触核蛋白选择性剪切体的方法。

本发明基于纯化方法的考虑，采用高效融合蛋白构建系统PGEX系列中的PGEX-5X-1载体为基本骨架，其在N端表达一个大小为26KD的GST标签蛋白，目的基因插入其多克隆位点下游与其进行融合表达，而且在运载序列后含有特异性蛋白酶切割位点，其表达的融合蛋白可以通过凝血酶，Xa因子等切割后快速释放。同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体大小约为10.8KD ，融合蛋白大小预计36.8KD 。纯化方法区别于传统的Glutathione -Sepharose 4B 亲和层析，采用海狸GST融合蛋白纯化磁珠(BeaverBeads^TMGSH)进行纯化，在不借用任何层析设备的条件下能快速完成蛋白高产量高纯度的纯化工作。

本发明表达和纯化同时缺失外显子3和5 的α突触核蛋白选择性剪切体的方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤：

第一步，设计合适的引物，引入酶切位点SmaⅠ和NotⅠ，通过两步PCR方法，从α突触核蛋白全长基因序列中克隆出缺失外显子3和5 的α突触核蛋白选择性剪切体基因，并通过DNA测序方法确定基因序列的准确性，α突触核蛋白全长基因为420bp，缺失外显子3和5的异构体基因序列全长297bp；

第二步，通过SmaⅠ和NotⅠ限制性内切酶双酶切载体PGEX-5X-1和目的基因后，在T4连接酶作用下，将目的基因克隆入载体PGEX-5X-1中；

第三步，双酶切方法初步筛选出阳性克隆子后进行DNA测序，确定目的基因正确插入载体多克隆位点；鉴定正确的克隆子命名为PGEX-5X-1-α-synδ3δ5；转化E.coli BL21菌株，进行IPGT诱导表达，通过SDS-PAGE电泳分析，相比较空载体转化组（PGEX-5X-1），转化PGEX-5X-1-α-synδ3δ5的菌株在36KD左右处有一特异性条带，说明表达成功，表达成功后对诱导剂的终浓度、诱导温度以及诱导时间进行优化，得出表达的最佳条件为：IPTG终浓度为1Mm、温度37℃、时间3h，使重组融合蛋白GST-α-synδ3δ5得到高效外源表达；

第四步，采用海狸GST融合蛋白纯化磁珠(BeaverBeads^TMGSH)，根据其对GST的特异性识别，从菌体总蛋白中纯化出融合蛋白GST-α-synδ3δ5；并且重复操作四次，发现磁珠特异性好，重复使用效果稳定；

第五步，BAC蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度后，按照每50μg目的蛋白切割需要Xa因子蛋白酶1μL的比例加入蛋白酶，16℃孵育过夜，切割GST标签释放目的蛋白；

第六步，采用海狸GST融合蛋白纯化磁珠(BeaverBeads^TMGSH)去除GST标签蛋白，得到缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体重组蛋白；Western blot 通过特异性一抗anti-alphy synuclein检测重组融合蛋白GST-α-synδ3δ5及同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白异构体蛋白活性，同时anti-β-actin 一抗做阳性对照，结果显示在36KD左右处及11KD左右出检测到了特异性条带，说明同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白剪切体蛋白得到成功表达和纯化。

本发明实现了体外同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体的表达，为体外研究其聚集特性、细胞毒性、迁移特性以及同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体的动物模型建立奠定了基础，为深入探究其与帕金森氏症致病机制相关性研究提供了方法。并且本发明通过纯化方法的选择，建立了一套快速、便宜且易操作的纯化方法。相比较传统方法其最大的特点在于：（1）对不具备任何层析设备的实验室，仍然可以进行蛋白的纯化工作，仅依靠磁性分离架就能完成；（2）对粗蛋白不需要进行复杂的处理就可直接用于纯化；（3）磁珠可以反复使用，平行效果好；（4）操作简单，相比较传统的层析方法2-3d的时间，本方法仅在2h内就可以完成融合蛋白的纯化工作；(5) 高产量，蛋白浓度检测试剂盒分析产量能达到30mg/L。

附图说明

图1为两步PCR方法扩增到的同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体基因，其中：

A为同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体基因琼脂糖电泳图，基因大小为297bp，扩增大小与预计一致；

B为α突触核蛋白基因选择性剪切构成的四种选择性异构体：全长、缺失外显子3、缺失外显子5 和同时缺失外显子3和5。

图2为SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达，其中：

A为相比较PGEX-5X-1，转入PGEX-5X-1-α-synδ3δ5重组载体的BL21菌株，SDS-PAGE分析在大约36左右处有一明显的特异性条带，大小与预计的GST-α-synδ3δ5融合蛋白大小一致，表明表达成功；

B为超声破碎菌体，分离菌体上清液和包涵体分别进行SDS-PAGE电泳分析，显示重组蛋白GST-α-synδ3δ5在菌体上清中，为可溶性表达。

图3为重组蛋白诱导条件优化图，其中：

A表示SDS-PAGE分析诱导剂IPTG的最佳终浓度：0、0.5、1.0、2.0mM；

B表示SDS-PAGE分析诱导的最佳温度：16、30、37℃；

C表示SDS-PAGE分析诱导的最佳时间：1-6h。

图4是 GST融合蛋白磁珠纯化重组蛋白GST-α-synδ3δ5，其中：

A为SDS-PAGE分析GST融合蛋白纯化磁珠纯化的GST-α-synδ3δ5蛋白；

B为SDS-PAGE分析GST融合蛋白纯化磁珠重复纯化GST-α-synδ3δ5蛋白的效果。

图5是Western blot 分析GST-α-synδ3δ5蛋白及去标签的缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体蛋白活性。采用一抗anti-β-actin做阳性对照；一抗anti-alphy synuclein检测重组融合蛋白在36KD左右处有一特异性条带，去标签的蛋白在11KD左右处有一特异条带。

具体实施方式

实施例1：表达和纯化缺失外显子3和5 的α突触核蛋白选择性剪切体的方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤：       

第一步：同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体基因的获取：

扩增引物如下(下划线处表示酶切位点)：

Left F：AACCCGGGTATGGATGTATTCATG ；

EN3A ：GGTCTTCTCAGCCACTACATAGAGAACACC ；

RightEN3B： GGTGTTCTCTATGTAGTGGCTGAGAAGACC ；

EN5：TTTGCGGCCGCGGCTTCAGGTTCGTAGTCTTGATACCCTTCCTTGC

CCAACTGGTCCTT ；

扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min。

第二步，重组载体构建：

按照试剂说明书，分别用SamⅠ和NotⅠ限制性内切酶酶切pGEX-5X-1载体和同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体基因片段，按试剂盒方法回收产物。在T4连接酶的作用下，将目的基因片段克隆至载体pGEX-5X-1中，转化宿主菌DH5α，铺板于终浓度为100μg/ml的LB固体平板上。对阳性克隆子抽提质粒后进行双酶切和DNA测序鉴定，鉴定正确的阳性自命名为PGEX-5X-1-α-synδ3δ5。

第三步，重组蛋白的诱导表达：

将鉴定正确的阳性克隆pGEX-5X-1-α-synδ3δ5转化E.coliBL21菌株后，分别挑取单菌落接种到含有氨苄霉素的5ml LB培养基中，37℃震荡培养过夜；再将菌液按1：50的比例接种到新鲜的100ml 培养基中，继续培养至OD值达到0.8左右，加入终浓度为1mmol/L的IPTG继续培养37℃继续培养6h，如图2A所示，诱导表达后菌体经SDS-PAGE蛋白电泳，相比较空载体对照组，在36KD左右处有一明显的特异性蛋白条带。分离上清和包涵体进行SDS-PAGE蛋白电泳，如图2B所示，重组融合蛋白GST -α-synδ3δ5在菌体上清液中，显示可溶性表达。同时按上述方法采用不同浓终浓度（0、0.5、1.0、2.0mM）的IPTG进行诱导，如图3A所示，得出IPTG的最佳终浓度为1.0 mM。之后在IPTG的终浓度为1.0 mM的条件下，分别在不同的温度（16、30、37℃）条件下进行蛋白诱导，图3B显示证实最佳的诱导温度为37℃。最后在IPTG的终浓度为1.0 mM，37℃条件下连续诱导6h，图3C显示，诱导3小时左右时蛋白表大量达到最大。得出最佳诱导条件为：IPTG1.0 mM，37℃诱导3h。

第四步，重组融合蛋白GST -α-synδ3δ5纯化：

（1）收集的菌体加入15ml buffer A （140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO₄，1.8M KH₂PO₄，pH 7.4)），充分悬浮后，进行超声破碎，频率200HZ工作10s,间隙5s，超声上清液清澈为宜。10000g，4℃离心10分钟，分离上清；

（2）取适量的GST融合蛋白磁珠与上清液蛋白混合，在低温环境进行漩涡震荡1h，磁性分离；

（3）磁珠用bufferA清洗三次后，转移到新的干净的离心管中，加入buffer B（50mMTris-HCl，10mM Glutathione， PH 8.0），低温漩涡震荡10Min。磁性分离，目标蛋白GST-α-synδ3δ5即被洗脱于buffer B中。磁珠可用bufferC和buffer B 交替洗脱后重复使用。纯化结果经SDS-PAGE进行分析，如图4A所示；

（4）重复进行蛋白纯化四次评价磁珠性能，如图4B所示，磁珠重复性能稳定。

第五步，GST标签的去除：

（1）采用10KD（融合蛋白GST -α-synδ3δ5大小为36.8KD ）的milipore超滤管对融合蛋白进行浓缩，4500g浓缩30min，去除buffer B。稀释于适当酶切缓冲液中（50mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM NaCl，5mM CaCl₂）。根据蛋白浓度测定试剂盒得到的蛋白总量，加入相对量的Xa因子蛋白酶，16℃孵育过夜；

（2）采用3KD（目的蛋白缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体大小为10.8KD ）的milipore超滤管进行浓缩，去除酶切缓冲液，加入适当体积的buffer A 进行稀释；

（3）稀释后加人适量的磁珠后，低温环境下漩涡震荡1h，去除体系中的GST标签；

（4）为了最大效果的去除里面的GST蛋白，磁珠可通过buffer B、bufferA清洗后，在重复步骤3，这样可提高目的蛋白的纯度。

第六步，Western blot 检测：

将纯化的重组GST -α-synδ3δ5融合蛋白和缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体蛋白经SDS-PAGE凝胶分离；4℃ 60V恒压转膜2h；用 1% 脱脂奶粉常温封闭1h。分别加入一抗anti-alphy synuclein抗体（ALX-804-656，1:1000；ENZO）和anti-β-actin（SC-47778，1:1000；Santa Cruz），4℃孵育过夜TBST 洗膜 3次，每次 10min；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗(1:5000)，室温孵育2h，洗膜 3次，每次10min。ECL 显色观察结果，结果如图5所示，Western blot在大小约36KD 处和11KD处检测到特异性条带。说明缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体蛋白成功得到体外表达和纯化。