一种提高野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率的方法

技术领域

本发明涉及一种野生稻与栽培稻远缘杂交育种的方法，特别是一种野生稻与 栽培稻杂交后，提高胚挽育种效率的方法，属于生物学技术育种领域。

背景技术

野生稻由于长期生长在各种逆境中通常具有许多优良遗传特性，是改良栽培 稻提高产量及其抗病虫害、抗干旱、抗寒冷、改善营养品种的优良遗传资源。一 般通过远缘杂交技术，把野生稻的优良遗传特性整合到栽培稻中，从而用于科学 研究及新品种的创制。

但野生稻基因组与栽培稻基因组差异较大，A基因组的栽培稻与BB，CC， BBCC，CCDD，EE，FF，GG，HHKK，HHJJ等9个基因组的野生稻种间杂交 后，往往不能正常结实，难以获得杂交种子，即使获得杂交种子，种子也中途夭 折，难以发芽成苗。要使杂交组合获得成功，需要通过胚挽救途径获得杂种后代。 杂种胚挽救培养技术作为组织培养的一个重要领域已有近百年的历史，杂交、胚 珠和杂交幼胚的离体培养，是目前克服受精后发育障碍的有效方法，在植物育种 工作中发挥着极为重要的作用。

现有的野栽远缘杂交种胚挽救技术虽有报道，如，迟全勃等，2005年报道的 《通过胚胎拯救将野生稻耐旱特性转移到栽培稻进行远缘杂交初探》；中国专利 “提高栽培稻与不同基因组型野生稻杂交幼胚成苗率的方法”(专利号 ZL2006101293081，授权公告号CN100566557，公开日2008年05月14日)；中国 专利“一种胚挽救和离体诱导相结合构建异源多倍体水稻的方法”(专利申请号 201210449736.8，公开号CN103155854A，公开日2013年06月19日)。相关报道 的胚挽救技术成苗率(31％-75％)相对传统方法(5％-50％)有所提高，并将胚 挽救技术与其他技术结合。但培育技术复杂、培养周期长。

所以，为了能最大限度的获得野生稻优良遗传特性，避免远缘杂种胚早衰， 使大量远缘杂交胚继续发育成正常种子，有效缩短野栽杂交后代的培育周期和提 高杂种成活率，尽快进入选育程序，整个野栽远缘杂交胚挽救技术需要许多改进 的地方。

发明内容

本发明目的是为解决栽培稻与野生稻远缘杂交过程中，杂交种不结实及胚挽 救过程中效率低的问题，提供一种能快速有效获得大量野栽远缘杂交种苗的新方 法。

本发明的技术方案是：

一种提高野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率的方法，包括以下步骤：

(1)幼胚消毒处理

野生稻与栽培稻授粉后9-11天，取杂交后的种子剥去颖壳后，将种子用体 积分数为65％酒精处理30秒，再用质量分数为0.2％的升汞溶液消毒处理10分 钟，然后用无菌水清洗6-7次，之后把种子放在灭菌吸水纸上于超净台上风干；

(2)幼胚接种培养

在超净台上，把种子上的胚乳刮除，保留完整的幼胚，把幼胚接种于装有胚 培养基的透明玻璃培养瓶中，将所述培养瓶置于温度为25℃、空气相对湿度为 70％、光照强度为4000Lx的光照恒温培养箱中培养，每天光照时间为12小时； 所述胚培养基为：改良MS+琼脂粉8g/L+蔗糖10g/L，pH5.8-6.0，所述改良MS 的配方由以下大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成：大量元素为：KNO₃1266mg/L，NH₄NO₃1100mg/L，KH₂PO₄170mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L， CaCl₂·2H₂O 440mg/L，微量元素为：KI 0.83mg/L，H₃BO₃6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 11.2mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，铁盐为：Na₂·EDTA 37.3mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，有机成分为：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L；

(3)组培苗炼苗

待幼胚形成三叶期的生根小苗后，从培养瓶中取出小苗用自来水冲洗去除琼 脂，放到试管中，加入自来水，自来水淹没小苗根部，进行炼苗处理，所述炼苗 处理是：试管口用透明保鲜膜封住，放入温度为25℃、空气相对湿度为70％、 光照强度为4000Lx的培养室中培养，每天光照时间为12小时，同时从炼苗处 理的第一天至第五天，每天用大头针在封口的保鲜膜膜上刺出10-15个小孔，第 六天将小苗移栽到盛有土壤的培养钵中，在温室或大棚中按常规温室水稻栽培进 行管理。

所述野生稻为景洪普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)，所述栽培稻为粳稻 02428。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、幼胚酒精消毒处理浓度和时间进行上不同于现有的方法。本发明缩短了 酒精消毒时间和降低了酒精浓度，这样便于保护幼胚不受伤害，为提高杂交种苗 成活率奠定了基础。

2、对培养基配方的改进。本发明通过大量试验，所使用的改良MS，主要 降低了现有MS培养基中的KNO₃、NH₄NO₃、KH₂PO₄和MnSO₄·4H₂O浓度，同 时不加CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B₆)和盐酸硫胺 素(维生素B₁)，更适宜幼胚的营养生长，并且由蔗糖适当提供一些C源，后期 主要靠其自身光合作用提供C源能量，而又避免传统的MS培养基的营养物质 浓度过高使苗徒长或者污染严重。

3、本发明在炼苗技术进行了创新。植株炼苗时，连续5天每天用大头针在 封口膜上刺出10-15个小孔，促使幼苗逐步适应外界环境，从而大大提高了幼苗 的成活率，其操作方便，效果好。

综上所述，本发明简化了胚挽救的操作，通过幼胚消毒处理、培养基和炼苗 技术的改进及适宜的培养条件、各步骤的协同作用，整个培育时间仅需30天， 大大缩短了培育周期；同时大幅度地提高了成苗率，使成苗率达到94％，产生了 显著的效果，提高了野生稻与栽培稻远缘杂交胚挽救育种效率。

具体实施方式

下面结合景洪普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)与粳稻02428的种间远 缘杂交具体实施实例，进一步阐述本发明的方法。各实施例中无特殊说明为常规 方法。

景洪普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)直接来源和原始来源于中国云南 省，原始来源时间和直接来源时间均为2006年4月(采集方式)。粳稻02428 为市售。

(1)幼胚消毒处理

在景洪普通野生稻与粳稻02428杂交授粉10天后，从母本粳稻02428上将 杂交小穗取下，共获得50粒种子。立即带回实验室，剥去颖壳经过30秒体积分 数为65％酒精处理，接着将种子放入质量分数为0.2％的升汞消毒处理10分钟， 然后用无菌水清洗6次，之后把种子放在灭菌吸水纸上于超净台上风干。

(2)幼胚接种培养

在超净台上，用镊子夹住种子，用手术刀片把50粒种子上的胚乳逐渐刮除， 保留完整的幼胚，把幼胚接种于装有胚培养基的高为10.5cm，直径为6.5cm的 透明玻璃培养瓶中，每1瓶放置1粒种子，置于温度为25℃、空气相对湿度为 70％、光照强度为4000Lx的光照恒温培养箱中培养，每天光照时间为12小时。 所述胚培养基为：改良MS+琼脂粉8g/L+蔗糖10g/L，PH5.8-6.0，所述改良MS 的配方见表1，培养基的配制方法依据常规方法配制。

(3)组培苗炼苗方法：

经过25天的培养后，获得47棵三叶期的生根小苗，然后进行炼苗。即将三叶 期的生根小苗从培养瓶中取出，自来水冲洗除去琼脂，放到直径为3cm，高为20cm 的大试管中，自来水仅淹没小苗根部，试管口用透明保鲜膜封住，放入温度为 25℃、空气相对湿度为70％、光照强度为4000Lx的培养室中培养，每天光照时间 为12小时，同时从炼苗的第一天至第五天，每天用大头针在封口膜上刺出10-15 个小孔，第六天将移栽到盛有土壤的培养钵中，并放置于温室中按常规水稻水肥 管理。

此实施例得到47苗F₁代，成苗率达到94％。经过田间种植，又进行了2次 回交和2次自交，目前得到了1000份后代株系，这些株系具有景洪普通野生稻 的部份遗传特性，是很好的种质创新材料，可以用于研究解析景洪普通野生稻的 优良性状和基因，也是用于培育水稻新品系、新品种的优良亲本材料。

表1 本发明所述改良MS的配方