金雀异黄酮防治根尖周病的新用途

技术领域

本发明属于根尖周病的防治技术领域，具体涉及金雀异黄酮防治根尖周病的新用途。

背景技术

根尖周病是口腔的常见病、多发病，主要病理特征是根尖周牙槽骨的破坏吸收。根尖周 病的主要致病因素来自根管内厌氧菌和兼性厌氧菌的感染，所以临床上多采用根管治疗以除 去根管内感染物质。近年来CT检测显示，约63％的患牙虽经过完善的根管治疗，其根尖周 骨破坏仍难痊愈，最后可能需要采取根尖切除或将患牙拔除。因此，寻找有效防治根尖周病 的潜在药物已成为根管治疗的重要辅助策略。

金雀异黄酮，又称染料木黄酮，其化学名为4’,5,7-三羟基异黄酮，是广泛存在于豆科植 物中的一类异黄酮类化合物，其结构与雌激素十分相似，除了能与破骨细胞上的雌激素受体 α结合直接发挥作用外，还可以影响相关细胞因子的产生、抑制炎症并调控破骨细胞的活性 与功能。有文献报道金雀异黄酮可抑制蛋白酪氨酸激酶，从而对哮喘豚鼠肺部炎症有预防作 用；并且，金雀异黄酮对二硝基氟苯诱发的小鼠变应性接触性皮炎有显著的抑制作用。同时， 金雀异黄酮可通过提升骨质疏松大鼠股骨骨小梁体积、厚度和密度，减少去势所导致骨量的 丢失。

金雀异黄酮以其突出的优点越来越受到人们的关注。目前，涉及到金雀异黄酮的报道有 防治骨质疏松，预防干眼症，治疗癌症和改善肥胖症等。但是，迄今为止，金雀异黄酮防治 根尖周病的应用没有被公开或使用。

发明内容

本发明的目的在于提供金雀异黄酮在防治根尖周病中的应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

金雀异黄酮可通过改善根尖周病灶骨质破坏，达到防治根尖周病的作用。

金雀异黄酮可通过减缓根尖周病灶炎症细胞浸润，达到防治根尖周病的作用。

金雀异黄酮可通过降低根尖周病灶核因子kappaB受体激活剂配体(Receptor activator of  nuclear factor kappaB ligand,RANKL)表达水平，达到防治根尖周病的作用。

金雀异黄酮可通过促进根尖周病灶骨保护素(Osteoprotegrin,OPG)表达，达到防治根尖 周病的作用。

金雀异黄酮的上述作用表明其可用于制备防治根尖周病的药物，具体为金雀异黄酮可用 于制备改善根尖周病灶骨质破坏、减缓根尖周病灶炎症细胞浸润、降低根尖周病灶RANKL 表达水平或促进根尖周病灶OPG表达的药物。

本发明的有益效果主要体现在：提供了金雀异黄酮用于防治根尖周病的新用途，该用途 表明金雀异黄酮可用于制备防治根尖周病的药物。金雀异黄酮为纯天然物质，用药较安全， 毒副作用小。

附图说明

图1是金雀异黄酮(25mg/kg)对开髓14天和28天导致小鼠下颌第一磨牙远中根根尖区 骨破坏的三维图。

图2是HE染色观察金雀异黄酮(25mg/kg)对开髓14天导致小鼠下颌第一磨牙远中根 根尖区骨破坏的干预效果图，A：HE荧光模式，14天模型对照组；B：HE荧光模式，14天 金雀异黄酮给药组；C：HE光学模式，14天模型对照组；D：HE光学模式，14天金雀异黄 酮给药组。

图3是HE染色观察金雀异黄酮(25mg/kg)对开髓28天导致小鼠下颌第一磨牙远中根 根尖区骨破坏的干预效果图，A：HE荧光模式，28天模型对照组；B：HE荧光模式，28天 金雀异黄酮给药组；C：HE光学模式，28天模型对照组；D：HE光学模式，28天金雀异黄 酮给药组。

图4是TRAP染色观察金雀异黄酮(25mg/kg)对开髓导致小鼠下颌第一磨牙远中根根尖 区破骨细胞的影响图，A：14天对照组；B：14天金雀异黄酮给药组；C：28天模型对照组； D：28天金雀异黄酮给药组，黑色箭头示为破骨细胞。

图5是免疫组织化学染色观察金雀异黄酮(25mg/kg)对开髓导致小鼠下颌第一磨牙远中 根根尖区RANKL表达的影响图，A：14天模型对照组；B：14天金雀异黄酮给药组；C：28 天模型对照组；D：28天金雀异黄酮给药组，黑色箭头示为RANKL阳性细胞。

图6是免疫组织化学染色观察金雀异黄酮(25mg/kg)对开髓导致小鼠下颌第一磨牙远中 根根尖区OPG表达的影响图，A：14天模型对照组；B：14天金雀异黄酮给药组；C：28天 模型对照组；D：28天金雀异黄酮给药组，黑色箭头示为OPG阳性细胞。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明，但不应理解为对本发明的限制。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本 发明的范围。

实施例1

1.实验动物及材料：

1.1 实验动物

所有的实验程序符合武汉大学口腔医学院伦理委员会的指导原则。SPF级6-8周C57BL 雄性小鼠(购于武汉大学动物实验中心，许可证号：SCXK(鄂)2008-0004)20只，体重20 克左右，分笼饲养，每笼5只。

1.2 实验材料

金雀异黄酮购置于Cayman公司(分子式C₁₅H₁₀O₅，分子量270.2，纯度≧98％)。参考 相关文献及药物说明书，于给药前一天将粉剂金雀异黄酮溶于DMSO(Biosharp公司)，母液 浓度30mg/mL，用PBS制备成药物工作浓度2.5mg/mL。

2.动物分组及小鼠根尖周病模型的建立：

2.1 动物分组

随机分成14天模型对照组、14天金雀异黄酮给药组、28天模型对照组、28天金雀异黄 酮给药组，每组5只。常规饲养、称体重并做标记。

2.1 小鼠根尖周病模型的建立

0.4％水合氯醛(0.1mL/10g)腹腔注射麻醉小鼠后，用1/4号球钻(瑞士登士柏公司)在 小鼠双侧下颌第一磨牙远中窝处开髓，开髓深度为0.5个球钻直径并能探及穿髓点；将髓腔 直接暴露于口腔环境，常规饲养14天或28天。

3.实验方法：

3.1 给药方案

金雀异黄酮给药组于模型建立后隔天腹腔注射金雀异黄酮(25mg/kg)；模型对照组进行 PBS腹腔注射处理。所有小鼠预定时间颈椎脱臼处死并分离下颌骨组织。

3.2 标本的采集和MicroCT扫描

分离的下颌骨用4％多聚甲醛4℃固定24h，每组取出5个下颌骨标本，0.5％的多聚甲醛 作为介质，进行MicroCT扫描。将载样管置于MicroCT扫描，扫描参数为：片层厚度15μm， 电压70千伏，电流114毫安，重建图像分辨率为1024×1024像素。

3.3 切片制备

分离的下颌骨用4％多聚甲醛4℃固定24h，所有标本流水冲洗24h后转入10％的乙二胺 四乙酸(EDTA)中，隔天换液，室温脱钙2-3周，以1mL注射器无阻力通过第三磨牙牙冠 为标准，终止脱钙。修整标本，保留下颌第一磨牙周围1-2mm组织。标本流水冲洗24h，50％、 60％、70％(可过夜)、80％、90％、95％Ⅰ(可过夜)、95％Ⅱ上行梯度酒精脱水，每个梯度 2h，正丁醇继续脱水透明3d。随后置入含正丁醇:石蜡(比例为1:1，v/v)的蜡缸中浸蜡3h， 再置入含纯低熔点石蜡的蜡缸中浸蜡3h，再用高熔点石蜡进行包埋，使下颌骨颊面朝下。行 4μm近远中向连续切片，展片后用表面黏附有多聚赖氨酸的载玻片捞片，倾斜控水后，将切 片编号装入烤片架，60℃烤箱烤片2-3h后取出常温保存。

3.4 HE染色

选取标本中部可明显显示下颌第一磨牙远中根根管、根尖孔的切片，放入染缸中。将染 缸放入60℃烤箱中烤片1h。在通风橱中快速将二甲苯Ⅰ倒入染缸脱蜡20min，换二甲苯Ⅱ脱 蜡15min。标本100％Ⅰ、100％Ⅱ、95％Ⅰ、95％Ⅱ、90％、80％、70％下行梯度酒精入水， 每个梯度2-3min，细水流自来水冲洗5min。苏木素染液染色1-2min，流水冲洗3min，PBS溶 液浸泡10min返蓝；伊红染液染色1-2min，流水冲洗3min。70％、80％、90％、95％Ⅰ、95％Ⅱ、 100％Ⅰ、100％Ⅱ上行梯度酒精脱水，每个梯度倒进倒出，放入通风橱中干燥。玻片放入二 甲苯中透明约15s后取出，滴加液态中性树胶，用合适长度的盖玻片封片，在通风橱的摊片 板上，待中性树胶凝固后即可镜下观察拍照。

3.5 抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色

选取标本中部可明显显示下颌第一磨牙远中根根管、根尖孔的切片，按3.4所述进行烤 片、脱蜡和下行梯度酒精入水。使用TRAP染色试剂盒(美国Sigma公司)进行TRAP染色。

按TRAP染色试剂盒说明书新鲜配制TRAP染液，EP管中依次加入5μL邻氨基偶氮甲 苯和5μL亚硝酸钠溶液，轻柔混匀30s，静置2min。加入提前预热至37℃的三蒸水450μL后， 分别依次加入萘酚AS-BI磷酸盐溶液5μL、醋酸溶液20μL、酒石酸溶液10μL，混匀避光备 用(除酒石酸溶液成分外，用上述配方配制空白孵育液，作为阴性对照)。滴加TRAP染液于 标本上，37℃避光孵育1h，流水冲洗5min。苏木素染液染色1-2min，流水冲洗3min。玻片 置PBS浸泡10min返蓝。将玻片于通风橱中避光晾干，二甲苯透明，中性树胶封片。玻片置 通风橱内过夜，光学显微镜下观察，阳性细胞胞质呈深红色/紫色，胞核呈蓝色；具有两个或 两个以上胞核的TRAP阳性细胞为破骨细胞。

3.6 免疫组织化学染色

选取标本中部可明显显示下颌第一磨牙远中根根管、根尖孔的切片，按3.4所述进行烤 片、脱蜡和下行梯度酒精入水。滴加0.4％胃蛋白酶抗原修复液，37℃湿盒孵育15-20min，PBS 浸洗3次，每次3min。滴加3％H₂O₂，37℃湿盒孵育20min以消除内源性过氧化物酶的活性， PBS浸洗3次，每次3min。滴加2.5％的BSA溶液37℃封闭30min。滴加用PBS稀释的羊来 源多克隆抗体RANKL抗体(1:200；美国Santa Cruz公司)或羊来源多克隆抗体OPG抗体 (1:200；美国Santa Cruz公司)，空白对照则只滴加PBS，4℃冰箱孵育过夜。取出切片37℃ 孵育30min，PBS浸洗3次，每次5min。免疫组织化学染色所用抗羊试剂盒及二甲基联苯胺 (Dimethylbenzidine，DAB)试剂盒，均购置于北京中杉金桥生物技术公司。分别滴加抗羊 试剂盒试剂1，37℃孵育15min，PBS浸洗3次，每次5min。分别滴加抗羊试剂盒试剂2，37℃ 孵育15min，PBS浸洗3次，每次5min。取850μL三蒸水，将DAB试剂盒中A、B、C试 剂各取50μL，混匀后避光置常温作为DAB工作液备用(每次显色前新鲜配制)。将上述DAB 工作液滴加至切片。显微镜下观察反应情况，当阳性着色明显而背景较淡时，洗去DAB溶液， 终止反应，流水冲洗5min。苏木素染液染色1-2min，流水冲洗3min。玻片置PBS浸泡10min 返蓝。玻片置70％、80％、90％、95％Ⅰ、95％Ⅱ、100％Ⅰ、100％Ⅱ酒精内上行梯度乙醇脱 水各30-60s。玻片置通风橱中干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。玻片置通风橱内过夜，光 学显微镜下观察，阳性细胞染成棕色。

4.观察指标：

4.1 小鼠根尖周骨破坏体积的变化情况

MicroCT扫描获取多重二维图像，然后利用计算机用VG STUDIO软件进行三维图像重 建并计算下颌第一磨牙远中根根尖区骨破坏体积，每个样本重复计算三次后取平均值。结果 见图1和表1。

4.2 小鼠根尖周组织病理形态的变化情况

HE染色后，观察小鼠根尖周组织的骨质破坏情况和炎症细胞浸润情况。TRAP染色后， 观察小鼠根尖周组织的破骨细胞数量和分布情况。在高倍视野下(400×)双盲法随机选取根 尖周牙槽骨区域内的5个视野对破骨细胞进行细胞计数，计算平均值。结果见图2-4和表1。

4.3 小鼠根尖周组织RANKL的表达情况

免疫组织化学染色后，观察小鼠根尖周组织的RANKL表达情况，在高倍视野下(400×) 双盲法随机选取根尖周牙槽骨区域内的5个视野对RANKL阳性细胞进行细胞计数，计算平 均值。结果见图5和表2。

4.4 小鼠根尖周组织OPG的表达情况

免疫组织化学染色后，观察小鼠根尖周组织的OPG表达情况，在高倍视野下(400×)双 盲法随机选取根尖周牙槽骨区域内的5个视野对OPG阳性细胞进行细胞计数，计算平均值。 结果见图6和表2。

5.结果：

5.1 小鼠根尖周骨破坏体积的变化情况

如图1和表1所示，14天，金雀异黄酮给药组(25mg/kg)与模型对照组相比，骨破坏 体积明显减少；28天，与模型对照组比，金雀异黄酮给药组(25mg/kg)骨破坏体积显著降 低。

5.2 小鼠根尖周组织病理形态的变化情况

如图2所示，开髓14天，模型对照组有较多的破骨细胞出现，骨吸收加重，属于急性炎 症阶段；开髓14天金雀异黄酮给药组与模型对照组相比，炎症细胞浸润和根尖周骨质破坏明 显减少。如图3所示，开髓28天，模型对照组炎症趋于稳定进入慢性期；开髓28天金雀异 黄酮给药组与模型对照组相比，炎症细胞浸润合根尖周骨质破坏显著降低。如图4和表1所 示，开髓14天、28天金雀异黄酮给药组分别与开髓14天、28天模型对照组相比，破骨细胞 数目显著降低。

表1.金雀异黄酮(25mg/kg)对开髓导致小鼠下颌第一磨牙远中根根尖区破骨细胞及骨破坏 体积的影响(±s，n＝5)

^▼，与14天模型对照组比较P<0.05；^△，与28天模型对照组比较P<0.05。

5.3小鼠根尖周组织RANKL的表达情况

如图5和表2所示，免疫组化结果表明，与开髓14天模型对照组相比，金雀异黄酮给药 组RANKL表达量显著降低；与开髓28天模型对照组相比，金雀异黄酮给药组RANKL表达 量相对较低，但无显著性差异。

5.4小鼠根尖周组织OPG的表达情况

如图6和表2所示，免疫组化结果表明，与开髓14天模型对照组相比，金雀异黄酮给药 组OPG表达量无显著性差异；与开髓28天模型对照组相比，金雀异黄酮给药组OPG表达量 显著升高。

表2.金雀异黄酮(25mg/kg)对开髓导致小鼠下颌第一磨牙远中根根尖区RANKL和OPG表 达的影响(±s，n＝5)

^▼，与28天模型对照组比较P<0.05；^△，与28天模型对照组比较P<0.05。

6.结论

金雀异黄酮可抑制开髓所导致的根尖周病灶局部炎症细胞浸润和骨质破坏；并通过降低 RANKL水平、升高OPG量，动态调节根尖周病灶局部RANKL/OPG比值，达到治疗根尖周 病的作用。表明金雀异黄酮在根尖周病的治疗方面将有良好的应用前景，可用于制备防治根 尖周病的药物。