法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-09-04
授权
授权
2015-10-07
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N5/071 申请日:20150702
实质审查的生效
2015-09-09
公开
公开
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一型硫氧还蛋白在内皮祖细胞的培 养中的应用及内皮祖细胞的培养方法。
背景技术
目前，构建组织工程化血管所用内皮种子细胞多是从成年动物或人体大 血管消化得到的成熟内皮细胞，这不仅造成新的机体创伤，而且该来源的内 皮细胞在体外培养过程中，细胞扩增量和细胞活性均不理想，很难达到预期 的效果。因此急需一种增殖能力和活性俱佳的血管内皮细胞来作为种子细胞。
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，是血管内皮细胞的前体 细胞，是CD34阳性细胞的一个亚群。1997年有文献报道在体外成功地将CD34 阳性细胞诱导成血管内皮细胞，说明在成人体内存在内皮祖细胞。后有多篇 报道证实，由EPCs分化而来的内皮细胞能够参与实体肿瘤血管化，心肌局 部缺血以及肢体局部缺血侧枝循环的建立。因此，EPCs有望成为血管组织工 程内皮种子细胞的一个新来源。
然而，现有技术对EPCs的培养效果大多不甚理想，普遍存在着一些问题 导致EPCs无法再体外稳定的增殖，例如：增殖天数有限(通常在12天内)、 传代次数有限(通常在P6代以内)、增殖倍数不高(通常在50倍以下)、容 易老化(细胞培养时间越长，细胞表面标志物CD34+、VEGFR-2(也可写成 CD309)+表达就越低)；同时批间差较大，不同人来源的标本培养出的内皮 祖细胞数量差异较大，无法稳定生产；上述这些问题都导致了EPCs无法稳定 的生产，进而导致无法在临床上很好的应用EPCs。
导致EPCs增殖效果不佳的问题主要在于培养液的配方，传统配方中为了 维持EPCs的活性通常需要加入胎牛血清，然而异源血清的加入提高了人体发 生排异反应的风险，并且，异源血清虽然营养丰富，但是对细胞活性的维持 效果其实十分有限，无法达到临床对EPCs培养效果的需求。
硫氧还蛋白是一类在细胞内具有氧化还原活性的酸性小分子蛋白质，具 有抗氧化并促进血管生成的作用，但其在体外的活性尚未得到证实。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一型硫氧还蛋白在内皮祖 细胞的培养中的应用及内皮祖细胞的培养方法，本发明通过实验证明，一型 硫氧还蛋白的加入能够提高EPCs的增殖倍数，延长细胞培养的时间，延缓 EPCs的衰老，且成本较低。
本发明提供了一型硫氧还蛋白在延缓内皮祖细胞衰老、提高内皮祖细胞 增殖效率中的应用。
硫氧还蛋白是细胞内可溶性、对热稳定、具有氧还原活性的酸性小分子 蛋白质，一型硫氧还蛋白位于细胞浆和细胞核中，包含108个氨基酸残基。 现有技术表明，一型硫氧还蛋白在多种刺激特别是氧化应激条件下可诱导表 达，提示一型硫氧还蛋白是细胞抵抗氧化应激的重要分子，能够保护组织或 细胞免受多种刺激的损伤。且一型硫氧还蛋白在炎性病变组织中高表达、具 有抗氧化、抗凋亡、类趋化因子细胞因子活性，能够调节基因表达，保护再 灌注损伤、调节蛋白质的亚硝基化。
本发明提供的实验证实，在培养液中添加一型硫氧还蛋白培养EPCs，细 胞传代7代仍保持旺盛的生长和良好的活力，传代7代细胞增殖1686倍，细 胞传代10代，表面标志物CD309的表达量为98％，干细胞特性保持良好。 以上实验结果说明，一型硫氧还蛋白能够提高EPCs的增殖倍数，延长细胞培 养的时间，延缓EPCs的衰老。
本发明还提供了一种内皮祖细胞培养液，包括基础培养液、人类转化因 子、干细胞生长因子、丙酮酸钠、胰岛素、牛血清白蛋白、碱性成纤维生长 因子、血管内皮生长因子和一型硫氧还蛋白。
在本发明的实施例中，基础培养液为DMEM/F12培养液。
在本发明的实施例中，人类转化因子、干细胞生长因子、胰岛素、牛血 清白蛋白、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和一型硫氧还蛋白的质 量比为15：15：15000：40000：20：20：(10～40)。
在一些实施例中，人类转化因子、干细胞生长因子、胰岛素、牛血清白 蛋白、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和一型硫氧还蛋白的质量比 为15：15：15000：40000：20：20：40。
在一些实施例中，一型硫氧还蛋白的浓度为10ng/mL～40ng/mL。
优选的，一型硫氧还蛋白的浓度为40ng/mL
在一些实施例中，丙酮酸钠的浓度为20μmol/mL。
人类转化因子(TGF-β)是一多功能蛋白质，能够影响细胞生长、分化、 凋亡及免疫调节。干细胞生长因子(Stem Cell Growth Factors)为一种具有刺 激自体内源性干细胞生长的高效蛋白质、酶组合，也是体外培养干细胞必不 可少的各种细胞生长因子的组合，富含表皮生长因子(EGF)、纤维细胞生长 因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、脑源性神经 营养因子(BDNF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、 转化生长因子(TGF)等多重有效成分。胰岛素能够促进细胞生长，提高细胞 对葡萄糖的利用率。牛血清白蛋白在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可 起到生理和机械保护作用和载体作用。碱性成纤维生长因子(bFGF)在体内具 有潜在的促血管生成活性。血管内皮生长因子(VEGF)由多数肿瘤细胞、伤口 中角质细胞和巨噬细胞产生，其受体仅表达于血管内皮细胞表面，能增加血 管通透性,促进血管内皮细胞增殖，促进血管形成。丙酮酸钠可以作为细胞培 养中的替代碳源。本发明在基础培养液中添加上述生长因子，从而对内皮祖 细胞的生长起到良好的促进作用。维持了内皮祖细胞良好的生长活力和干细 胞特性。
本发明还提供了一种内皮祖细胞的培养方法，包括：以本发明提供的培 养液将单个核细胞悬浮至密度为1×104个/mL～9×104个/mL，培养24h后， 去除培养液及未贴壁细胞，以本发明提供的培养液培养至细胞70％～90％融合， 传代。
在本发明的实施例中，单个核细胞的制备方法为：将脐带血或骨髓经ficoll 淋巴细胞分离液分离后以PBS缓冲液清洗，制得单个核细胞。
在本发明的实施例中，传代的次数为10次。
层黏连蛋白包被能够促进细胞贴壁。
在本发明的实施例中，培养采用经层黏连蛋白包被的容器，层黏连蛋白 包被的浓度为10μg/mL。
在本发明的实施例中，培养的温度为37℃，条件为5％CO2。
本发明提供了一型硫氧还蛋白在延缓内皮祖细胞衰老、提高内皮祖细胞 增殖效率中的应用。并提供的培养内皮祖细胞的培养液和培养方法。本发明 在基础培养液中添加多种生长因子并添加一型硫氧还蛋白，从而对内皮祖细 胞的生长起到良好的促进作用。维持了内皮祖细胞良好的生长活力和干细胞 特性。本发明提供的实验证实，在培养液中添加一型硫氧还蛋白培养EPCs， 细胞传代7代仍保持旺盛的生长和良好的活力，传代7代细胞增殖1686倍， 细胞传代10代，表面标志物CD309的表达量为98％，干细胞特性保持良好。 以上实验结果说明，一型硫氧还蛋白能够提高EPCs的增殖倍数，延长细胞培 养的时间，延缓EPCs的衰老。
附图说明
图1-a示以培养液1培养的内皮祖细胞的增殖曲线；
图1-b示以培养液5培养的内皮祖细胞的增殖曲线；
图1-c示以培养液7培养的内皮祖细胞的增殖曲线；
图2-a示以培养液5培养的内皮祖细胞P6代流式细胞检测结果；
图2-b示以培养液5培养的内皮祖细胞P10代流式细胞检测结果；
图2-c示以培养液7培养的内皮祖细胞P6代流式细胞检测结果；
图2-d示以培养液7培养的内皮祖细胞P10代流式细胞检测结果。
具体实施方式
本发明提供了培养内皮祖细胞的培养液及培养方法，本领域技术人员可 以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的 替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发 明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能 在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变 更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
用10μg/mL的层粘连蛋白对T25培养瓶进行包被待用。
取脐带血或者骨髓20mL，用Ficoll淋巴细胞分离液分离出其中的单个核 细胞。用PBS将分离出的单个核细胞清洗2遍，使用表1所示培养液将单个 核细胞配成1×104～9×104/mL密度的细胞悬液，然后加到已经包被过的T25培 养瓶中，每个培养瓶的培养体积为5mL，在5％CO2、37℃培养箱中培养24 小时后去除培养液以及未贴壁的细胞，更换5mL新的培养液(各培养瓶皆采 用其对应的培养液)；待细胞生长到融合度达80％的时候，倒去培养基并用含 0.04v/v％EDTA的浓度为0.25v/v％的胰蛋白酶消化细胞1～2分钟，使其脱落， 然后用各自培养基按照加入胰酶体积的5倍终止消化；离心后去除上清液， 将沉淀细胞用本发明培养基重悬，按照1×104个/mL～9×104个/mL的密度加入 培养瓶中，标记为P1代细胞。重复传代至P10代。
表1培养基
采用表1提供的培养基培养分离得到的内皮祖细胞，传代至P10，记录各 培养基培养细胞的增殖情况，结果如表2。
表2细胞增殖情况
注：--示生长曲线呈下降趋势，停止培养
其中，对培养基1(图1-a)、培养基5(图1-b)和培养基7(图1-c)培 养的细胞增殖情况绘制增殖曲线，可见，以培养基5培养的细胞在传代7代 后仍处于对数期，而以培养基1和培养基7培养的细胞在第7代时生长曲线 就已经无法继续维持对数增殖，并且每一代的细胞数也远不如添加培养基5 培养的细胞。
采用流式细胞术对各培养基培养的细胞进行检测，以内皮祖细胞表面标 志物CD34和CD309为检测抗体，检测结果如表3所示。
表3流式细胞检测结果
其中，对培养基5(P6代细胞检测如图2-a；P10代细胞检测如图2-b) 和培养基7(P6代细胞检测如图2-c；P10代细胞检测如图2-d)培养的细胞 的P6代及P10代流式细胞检测结果如图2-a和图2-d所示。结果显示，以本 发明提供的培养基培养内皮祖细胞传代10次仍能够维持良好的干细胞特性， 而采用现有常用培养基7培养的干细胞在传代6代后已出现严重的分化趋势， 传代10代后失去干细胞特性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
机译： 培养源自人脐带血的内皮祖细胞的方法和用于预防或治疗包含源自人脐带血的内皮祖细胞的局部缺血性疾病的组合物
机译： 培养人脐带血来源的内皮祖细胞的方法和预防或治疗包含人脐带血来源的内皮祖细胞的缺血性疾病的组合物
机译： 培养和保持纯净或富集的哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞的培养方法，这些细胞容易分化为体外低聚体内皮细胞
