用于定位竹类植物组织内源激素IAA的改良方法

技术领域

本发明涉及一种专门定位竹类植物组织内源激素IAA的方法，具 体涉及一种利用改良免疫金银染色技术来定位植物组织内源激素IAA 的方法，属于免疫细胞化学领域。

背景技术

免疫金银染色法定位植物组织内源激素IAA，是在石蜡切片的基础 上，利用抗原-抗体特异性反应，将带有胶体金颗粒的二抗与已经孵 育好一抗的植物组织切片特异性反应，使胶体金颗粒标记在组织中有 植物内源激素的地方，最后用含有硝酸银的显色液进行显色。显色原 理是硝酸银在还原剂对苯二酚的作用下被还原成银原子，金颗粒能吸 附银原子，使银原子在其周围聚集成团，从而放大金颗粒的示踪效果， 在光学显微镜下就能观察到植物内源激素的位置。

《紫丁香叶柄离区IAA的免疫组织化学定位》(王幼群，植物学报 2001，43(2)：213-216)公开了一种定位植物组织内源激素IAA 的方法，其是在冰冻切片的基础上，用免疫胶体金银法，对紫丁香 叶片脱落过程中IAA在叶柄离区的分布进行定位。具体采用的技术措 施如下：

(1)材料用含4％多聚甲醛和1％戊二醛(用0.2M，PH＝7.2的磷酸 缓冲液PBS配制)的固定液在4℃下固定8h；

(2)材料经磷酸缓冲液充分洗涤，然后在2700-Fregocut冰冻切 片机上切取20μm厚的冰冻切片；

(3)将冰冻切片移到2ml的称量瓶中，对切片先用1ml、0.1％的 胰蛋白酶溶液于37℃处理5min，然后用0.1％的PBST(0.05mol/L磷 酸缓冲液(pH 7.4)+0.15mol/L NaCl+0.1％Triton X-100)冲洗 三次，每次5min，接下来用PBSTG(1:50正常羊血清/PBST)于37℃ 封闭15-20min，封闭结束后不清洗；

(4)向切片中加入1:500一抗/PBSTG，4℃孵育过夜；

(5)用PBSTG冲洗切片后加入1:50金标二抗/PBSTG，4℃孵育过 夜；

(6)用0.1％的PBST和重蒸水冲洗切片，然后将切片移入干净的 小烧杯中，在银显影液(100ml显影液含有对苯二酚1.7g，10％的硝 酸银溶液1ml，PH3.5，0.1M的柠檬酸缓冲液99ml)中黑暗条件下显 影5min；

(7)用自来水冲洗后将切片置于载玻片上，在光学显微镜下观察、 照相。

目前有关竹类植物竹笋内源激素金银法免疫定位尚没有相关报 道。该论文运用了冰冻切片，虽然缩短了制片时间，较好的保持了 抗原的活性，但对实验仪器的配置与操作要求相对较高。同时，冰冻 切片易造成细胞的内膜系统破坏，结构不清晰。且不是每个实验室均 有冰冻切片机，另外竹笋尤其节间停止生长的竹笋非常硬，冰冻切片 机根本切不动。

另外，由于该论文没有EDAC前固定，在一抗孵育之前的实验过程 中，组织细胞中的内源激素容易流失，对实验结果造成不利影响。并 且，该实验的一抗孵育和二抗孵育均在4℃，冰箱中过夜，使整个实 验周期延长至3天，耗时较长。

此外，该实验显色液没有说明溶剂成分，如果用纯水，则显色反 应会非常迅速，使显色时间不容易把握。

最重要的是，试验采用PBS作为缓冲液以及溶剂，然而PBS易与常 见的钙离子、镁离子等金属离子缔合形成沉淀，从而干扰显色效果。

《杨树试管苗嫩茎生根过程中内源IAA的免疫金银定位》(董宁光， 尹伟伦，等，植物学报2011,46(3)：324-330)公开了另一种定位 植物组织内源激素IAA的方法，其在石蜡切片的基础上运用免疫胶体 金银法对杨树生根过程中，内源生长素IAA的分布进行了定位。具体 采用的技术措施如下：

(1)材料用2％EDAC在室温下抽气固定24小时；

(2)经0.2mol/l二甲砷酸钠缓冲液(PH7.2)冲洗后，转入4％多 聚甲醛+1％戊二醛中，室温下抽气固定24小时，4℃保存7-8小时；

(3)用0.2mol/l二甲砷酸钠缓冲液(PH7.2)将固定好的材料冲洗 18-24小时；

(4)系列酒精脱水、石蜡包埋、切片；

(5)0.1％的胰蛋白酶溶液于37℃处理5分钟；

(6)用3mol/L尿素消化20分钟含2.5％BSA的 TBST(0.05mol/lTris-HCI+0.15mol/lNaCI+0.3％Triton X-100，PH7.6) 洗涤3次，每次5分钟；

(7)用TBSTG(TBST+10％正常羊血清+2.5％BSA)37℃封闭1小时；

(8)加入经TBSTG稀释400倍的一抗，37℃静置温育24小时；

(9)TBST(含2.5％BSA)洗涤3次，每次5分钟；

(10)加入经TBST(含2.5％BSA)洗涤3次，每次5分钟TBSTG稀释 50倍的金标二抗，37℃静置温育30分钟；

(11)蒸馏水冲洗3次，每次10分钟；

(12)硝酸银显影剂(0.1mol/L柠檬酸缓冲液+2％明胶+1g/LAgN03， 17g/L对苯二酚，PH3.5)在25℃下避光显色10-15分钟；

(13)自来水冲洗以终止反应，显微镜下观察并拍照。

该论文虽然也在石蜡切片的基础上进行免疫定位，但实验过程非 常复杂，操作繁琐。该实验虽然在抗原恢复、一抗二抗孵育以及尿素 消解过程中均采用了37℃反应环境以缩短反应时间，但由于操作步 骤多，涉及药品多，容易造成切片背景污染，且对实验人员的操作技 能要求较高。

并且，在材料固定过程中，该实验采用了二甲胂酸钠缓冲液作为 洗剂，而二甲胂酸钠为易制毒药品，对操作人员危害较大，且价格昂 贵。

另外，该论文显影液中含有2％的明胶，而在竹类植物竹笋内源激 素金银法免疫定位显影过程中，含2％明胶的显影液无法正常显色， 且背景非特异性显色严重。

发明内容

为解决现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种条件温 和、反应时间短、准确度高、重复率好的改良方法，该改良方法用于 定位竹类植物组织内源激素IAA。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种用于定位竹类植物组织内源激素IAA的改良方法，其特征在 于，包括以下步骤：

(1)样品固定：首先将竹笋或节间停止生长的竹杆放入前固定液 中，4℃抽气4h，前述前固定液为2％EDAC，然后移除前固定液，将后 固定液浸没样品，4℃抽气过夜，前述后固定液为含有4％多聚甲醛和 0.5％戊二醛、浓度为0.025mol/L、PH＝7.2的PBS；

(2)包埋、切片：将固定好的样品用TBS冲洗3次，每次10min， 前述TBS为含有0.15mol/L NaCl、浓度为0.05mol/L、PH＝7.2的 Tris-HCl缓冲液，之后系列脱水剂脱水、浸蜡、包埋样品，然后将包 埋好的样品切片，并将切片粘在载玻片上于40℃展片台上展片，常 温晾干；

(3)脱蜡复水：采用常规的方法对晾干的切片进行脱蜡复水，然 后用TBST①浸洗3次，每次5min，前述TBST①为含有0.3％Triton X-100的TBS；

(4)封闭：将玻片上材料周围的TBST①吸干，每片玻片加200μl 封闭液，室温封闭45min，前述封闭液为含有5％BSA和1.5％甘氨酸 的TBST①；

(5)一抗孵育：倾去玻片上的封闭液，吸干材料周围的封闭液， 加入一抗孵育液，每片100μl，4℃孵育过夜，前述一抗孵育液为兔 抗IAA抗体：封闭液＝1：70；

(6)一抗清洗：倾去玻片上的一抗孵育液，先用TBST①冲洗玻 片5次，每次5min，再用TBST②浸洗玻片5次，每次5mim，前述TBST ②为含有0.1％Tween-20的TBS；

(7)二次封闭：吸干材料周围的液体，加封闭液，每片200μl， 在保湿培养皿内室温孵育15min，前述封闭液为含有5％BSA和1.5％ 甘氨酸的TBST①；

(8)二抗孵育：倾去封闭液，吸干材料周围液体，加入二抗孵育 液，每片100μl，放于保湿培养皿内室温孵育6h，前述二抗孵育液为 金标羊抗兔抗体：封闭液＝1:40；

(9)二抗清洗：先用TBST②冲洗载玻片5次，每次5min，再用 TBST②浸洗5次，每次5min，最后超纯水浸洗10min；

(10)显色：将玻片垂直浸入显色液中，避光显色15min，前述 显色液由1.7g对苯二酚、0.05g硝酸银、2.55g柠檬酸、2.35g柠檬 酸钠与60ml明胶溶液混合、并用超纯水定容至100ml得到，在前述 明胶溶液中明胶的含量为0.5％，显好色的玻片迅速浸入超纯水中停 止显色；

(11)脱水、封片：将玻片按照与脱蜡复水相反的顺序和时间依 次脱水，然后用树脂封片，铅块压片至树脂凝固；

(12)光学显微镜观察、拍照。

前述的用于定位竹类植物组织内源激素IAA的改良方法，其特征 在于，在步骤(1)中，将竹笋或节间停止生长的竹杆切成大小为0.5cm ×0.5cm×0.3cm的组织块作为样品使用。

前述的用于定位竹类植物组织内源激素IAA的改良方法，其特征 在于，在步骤(2)中，前述切片的厚度为7μm。

前述的用于定位竹类植物组织内源激素IAA的改良方法，其特征 在于，在步骤(4)中，封闭时前述玻片放置在垫有湿润滤纸的培养 皿中。

本发明的有利之处在于：

1、本发明的方法改良了目前已有的免疫金银染色方法，精简了实 验步骤，优化了显色液的配方，不仅明显降低了切片的背景干扰(即 一些非特异性显色干扰降低)，而且得到了很好的重复率；

2、一抗孵育后采用TBST①与TBST②配合洗片，既增加了细胞膜 通透性使抗体容易进入细胞，又可以加强抗体的特异性，使反应更精 确；

3、竹笋及节间停止生长的竹杆较硬，不适合冰冻切片，且冰冻切 片常常造成植物细胞结构及内膜系统的破坏，而石蜡切片植物组织细 胞的结构精细清楚，另外并不是每个实验室均配置了冰冻切片机；

4、二抗在室温下孵育，缩短了反应时间(实验时间缩短为两天)， 实验证明：二抗在室温孵育6h与二抗在4℃下孵育过夜一样可以得 到很好的效果；

5、用TBS替代PBS作为实验中缓冲液以及溶剂，TBS不会与钙离 子等产生沉淀，且对生物反应的干扰极低，虽然TBS较PBS于温度的 影响较大，但在整个实验过程中不存在剧烈的温度变化，其PH值的 变化对实验的影响较小；

6、在显色液中加入了适量的明胶，将显色时间基本控制在了 15-20min，显色期间有足够的时间检查显色程度，显色时间又不至于 过长。

附图说明

图1是经过本发明的方法处理后，10倍物镜下竹笋维管束内源生 长素定位效果图；

图2是经过本发明的方法处理后，20倍物镜下竹笋维管束内源生 长素定位效果图；

图3是经过本发明的方法处理后，40倍物镜下竹笋维管束内源生 长素定位效果图；

图4是经过本发明的方法处理后，100倍物镜下竹笋维管束内源 生长素定位效果图；

图5是未加一抗的空白对照图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、实验样品

云南箭竹竹笋，具体取刚出土一周左右(竹笋第一节还未停止伸 长)笋的第1、3、5节及顶端，第一节停止伸长笋的第1节，以及出 土一个月笋的第1节作为本实验各不同发育阶段试验样品。

二、实验药品及配方

1、前固定液(2％EDAC，溶剂为超纯水)

2、后固定液(含有4％多聚甲醛和0.5％戊二醛、浓度为0.025mol/L、 PH＝7.2的PBS；后固定液中不含二甲胂酸钠，避免了二甲胂酸钠对 操作人员的危害，同时降低了成本)

3、TBS(含有0.15mol/L NaCl、浓度为0.05mol/L、PH＝7.2的Tris-HCl 缓冲液)

4、TBST①(含有0.3％Triton X-100的TBS)

5、TBST②(含有0.1％Tween-20的TBS)

6、封闭液(含有5％BSA和1.5％甘氨酸的TBST①)

7、一抗孵育液(兔抗IAA抗体：封闭液＝1：70)

8、二抗孵育液(金标羊抗兔抗体：封闭液＝1:40)

9、显色液(由1.7g对苯二酚、0.05g硝酸银、2.55g柠檬酸、2.35g 柠檬酸钠与60ml明胶溶液(明胶的含量为0.5％)混合、并用超纯水 定容至100ml得到)

三、方法步骤

1、样品采集、固定

取新鲜云南箭竹竹笋以及竹笋停止生长的第一节(硬度较大)， 将选定部位快速切割为0.5cm×0.5cm×0.3cm大小的组织块，放入前 固定液中，4℃抽气4h。

移除前固定液，将后固定液浸没样品，4℃抽气过夜。

2、包埋、切片

将固定好的样品用TBS冲洗3次，每次10min。之后系列脱水剂 脱水、浸蜡、包埋样品。

用LEICA RM2165切片机，将包埋好的材料切成7μm厚的片，用 粘片剂将切片粘在干净的载玻片上，40℃展片台上展片5min，常温 晾干。

3、脱蜡复水

采用常规的方法对晾干的切片进行脱蜡复水，然后用TBST①浸洗 3次，每次5min。

由于TBST①中含有TritonX-100，T ritonX-100能增大细胞膜通透 性，让抗体大分子更容易进入细胞，所以用TBST①浸洗样品能够使 一抗孵育更有效。

4、封闭

将玻片上材料周围的TBST①用滤纸吸干，每片玻片加200μl封闭 液，将玻片放入垫有湿润滤纸的培养皿中，湿润滤纸用于保湿，防止 切片在孵育期间一抗蒸发干掉，调平培养皿，防止玻片上的封闭液向 一则聚集。室温(25℃左右)封闭45min。

5、一抗孵育

倾去玻片上的封闭液，滤纸吸干材料周围的封闭液，加入一抗孵 育液，每片100μl。

玻片移入垫有湿润滤纸的培养皿，加盖。将培养皿移入4℃冰箱， 孵育过夜(12h)。

6、一抗清洗

倾去玻片上的一抗稀释液，先用TBST①冲洗玻片5次，每次5min。 冲洗时，用移液枪将TBST①轻轻加到载玻片一端(不能直接对着材料 冲洗，否则会冲掉材料)，再将载玻片向另一端倾斜使TBST①缓慢流 过材料，带走材料上多余的一抗，这样能有效清洗且不会损失材料。 然后用TBST②浸洗玻片5次，每次5mim。

由于TBST②中含有Tween-20，Tween-20能增强一抗与二抗结合 的特异性，所以用TBST②浸洗样品能够使免疫反应更精确。

TBST①与TBST②两种洗液配合洗片，既可以使洗片充分，避免 假阳性的产生，又能在增加细胞膜通透性基础上，增强抗原-抗体的 特异性吸附，使免疫反应更精确。

7、二次封闭

用滤纸吸干材料周围的液体，加封闭液，每片200μl，在保湿培养 皿内室温孵育15min。

8、二抗孵育

倾去封闭液，滤纸吸干材料周围液体，加入二抗孵育液，每片 100μl。放于保湿培养皿内室温孵育6h。

9、二抗清洗

先用移液枪吸取TBST②冲洗载玻片5次，每次5min，冲洗方法与 一抗冲洗方法相同；再用移液枪吸取TBST②浸洗5次，每次5min， 最后超纯水浸洗10min，用于减轻背景干扰。若清洗不够，容易导致 较多假阳性。

10、显色

将玻片垂直浸入显色液中，避免银原子因重力聚集，干扰显色。 避光显色15min。期间可监测显色程度，控制显色时间。显好色的玻 片迅速浸入超纯水中停止显色。

显色液中明胶的浓度不宜太高，明胶浓度太高不仅会导致背景很 脏，甚至会显不了色。

11、脱水、封片

将玻片按照与脱蜡复水相反的顺序和时间依次脱水，用树脂封片， 铅块压片至树脂凝固。

12、光学显微镜观察、拍照。

为监测二抗体的特异性，设置不加一抗的空白对照组。用封闭液 代替一抗孵育液。

图1至图4是经过本发明的方法处理后，不同倍数的物镜下竹笋 维管束内源生长素定位效果图，图片不仅背景干净，而且标记清晰。

图5是未加一抗的空白对照图。非特异显色极弱。

由此可见，本发明的方法建立了一套适合竹类植物内源激素免疫 定位的技术操作体系。

四、对比试验

我们有针对性的做了一系列的对比试验，用以证明本发明的方法 具有显著的进步，例如：

对比试验1：缓冲液以及溶剂对试验结果的影响

实验组用TBS作为缓冲液和溶剂，对照组用PBS作为缓冲液和溶 剂，其他条件与上述具体实施例给出的条件完全相同。

对比结果：实验组的背景干扰更少。

分析：用TBS作缓冲液和溶剂，TBS不会与钙离子等产生沉淀， 且TBS对生物反应的干扰极低，因此实验组的背景干扰更少，即一些 非特异性显色干扰降低，背景干扰减少有利于提高定位结果的准确 性。

对比试验2：显色液对试验结果的影响

实验组的显色液中含有明胶(所用的明胶溶液中明胶的含量为 0.5％)，对照组①的显色液中不含有明胶，对照组②的显色液中含有 明胶(所用的明胶溶液中明胶的含量为1.0％)，对照组③的显色液 中含有明胶(所用的明胶溶液中明胶的含量为2.0％)，其他条件与 上述具体实施例给出的条件完全相同。

对比结果：实验组的显色时间基本控制在了15-20min，切片显色 清晰，背景干净。对照组①反应剧烈，很难控制显色程度，对照组② 放置过夜也无法显色，对照组③2h后才有显著颜色反应，且切片背 景脏，干扰大。。

分析：向显色液中添加明胶溶液(在明胶溶液中明胶的含量为 0.5％)，可以适当延长显色时间，这样一来显色期间有足够的时间检 查显色程度，提高了显色的可控性，因此定位IAA可以获得很好的 重复率。但明胶浓度过高，可能阻碍了银颗粒的聚集，导致无法显色 或者显色缓慢，并且增加了非特异性物质的干扰机会。

对比试验3：二抗孵育温度对试验结果的影响

实验组将二抗在室温孵育6h，对照组①将二抗在4℃下孵育过夜， 对照组②在37℃下孵育0.5h。其他条件与上述具体实施例给出的条 件完全相同。

对比结果：实验组与对照组①效果相当。对照组②显色较弱，且 切片模糊不清。

分析：适当提高二抗孵育温度不会对结果产生不利影响，反而可 以缩短反应时间；TBS受温度的影响较大，但二抗在室温下孵育，整 个实验过程中不存在剧烈的温度变化，所以TBS受温度的影响较小， 进一步保证了测定结果的准确性。37℃可能导致TBS的PH值发生较 大变化进而影响免疫反应进行，也可能使激素分解影响了免疫反应的 进行。

由此可见，本发明的方法通过精简实验步骤、优化反应条件和显 色液的配方，不仅使得背景干扰明显降低，更好的呈现了实验效果、 提高了定位的准确度，而且使显色过程更容易把握，从而获得了较 好的重复率，具有极好的应用和推广价值。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等 同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范 围内。